一種珍稀野生真菌鑒定及生理指標(biāo)測(cè)定

趙爽等

摘要：以一株野生大型真菌的子實(shí)體的基因組DNA為模板進(jìn)行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的PCR擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明菌絲純培養(yǎng)物來源于該子實(shí)體，該真菌屬于乳菇屬（Lactarius），GenBank登錄號(hào)為KC703008，系統(tǒng)發(fā)育分析表明了該菌在屬內(nèi)的遺傳地位。對(duì)該菌株的生理指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明該菌子實(shí)體中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水溶性多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，存在蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，具有深入研究的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：野生真菌；乳菇屬（Lactarius）；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）；蛋白酶；磷酸酶；漆酶

中圖分類號(hào)：Q939.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）04-0826-04

Identification of a Wild Fungus and Detections of Its Physiological Index

ZHAO Shuang1，2，3，XU Feng1，2，3，LIU Yu1，2，3，YANG Qiong1，MA Kang1，CHEN Jie1

（1.Institute of Plant and Environment Protection，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science，Beijing 100097，China；

2. Beijing Engineering Research Center for Edible Mushroom，Beijing 100097，China；

3. Key Laboratory of Urban Agriculture （North），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China）

Abstract： Genomic DNA of a wild fungus was extracted from its fruiting body，and used as the template for the ITS genes PCR. The phylogenetic analysis based on the gene sequence of ITS was conducted to confirm the genetic position of this fungi. The results showed that the gene sequences of ITS from mycelium and fruiting body were the same. Phylogenetic analysis proved that the fungi was belonged to the genus Lactarius. GenBank accession number is KC703008. The physiological index of the fungus，including the mass ratios of protein and hydrophilic polysaccharide， activities of proteinase， phosphatase and laccase were detected. It was found that the mass ratios of protein and hydrophilic polysaccharide in fruiting bodies were low， but the fungus had the activities of proteinase， phosphatase and laccase. The in-depth study of this fungus is worthwhile.

Key words： wild fungus； Lactarius； internal transcribed spacer（ITS）； proteinase； phosphatase； laccase

中國(guó)是世界生物多樣性豐富的國(guó)家之一，也是氣象和生態(tài)環(huán)境多樣的國(guó)家，蘊(yùn)藏著豐富的真菌種質(zhì)資源，分布著全世界已知真菌（70 000種）的1/7的種類，其中野生食藥用菌大約有1 200多種，為中國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展提供了必需的生物資源基礎(chǔ)。近年來，隨著野生資源的日漸減少，生物資源保護(hù)和綜合利用成為社會(huì)關(guān)注的重點(diǎn)領(lǐng)域，因此，野生食用菌種質(zhì)資源的開發(fā)利用發(fā)展成為當(dāng)前食用菌學(xué)科的研究熱點(diǎn)之一。

乳菇屬（Lactarius）是隸屬于擔(dān)子菌門、層菌綱、傘菌目、紅菇科的真菌，多數(shù)是植物外生菌根菌，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，但大多數(shù)分布于溫帶地區(qū)。目前，全世界該屬已知約400種真菌，其中被描述的有150多種[1]。由于本屬的品種多為與植物根系共生，脫離共生樹種的根系時(shí)，菌絲培養(yǎng)以及子實(shí)體形成都存在很大的難度，目前都還不能人工馴化栽培[2]。近幾年的研究主要集中在對(duì)松乳菇、紅汁乳菇等品種的菌絲馴化、菌絲營(yíng)養(yǎng)生理、發(fā)酵條件和工藝等方面的研究[3-5]，以及利用菌絲體代替子實(shí)體完成生理功效的研究及應(yīng)用[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)，乳菇屬中某些真菌富含多種氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、礦物質(zhì)元素、微量元素、灰分、多糖、核酸、維生素等，具有抗病毒、抗腫瘤、抗突變、抗衰老、抗氧化、降血脂的作用，是十分理想的食品與保健品[1，8，9]。

對(duì)從湖南省瀘溪叢樹林采集的一株野生菌通過內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列進(jìn)行鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育分析，從而對(duì)該野生菌株的遺傳地位進(jìn)行解析，并測(cè)定了該子實(shí)體的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水溶性多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，為該野生菌的開發(fā)利用打下了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 供試材料

供試材料收集于湖南省瀘溪叢樹林，采集后經(jīng)過自然風(fēng)干處理，待用。

1.2 試劑

二喹啉甲酸BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于北京博邁德科技發(fā)展有限公司。酪蛋白和4-硝基苯基磷酸二鈉（PNPP）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。2，2′-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）購(gòu)于美國(guó)Amresco公司。DNeasy植物試劑盒購(gòu)自德國(guó)凱杰（Qiagen）公司。Ex Taq聚合酶、dNTP等分子生物學(xué)試劑均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。苯酚、濃硫酸、乙醇、氯化鈉（NaCl）、氫氧化鈉（NaOH）、乙酸鈉、乙酸、葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4等化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司。

1.3 儀器

5418R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、5331梯度PCR儀和移液器購(gòu)自Eppendorf公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，電泳儀DYY-Ⅲ-12B購(gòu)自北京六一儀器廠，MSC-Advantage 1.2生物安全柜購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，M200全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)TECAN公司，AR2140型精密天平購(gòu)自美國(guó)奧豪斯公司，UV9100系列紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自北京萊伯泰科儀器有限公司，水浴鍋購(gòu)自北京精科華瑞儀器有限公司，TGL-16G飛鴿牌離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.4 培養(yǎng)基

2 方法

2.1 鑒定

2.1.1 DNA的提取和ITS PCR擴(kuò)增 子實(shí)體標(biāo)本的表面用少量75%的乙醇擦拭，直接取菌蓋部位的少量菌塊于1.5 mL的離心管中，加入少量液氮，無菌研磨至粉末狀。然后用DNeasy植物試劑盒進(jìn)行DNA的提取。提取的基因組DNA經(jīng)去離子水稀釋10、100倍后，作為PCR反應(yīng)的模板，以ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3′）和ITS4（5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，58 ℃、1 min，72 ℃、30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min；降至4 ℃結(jié)束。取7～8 μL PCR樣品凝膠電泳20 min，EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察提取DNA的質(zhì)量并照相記錄。

2.1.2 ITS序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR產(chǎn)物先切膠回收后委托中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司測(cè)序。將菌株的ITS基因序列提交到GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)并與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的相關(guān)序列進(jìn)行比較，并用MEGA5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所得序列通過BLAST程序與GenBank中的ITS基因序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA5.05軟件包中的Kimura2-parameter法計(jì)算遺傳距離，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)抽樣1 000次分析系統(tǒng)樹各分支的置信度。

2.2 生理指標(biāo)測(cè)定

2.2.1 粗蛋白或酶液樣品的制備 稱取干品子實(shí)體加入去離子水泡發(fā)4 h后，吸干子實(shí)體表面的水分，取菌蓋組織0.1 g，加入1 mL去離子水，研磨至組織破碎后， 12 000 r/min 離心10 min，取上清，即為粗蛋白或酶液樣品。

2.2.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 利用標(biāo)準(zhǔn)樣品牛血清白蛋白（BSA）配制成25、50、100、200、300、400 μg/mL的溶液，采用二喹啉甲酸BCA蛋白定量試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同樣品的蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂尯蟛捎枚姿酈CA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2.3 蛋白酶活性的測(cè)定 用0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸緩沖溶液將酪蛋白配制成10 g/L的溶液作為酶反應(yīng)的底物，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱內(nèi)待用。取粗酶液20 μL加入140 μL底物，在37 ℃反應(yīng)15 min，加入540 μL 50 g/L三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)，以 12 000 r/min離心5 min，取上清在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)量吸光度。以水浴前加入50 g/L TCA終止反應(yīng)樣品作為對(duì)照。酶活力單位定義為：37 ℃下每分鐘每毫升反應(yīng)體系在280 nm處產(chǎn)生0.001個(gè)吸光度所需的酶量。

2.2.4 磷酸酶活性的測(cè)定 用去離子水將PNPP配制成濃度為0.018 mol/L的溶液作為反應(yīng)底物，避光儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱內(nèi)待用。取粗酶液25 μL加入275 μL去離子水，加入0.3 mL 0.1 mol/L pH 5.0的醋酸鈉緩沖溶液，再加入30 μL PNPP底物，在37 ℃反應(yīng)15 min，加入300 μL 0.5 mol/L NaOH終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度，以去離子水代替酶液進(jìn)行反應(yīng)作為對(duì)照。酶活力單位定義為：37 ℃時(shí)每分鐘每毫克酶水解底物的微摩爾數(shù)。

2.2.5 漆酶活性的測(cè)定 取10 mg ABTS加入150 μL乙酸，用去離子水定容到30 mL，所得溶液作為反應(yīng)底物，避光儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱內(nèi)待用。取粗酶液10 μL加入190 μL上述底物，在37 ℃反應(yīng)5 min后，立即在波長(zhǎng)400 nm處測(cè)量吸光度，以去離子水代替酶液進(jìn)行反應(yīng)作為對(duì)照。酶活力單位定義為：37 ℃時(shí)每分鐘每毫升反應(yīng)體系在400 nm處產(chǎn)生1個(gè)吸光度所需要的酶量。

2.2.6 水溶性多糖含量的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取子實(shí)體適量，加入4倍質(zhì)量的去離子水打碎浸提過夜，在4 ℃以7 000 r/min離心20 min，取下層不溶物加入4倍質(zhì)量的去離子水，于90 ℃水浴抽提3 h，稍冷卻后收集提取液，加入4倍體積的無水乙醇沉淀多糖12 h，離心收集沉淀后于80 ℃烘箱中烘至恒重，稱取一定質(zhì)量的樣品制成不同濃度的樣品溶液，采用苯酚-硫酸法測(cè)定水溶性多糖的含量。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌種鑒定結(jié)果

3.1.1 ITS PCR擴(kuò)增結(jié)果 以10、100倍稀釋的基因組DNA為模板，選用ITS5和ITS4為引物，均能擴(kuò)增出比較明亮的條帶，結(jié)果如圖1所示，所得產(chǎn)物片段大小在500、800 bp之間，與預(yù)期結(jié)果相一致。

3.1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 在NCBI網(wǎng)站上（http：// blast.ncbi.nlm.nih. gov/ Blast.cgi？ PROGRAM =blastn & BLAST_PROGRAMS =megaBlast & PAGE_TYPE= BlastSearch & SHOW_DEFAULTS =on&LINK_LOC=blasthome）用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，選取相似性較高的菌株，在MEGA5.05軟件中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及遺傳距離的計(jì)算，以Russula xerampelina voucher AM3GB25H2菌株作為外群菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，該分離菌株與Lactarius deterrimus isolate UP514、L. hatsudake isolate sp 159、L. quieticolor voucher UE10.09.2004-1、L. semisanguifluus isolate 339菌株的遺傳關(guān)系最近，遺傳距離均為100%（圖2）。因此將該子實(shí)體定名為L(zhǎng)actarius sp. JZBHM001。

3.2 生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

JZBHM001的各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見表1。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JZBHM001干品子實(shí)體蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水溶性多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)都較低，分別約為0.70%和0.38%，但是從該子實(shí)體干品中檢測(cè)到了蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，活性分別為491.67 U/mg、40.12 U/mg和15.04 U/mg。

4 小結(jié)與討論

研究通過ITS PCR擴(kuò)增法鑒定了一株野生真菌為JZBHM001，該真菌屬于Lactarius屬，GenBank登錄號(hào)為KC703008，系統(tǒng)發(fā)育分析表明了該菌在屬內(nèi)的遺傳地位。通過研究其生理特性發(fā)現(xiàn)其具有蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，可以作為潛在開發(fā)的一種資源。

野生的生物資源為生物資源的有效利用及開發(fā)打下了基礎(chǔ)，因此對(duì)野生大型真菌種質(zhì)資源的開發(fā)利用是當(dāng)前科研工作的重點(diǎn)。分子生物學(xué)的快速發(fā)展為野生大型真菌的鑒定提供了便捷而又準(zhǔn)確的方法。其中，18 S、5.8 S和28 S的序列在進(jìn)化中趨于保守，種間變化小，而rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）同時(shí)具有多變區(qū)和保守區(qū)，ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，最終不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小、進(jìn)化速度快、種間差異大，且變異速度存在著較大的差異，適合種及種以下水平的分類研究[10]。作者曾利用ITS序列對(duì)蘑菇屬的野生大型真菌及其分離物進(jìn)行了分子鑒定，證明了該方法的可靠性[11，12]。

蛋白酶、磷酸酶和漆酶是食用菌中常見的幾種生物酶類，在工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都具有一定的應(yīng)用前景，同時(shí)這些酶類在催化代謝、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和生物降解方面都能發(fā)揮重要的作用。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該野生菌各項(xiàng)生理指標(biāo)與之前農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在北京周邊采集的野生食用菌黃傘、血紅鉚釘菇、短柄粘蓋牛肝菌和馬勃相比較，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水溶性多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差較大，但是蛋白酶和漆酶活性高于上述4個(gè)品種，磷酸酶活性高于黃傘和血紅鉚釘菇[13]。因此從應(yīng)用的角度分析，JZBHM001具有人工馴化的價(jià)值，馴化后針對(duì)漆酶活性可以展開發(fā)酵工藝的研究，擴(kuò)大該菌的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)：

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3 結(jié)果與分析

3.1 菌種鑒定結(jié)果

3.1.1 ITS PCR擴(kuò)增結(jié)果 以10、100倍稀釋的基因組DNA為模板，選用ITS5和ITS4為引物，均能擴(kuò)增出比較明亮的條帶，結(jié)果如圖1所示，所得產(chǎn)物片段大小在500、800 bp之間，與預(yù)期結(jié)果相一致。

3.1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 在NCBI網(wǎng)站上（http：// blast.ncbi.nlm.nih. gov/ Blast.cgi？ PROGRAM =blastn & BLAST_PROGRAMS =megaBlast & PAGE_TYPE= BlastSearch & SHOW_DEFAULTS =on&LINK_LOC=blasthome）用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，選取相似性較高的菌株，在MEGA5.05軟件中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及遺傳距離的計(jì)算，以Russula xerampelina voucher AM3GB25H2菌株作為外群菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，該分離菌株與Lactarius deterrimus isolate UP514、L. hatsudake isolate sp 159、L. quieticolor voucher UE10.09.2004-1、L. semisanguifluus isolate 339菌株的遺傳關(guān)系最近，遺傳距離均為100%（圖2）。因此將該子實(shí)體定名為L(zhǎng)actarius sp. JZBHM001。

3.2 生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

JZBHM001的各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見表1。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JZBHM001干品子實(shí)體蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水溶性多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)都較低，分別約為0.70%和0.38%，但是從該子實(shí)體干品中檢測(cè)到了蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，活性分別為491.67 U/mg、40.12 U/mg和15.04 U/mg。

4 小結(jié)與討論

研究通過ITS PCR擴(kuò)增法鑒定了一株野生真菌為JZBHM001，該真菌屬于Lactarius屬，GenBank登錄號(hào)為KC703008，系統(tǒng)發(fā)育分析表明了該菌在屬內(nèi)的遺傳地位。通過研究其生理特性發(fā)現(xiàn)其具有蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，可以作為潛在開發(fā)的一種資源。

野生的生物資源為生物資源的有效利用及開發(fā)打下了基礎(chǔ)，因此對(duì)野生大型真菌種質(zhì)資源的開發(fā)利用是當(dāng)前科研工作的重點(diǎn)。分子生物學(xué)的快速發(fā)展為野生大型真菌的鑒定提供了便捷而又準(zhǔn)確的方法。其中，18 S、5.8 S和28 S的序列在進(jìn)化中趨于保守，種間變化小，而rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）同時(shí)具有多變區(qū)和保守區(qū)，ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，最終不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小、進(jìn)化速度快、種間差異大，且變異速度存在著較大的差異，適合種及種以下水平的分類研究[10]。作者曾利用ITS序列對(duì)蘑菇屬的野生大型真菌及其分離物進(jìn)行了分子鑒定，證明了該方法的可靠性[11，12]。

蛋白酶、磷酸酶和漆酶是食用菌中常見的幾種生物酶類，在工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都具有一定的應(yīng)用前景，同時(shí)這些酶類在催化代謝、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和生物降解方面都能發(fā)揮重要的作用。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該野生菌各項(xiàng)生理指標(biāo)與之前農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在北京周邊采集的野生食用菌黃傘、血紅鉚釘菇、短柄粘蓋牛肝菌和馬勃相比較，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水溶性多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差較大，但是蛋白酶和漆酶活性高于上述4個(gè)品種，磷酸酶活性高于黃傘和血紅鉚釘菇[13]。因此從應(yīng)用的角度分析，JZBHM001具有人工馴化的價(jià)值，馴化后針對(duì)漆酶活性可以展開發(fā)酵工藝的研究，擴(kuò)大該菌的應(yīng)用潛力。

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3 結(jié)果與分析

3.1 菌種鑒定結(jié)果

3.1.1 ITS PCR擴(kuò)增結(jié)果 以10、100倍稀釋的基因組DNA為模板，選用ITS5和ITS4為引物，均能擴(kuò)增出比較明亮的條帶，結(jié)果如圖1所示，所得產(chǎn)物片段大小在500、800 bp之間，與預(yù)期結(jié)果相一致。

3.1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 在NCBI網(wǎng)站上（http：// blast.ncbi.nlm.nih. gov/ Blast.cgi？ PROGRAM =blastn & BLAST_PROGRAMS =megaBlast & PAGE_TYPE= BlastSearch & SHOW_DEFAULTS =on&LINK_LOC=blasthome）用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，選取相似性較高的菌株，在MEGA5.05軟件中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及遺傳距離的計(jì)算，以Russula xerampelina voucher AM3GB25H2菌株作為外群菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，該分離菌株與Lactarius deterrimus isolate UP514、L. hatsudake isolate sp 159、L. quieticolor voucher UE10.09.2004-1、L. semisanguifluus isolate 339菌株的遺傳關(guān)系最近，遺傳距離均為100%（圖2）。因此將該子實(shí)體定名為L(zhǎng)actarius sp. JZBHM001。

3.2 生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

JZBHM001的各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見表1。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JZBHM001干品子實(shí)體蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水溶性多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)都較低，分別約為0.70%和0.38%，但是從該子實(shí)體干品中檢測(cè)到了蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，活性分別為491.67 U/mg、40.12 U/mg和15.04 U/mg。

4 小結(jié)與討論

研究通過ITS PCR擴(kuò)增法鑒定了一株野生真菌為JZBHM001，該真菌屬于Lactarius屬，GenBank登錄號(hào)為KC703008，系統(tǒng)發(fā)育分析表明了該菌在屬內(nèi)的遺傳地位。通過研究其生理特性發(fā)現(xiàn)其具有蛋白酶、磷酸酶和漆酶的活性，可以作為潛在開發(fā)的一種資源。

野生的生物資源為生物資源的有效利用及開發(fā)打下了基礎(chǔ)，因此對(duì)野生大型真菌種質(zhì)資源的開發(fā)利用是當(dāng)前科研工作的重點(diǎn)。分子生物學(xué)的快速發(fā)展為野生大型真菌的鑒定提供了便捷而又準(zhǔn)確的方法。其中，18 S、5.8 S和28 S的序列在進(jìn)化中趨于保守，種間變化小，而rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）同時(shí)具有多變區(qū)和保守區(qū)，ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，最終不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小、進(jìn)化速度快、種間差異大，且變異速度存在著較大的差異，適合種及種以下水平的分類研究[10]。作者曾利用ITS序列對(duì)蘑菇屬的野生大型真菌及其分離物進(jìn)行了分子鑒定，證明了該方法的可靠性[11，12]。

蛋白酶、磷酸酶和漆酶是食用菌中常見的幾種生物酶類，在工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都具有一定的應(yīng)用前景，同時(shí)這些酶類在催化代謝、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和生物降解方面都能發(fā)揮重要的作用。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該野生菌各項(xiàng)生理指標(biāo)與之前農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在北京周邊采集的野生食用菌黃傘、血紅鉚釘菇、短柄粘蓋牛肝菌和馬勃相比較，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水溶性多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差較大，但是蛋白酶和漆酶活性高于上述4個(gè)品種，磷酸酶活性高于黃傘和血紅鉚釘菇[13]。因此從應(yīng)用的角度分析，JZBHM001具有人工馴化的價(jià)值，馴化后針對(duì)漆酶活性可以展開發(fā)酵工藝的研究，擴(kuò)大該菌的應(yīng)用潛力。

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