羅田板栗玫瑰紅栗實(shí)內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定

李琳玲等

摘要：為了探明羅田板栗新品系玫瑰紅耐貯藏的內(nèi)在原因，評價(jià)其栗實(shí)中的內(nèi)生細(xì)菌資源，用組織分離培養(yǎng)法從栗實(shí)中分離其內(nèi)生細(xì)菌，并通過比對結(jié)構(gòu)、生理生化特征及16S rDNA序列分析等方法對所分離的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果從玫瑰紅板栗栗實(shí)中分離得到2株內(nèi)生細(xì)菌FR1和FR2，經(jīng)鑒定為水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

關(guān)鍵詞：羅田板栗；玫瑰紅；內(nèi)生細(xì)菌；分離鑒定；16S rDNA

中圖分類號：S664.2；Q948.122.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）04-0806-03

Isolation and Identification of the Endophytic Bacteria from Castanea mollissima ‘Meiguihong of Luotian County

LI Lin-ling，HUA Juan，CHENG Hua，LIAO Zhi-qin，WANG Yu-ping，YUAN Hong-hui，CHENG Shui-yuan

（Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources of Hubei Key Laboratories， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： In order to explore the storage tolerance mechanism of Castanea mollissima Blume. ‘Meiguihong， a new variety of chestnut from Luotian， and the resources of endophytic bacteria were evaulated from its chestnut. Two kinds of pathogenic bacterium， FR1 and FR2， were isolated from the decayed seeds of Chinese chestnut. These two strains were preliminarily identified as Rahnella aquatilis and Bacillus licheniformis by comparing structure， characteristics of biochemistry and physiology， sequence of 16S rDNA.

Key words： chestnut of Luotian； Meiguihong； endophytic bacteria； isolation and identification； 16S rDNA

板栗（Castanea mollissima Blume）俗稱栗子，營養(yǎng)豐富，風(fēng)味較佳，是重要的干果品種，中國板栗的栽培面積和總產(chǎn)量均居世界首位。板栗對山區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和出口創(chuàng)匯具有重要意義。但由于其含水量高的特點(diǎn)，貯藏期易發(fā)生栗實(shí)腐爛，腐爛率甚至可高達(dá)50%，嚴(yán)重制約了板栗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。栗實(shí)腐爛的發(fā)生機(jī)理及綠色防治逐漸成為研究熱點(diǎn)[2-5]。

內(nèi)生菌（Endophyte）是指在生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部，且被感染的宿主植物（至少是暫時(shí)）不表現(xiàn)出外在病癥的真菌或細(xì)菌[6]。這些內(nèi)生菌對宿主植物的生長發(fā)育、抗逆性、抗蟲性及抗病性方面均有重要作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、化工制藥、衛(wèi)生保健等方面有巨大的潛力[6，7]。研究者已在棉花、玉米、甜菜、煙草和黃瓜等多種作物體內(nèi)分離篩選到具有防病或誘導(dǎo)抗病的內(nèi)生真菌和細(xì)菌[6-10]，但關(guān)于板栗栗實(shí)內(nèi)生細(xì)菌資源的研究鮮見報(bào)道。試驗(yàn)以新培育的耐貯藏南方板栗——羅田板栗新品系玫瑰紅栗實(shí)為研究對象，采用組織分離法分離，并利用16S rDNA序列分析和形態(tài)、生理生化相結(jié)合的方法鑒定其內(nèi)生細(xì)菌，以期為篩選抗栗實(shí)腐爛的拮抗細(xì)菌及開發(fā)生防保鮮劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 板栗果實(shí) 板栗品系為玫瑰紅，采摘于湖北省羅田縣勝利鎮(zhèn)，去苞殼后得到栗實(shí)。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 7.2。

1.1.3 主要試劑 克隆載體pMD18-T購自TAKARA公司；2×Taq mix、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000購自寶生物工程（大連）有限公司，大腸桿菌TOP10菌株為經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌16S rDNA通用引物27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′由上海生工生物工程有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 栗實(shí)處理 將栗實(shí)在自來水下流水沖洗后，用75%的乙醇浸泡3 min，再用8%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水清洗5～7次，用無菌吸水紙吸干水分。取清洗最后一遍的無菌水0.2 mL涂布于LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)3 d，據(jù)此驗(yàn)證所用消毒方法是否能殺死供試材料表面全部細(xì)菌[11]。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌分離純化 在無菌環(huán)境中，用無菌小刀將處理好的栗實(shí)切開并去殼，在種仁中心區(qū)和邊緣區(qū)處切取邊長為2～5 mm的正方體組織塊，置于經(jīng)消毒滅菌的研缽中，加無菌水適量，研磨，靜置15 min，取研磨后的上清液稀釋成500倍和1 000倍的組織稀釋液，取200 μL涂布于LB培養(yǎng)基上，于37 ℃倒置恒溫培養(yǎng)1～2 d，從LB平板上將具有不同菌落形態(tài)特征的內(nèi)生細(xì)菌單菌落挑出，劃線純化培養(yǎng)，獲得的細(xì)菌單株進(jìn)行編號、轉(zhuǎn)管，4 ℃冰箱保存。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌初步鑒定 將分離的內(nèi)生細(xì)菌適當(dāng)稀釋后接種到LB培養(yǎng)基上，置于36 ℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)1～2 d，觀察菌株形態(tài)和培養(yǎng)性狀，進(jìn)行革蘭氏染色和生理生化試驗(yàn)，對照文獻(xiàn)[12]和文獻(xiàn)[13]進(jìn)行初步鑒定。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌分子學(xué)鑒定 將分離純化的板栗內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行活化，挑取少量菌體以細(xì)菌16S rDNA通用引物27F、1 492R進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系50 μL，18 μL無菌ddH2O，25 μL 2×Taq mix，1.5 μL Primer1，1.5 μL Primer2，4 μL懸浮菌液；PCR流程：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，35次循環(huán)；延伸補(bǔ)齊72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過純化后連接到克隆載體pMD18-T上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10（CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞），然后將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TOP10涂布在加有100 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h；從上述LB平板上隨機(jī)挑取5個(gè)白色菌落，轉(zhuǎn)移到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜，將通過PCR重組子驗(yàn)證的菌落送交上海生工生物工程有限公司雙向測序，測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），選取同源性高的16S rDNA序列作為參比對象，使用ClustalX進(jìn)行DNA序列的排序，采用MEGA 5.1軟件中的鄰接法（Neighbour-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000次的自展檢驗(yàn)（Bootstrap），將ME樹上與之最接近的種類確定為內(nèi)生菌可能的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 栗實(shí)內(nèi)生細(xì)菌初步鑒定情況

從羅田板栗玫瑰紅栗實(shí)中共分離出2株內(nèi)生細(xì)菌，分別編號為FR1和FR2。其中，細(xì)菌FR1菌落圓形、邊緣齊整、表面濕潤，菌落不透明，呈灰白色，菌體桿狀，革蘭氏染色為陰性（圖1A）；能產(chǎn)生精氨酸水解酶（圖1B）；甲基紅反應(yīng)為陽性（圖1C）；氧化酶試驗(yàn)陽性（圖1D）；不具有明膠酶，不能水解明膠（圖1E）；能分解葡萄糖，乙酰甲基甲醇反應(yīng)為陽性，產(chǎn)生紅色化合物（圖1F）；可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，出現(xiàn)緋紅色陽性反應(yīng)（圖1G），但沒有氮?dú)夥懦?；能產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色化合物（圖1H），初步鑒定FR1為拉恩氏菌屬（Rahnella sp.）。

內(nèi)生細(xì)菌FR2菌落扁平、邊緣不整齊、白色、表面粗糙皺褶，菌落直徑2～3 mm，菌體呈桿狀、單生，革蘭氏陽性菌（圖2A），產(chǎn)生游離橢圓形芽孢（圖2B），初步鑒定FR2為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

2.2 栗實(shí)內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列分析結(jié)果

利用16S rDNA通用引物27F和1 492R從分離得到的2株內(nèi)生細(xì)菌的基因組中擴(kuò)增出的DNA片段長度為1 000～2 000 bp（圖3），擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化進(jìn)行DNA測序，結(jié)果表明FR1、FR2的序列長度分別為1 400、1 038 bp。序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，將FR1、FR2菌株的16S rDNA序列與GenBank中的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，與FR1同源性最高的菌為拉恩氏菌屬，與FR2同源性最高的是芽孢桿菌屬。將FR1、FR2序列與數(shù)據(jù)庫中同源性較高的幾個(gè)菌株進(jìn)行比較，并用ClustalX進(jìn)行多序列比對、用MEGA 5.1軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)的進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果表明FR1的16S rDNA序列與細(xì)菌Rahnella aquatilis KC351183.1的序列同源性高達(dá)97%，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，F(xiàn)R1與Rahnella aquatilis KC351183.1聚為一簇，該結(jié)果支持初步鑒定的結(jié)果。綜合FR1的形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA的序列分析結(jié)果，將FR1鑒定為水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）；從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出FR2與Bacillus licheniformis EU221362.1聚為一分支，F(xiàn)R2的16S rDNA序列與Bacillus licheniformis EU221362.1的序列同源性高達(dá)98%，該結(jié)果支持初步鑒定結(jié)果，綜合FR2的形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA的序列分析結(jié)果，將FR2鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

3 小結(jié)與討論

板栗儲藏過程中發(fā)生腐爛是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中，致病菌的侵染是其主要原因。本研究從羅田板栗玫瑰紅中分離到2株菌株，通過生理生化特征初步鑒定為拉恩氏菌屬（Rahnella sp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），結(jié)合其16S rDNA的序列分析結(jié)果，將2株菌株分別鑒定為水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

有資料顯示，拉恩氏菌屬屬于腸桿菌科，廣泛分布于水、土壤、植物根際及蝸牛體內(nèi)，偶爾能在食品、種子和臨床微生物樣本（傷口、腸胃病患者糞便、敗血癥患者體內(nèi)）中發(fā)現(xiàn)；但目前尚未能明確其致病性。有研究認(rèn)為，某些拉恩氏菌屬菌株具有抑菌性，能夠作為植物病害生防菌[14]。芽孢桿菌屬在自然界分布非常廣，生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢種群之一。其中，地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌中較具有應(yīng)用潛力的菌種之一，在醫(yī)藥、飼料加工、農(nóng)藥等行業(yè)取得了較多的研究成果[15，16]。這2株菌株在板栗果實(shí)中的具體作用還有待進(jìn)一步研究。

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