蓖麻細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究

康薇++鄭進

摘要：生長在大冶市銅綠山礦區(qū)的野生蓖麻（Ricinus communis L.）是一種新發(fā)現(xiàn)的銅超富集植物。為了建立穩(wěn)定、快速生長的蓖麻懸浮細胞系，以便篩選重金屬抗性蓖麻細胞和培育超富集植株，以前期誘導的蓖麻胚性愈傷組織為材料，通過正交試驗設(shè)計，優(yōu)化懸浮細胞系的培養(yǎng)條件，建立蓖麻細胞懸浮系，并在優(yōu)化條件下測定細胞的生長曲線和培養(yǎng)液pH變化。結(jié)果表明，

關(guān)鍵詞：蓖麻（Ricinus communis L.）；胚性愈傷組織；正交試驗設(shè)計；懸浮細胞系

中圖分類號：S565.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）04-0932-04

The Cell Suspension Culture of Ricinus communis L.

KANG Wei1，ZHENG Jin1，2

（1.Hubei Polytechnic of University，Huangshi 435003， Hubei，China；2.Hubei Key Laboratory of Mine Environmental Pollution Control &Remediation，Huangshi 435003， Hubei，China）

Abstract： Ricinus communis was a new hyperaccumulator growing on Tonglushan copper mine in Daye city. A stable and rapid growth cell suspension culture line of R. communis was established to screen heavy-resistance cell and accumulate plants using embyrogenic cellus with orthogonal experimental design. The results showed that the optimal culturing conditions were MS medium with 0.5 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 50 mg/L sucrose + 350 mg/L casein hydrolyzate and 2.0 g（FW）/50 mL inoculation quantity，culture temperature （26±2）℃，drak culture，110 r/min. The best growth rate of the cells were 4.58 g/（50 mL·14 d） and 0.49 g/（50 mL·16 d） under the optimal conditions， respectively. The growing curves of R. communis suspension cell shaped by “S” nearly. The cultutring period was 16 d with the rapid growth phase from 6 to 14 d. The pH trend of culture liquid was declined first and then increased to stable gradually during a culturing period.

Key words： Ricinus communis L.； embyrogenic cellus； orthogonal experimental design； suspension cell line

蓖麻（Ricinus communis L.）屬于大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬（Ricinus），在我國各地均有分布，是一種常見的特種油料作物，經(jīng)濟價值較高[1]。近年來，蓖麻在植物修復重金屬污染環(huán)境方面的作用引起人們的關(guān)注。研究報道在液體培養(yǎng)和盆栽條件下，蓖麻幼苗對水體和土壤銅的吸收都達到超富集水平[2，3]；蓖麻在重度鋅污染的土壤中仍然生長較好，表現(xiàn)出較強的耐受性[4，5]；蓖麻葉片可吸收大氣中的二氧化硫、二氧化碳，通過種植蓖麻可以減輕大氣污染[6]。筆者前期研究證實，在大冶市銅綠山礦區(qū)自然散生的野生蓖麻，不僅對土壤銅污染具有較強的耐受性，而且體內(nèi)能夠富集較多的銅，具有銅超積累植物的特征，在修復銅污染土壤中具有較大的潛力[7，8]。但是，由于長期處在重金屬污染嚴重的土壤環(huán)境下，與栽培蓖麻的農(nóng)藝性狀相比，這些礦山蓖麻大多株形偏小，結(jié)實率低，子粒較小，制約了蓖麻在植物修復工程中的應(yīng)用，需要通過遺傳改良加以克服。目前，生物技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用十分廣泛，通過生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種的結(jié)合，不僅克服了傳統(tǒng)雜交育種周期較長、效率較低的不足，而且大大提高了育種效率，成為農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新的重要戰(zhàn)略[9]。本研究以前期誘導的蓖麻胚性愈傷組織為材料，采用細胞懸浮培養(yǎng)法建立蓖麻懸浮細胞系，為篩選重金屬抗性蓖麻細胞和培育超富集植株提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用蓖麻胚性愈傷組織由湖北理工學院生物工程實驗室用蓖麻種胚誘導培養(yǎng)獲得[10]。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

1.3 試驗設(shè)計方案

采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化懸浮細胞培養(yǎng)條件，因素與水平見表1。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，用150 mL三角瓶懸浮培養(yǎng)蓖麻細胞，每瓶50 mL液體培養(yǎng)基，接種2.0 g 愈傷組織，每隔7 d繼代1次，連續(xù)繼代7～10次，即可獲得懸浮細胞。前3次繼代時，棄去上清液的1/2并補充等量的新鮮培養(yǎng)基，之后繼代時，將培養(yǎng)物搖勻并稍靜置后，取10 mL培養(yǎng)物接種繼代。

1.4 懸浮細胞生長曲線和pH的測定

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)

2.3 細胞懸浮培養(yǎng)的生長曲線

2.4 培養(yǎng)液pH的變化

由圖7可知，在細胞懸浮培養(yǎng)的前6 d，pH由起始的5.80下降到4.35，從第七天開始，pH逐漸升高，培養(yǎng)至第18天，pH上升至5.76，之后，基本維持在這個水平?？梢姡吐榧毎麘腋∨囵B(yǎng)過程中，培養(yǎng)液pH表現(xiàn)為先降低后升高，然后趨于穩(wěn)定，這可能與培養(yǎng)基化學成分的消耗和培養(yǎng)細胞分泌的酸性或堿性物質(zhì)有關(guān)[12]。

3 小結(jié)與討論

參考文獻：

[1] 嚴興初.蓖麻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[2] 渠榮遴，李德森，杜榮騫，等.水體重金屬污染的植物修復研究（Ⅳ）[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2003，22（2）：167-169.

[3] 張 威，馬汐平，尚德隆，等.苗期植物對土壤中重金屬吸附的研究[J].遼寧大學學報（自然科學版），2004，31（2）：180-183.

[4] 譚貴娥，何池全，陸曉怡.外源微生物強化蓖麻對鉛的吸收與積累研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2008，27（1）：82-85.

[5] 陸曉怡，何池全.蓖麻對重金屬Cd的耐性與吸收積累研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2005，24（4）：674-677.

[6] 董 鉆， 沈秀瑛. 作物栽培學總論[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 2000.

[7] 鄭 進，康 薇.湖北銅綠山古銅礦野生蓖麻重金屬含量研究[J].黃石理工學院學報，2009，25（1）：36-40.

[8] 康 薇，鄭 進.蓖麻——一種新的銅超積累植物[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（3）：1449-1451，1466.

[9] 楊二波，李龍朋，王帥溥，等.生物育種的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].河南農(nóng)業(yè)，2012，7（1）：6-7.

[10] 金 勇，鄭 進，康 薇，等.蓖麻愈傷組織的誘導及其耐銅性研究[A].中國土壤學會.《面向未來的土壤科學（中冊）——中國土壤學會第十二次會員代表大會暨第九屆海峽兩岸土壤肥料學術(shù)交流研討會論文集》[C].成都：電子科技大學出版社，2012.

[11] 杜榮騫.生物統(tǒng)計學[M].第二版.北京：高等教育出版社，2003.

[12] 周曉鹿，李思良.皂質(zhì)蘆薈細胞懸浮培養(yǎng)初探[J].北方園藝，2008（2）：188-192.

1.4 懸浮細胞生長曲線和pH的測定

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)

2.3 細胞懸浮培養(yǎng)的生長曲線

2.4 培養(yǎng)液pH的變化

由圖7可知，在細胞懸浮培養(yǎng)的前6 d，pH由起始的5.80下降到4.35，從第七天開始，pH逐漸升高，培養(yǎng)至第18天，pH上升至5.76，之后，基本維持在這個水平。可見，蓖麻細胞懸浮培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液pH表現(xiàn)為先降低后升高，然后趨于穩(wěn)定，這可能與培養(yǎng)基化學成分的消耗和培養(yǎng)細胞分泌的酸性或堿性物質(zhì)有關(guān)[12]。

3 小結(jié)與討論

參考文獻：

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1.4 懸浮細胞生長曲線和pH的測定

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)

2.3 細胞懸浮培養(yǎng)的生長曲線

2.4 培養(yǎng)液pH的變化

由圖7可知，在細胞懸浮培養(yǎng)的前6 d，pH由起始的5.80下降到4.35，從第七天開始，pH逐漸升高，培養(yǎng)至第18天，pH上升至5.76，之后，基本維持在這個水平?？梢姡吐榧毎麘腋∨囵B(yǎng)過程中，培養(yǎng)液pH表現(xiàn)為先降低后升高，然后趨于穩(wěn)定，這可能與培養(yǎng)基化學成分的消耗和培養(yǎng)細胞分泌的酸性或堿性物質(zhì)有關(guān)[12]。

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[8] 康 薇，鄭 進.蓖麻——一種新的銅超積累植物[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（3）：1449-1451，1466.

[9] 楊二波，李龍朋，王帥溥，等.生物育種的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].河南農(nóng)業(yè)，2012，7（1）：6-7.

[10] 金 勇，鄭 進，康 薇，等.蓖麻愈傷組織的誘導及其耐銅性研究[A].中國土壤學會.《面向未來的土壤科學（中冊）——中國土壤學會第十二次會員代表大會暨第九屆海峽兩岸土壤肥料學術(shù)交流研討會論文集》[C].成都：電子科技大學出版社，2012.

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[12] 周曉鹿，李思良.皂質(zhì)蘆薈細胞懸浮培養(yǎng)初探[J].北方園藝，2008（2）：188-192.