水皰性口炎病毒熒光R T-PC R 鑒別檢測方法的建立與應(yīng)用

臧京帥，高志強(qiáng)，王麗萍，郭金玉，傅 毅，牛建蕊，劉文曉，張樂萃，張鶴曉

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島266109 ；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽100026；3.北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，北京 懷柔101400）

水皰性口炎（Vesicular stomatitis，VS）是由水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）引起的動物病毒性傳染病，VSV 可感染馬及其他多種動物，其中馬的易感性最強(qiáng)。其臨床特征為短期發(fā)熱，口腔黏膜、乳頭上皮、蹄冠部出現(xiàn)丘疹和水皰。VSV 有2 個血清型，即印第安納型（VSVIND）和新澤西型（VSV-NJ）。VS-NJ 主要發(fā)生在美洲，法國和南非曾有該病的報道[1]，VSV-IND 在巴西和阿根廷呈周期性發(fā)生。水皰性口炎是目前我國重點(diǎn)防范的外來疫病之一。隨著我國與國外的動物及動物產(chǎn)品貿(mào)易增長，VS 傳播的風(fēng)險不可忽視，建立可靠的檢測技術(shù)對嚴(yán)防該病的傳播意義重大。

水皰性口炎常規(guī)診斷方法主要包括病毒分離和血清學(xué)方法。病毒分離需進(jìn)行細(xì)胞接毒培養(yǎng)，不僅耗時費(fèi)力，且野毒常常難于在體外培養(yǎng)細(xì)胞中增殖[2]。由于國內(nèi)缺乏水皰性口炎病毒標(biāo)準(zhǔn)血清等診斷試劑，血清學(xué)方法的建立和應(yīng)用，由于國內(nèi)水泡性口炎病毒標(biāo)準(zhǔn)血清等診斷試劑的缺乏而受到限制，同時，血清學(xué)方法檢測抗體不利于感染早期快速診斷。常規(guī)RT-PCR 方法檢測VSV 并鑒別血清型的研究已有報道[2-3]，但基于凝膠電泳的RT-PCR，需要在擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳分析，易污染。

序列分析表明，VSV 兩個血清型的L 基因存在差異，可以用來鑒別分型。本研究針對L 基因設(shè)計1對通用引物，理論上可以擴(kuò)增所有VSV-NJ 和VSVIND 病毒核酸，然后針對VSV-NJ 和VSV-IND 分別設(shè)計TaqMan 探針，用于兩個血清型病毒核酸的分型鑒別。方法建立后，應(yīng)用兩個血清型的病毒核酸以及其他一些馬病病原核酸對方法進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示，建立的方法特異性良好，對兩個型病毒核酸的分型檢測中未見交叉反應(yīng)，初步表明，建立的方法可用于VSV 的快速分型檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞 VSV-IND 核酸，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院提供；VSV-NJ，美國NVSL 提供；東部馬腦脊髓炎病毒ssp. North American variant 株核酸，西部馬腦脊髓炎病毒McMillan 株核酸，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；馬動脈炎病毒CVL Bucyrus 核酸，由美國NVSL 提供。馬皰疹病毒1 型核酸，馬流感病毒H3N8 核酸，口蹄疫病毒核酸，VERO 細(xì)胞均由本實(shí)驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 TRIZol，購自Invitrogen公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA 聚合酶、RNA 酶抑制劑、dNTP、DL-2 000 Marker 等，購自Promega 公司。

主要儀器有熒光定量PCR 儀（Roche LightCyclerⅡ），臺式冷凍高速離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5417R）。

1.3 病毒半數(shù)感染量（TCID50）的滴定 將兩血清型病毒參照邵振華等[5]的方法，計算TCID50，按Reed Muench 方法計算TCID50/50 μL。

1.4 引物探針設(shè)計 對GenBank 中登錄的兩個型的VSV 病毒株序列進(jìn)行多重比對后，選擇L 基因進(jìn)行引物探針設(shè)計，利用Oligo6.71 設(shè)計1 對通用引物和分別針對兩型病毒的MGB 探針，引物探針序列見表1。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品制備與初步定值 使用通用引物VSV1和VSV2擴(kuò)增水皰性口炎病毒印第安納型（VSVIND）和新澤西（VSV-NJ）的基因片段（與熒光定量RT-PCR 擴(kuò)增區(qū)域相同），引物序列見表1，將擴(kuò)增片段純化回收后分別克隆于pMD20-T 載體中，命名為VSV-IND-L 和VSV-NJ-L，轉(zhuǎn)化Top10 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落經(jīng)菌落PCR 鑒定為陽性單菌落后，用3～5 mL 液體LB 培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒線性化后，用RiboM-AXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)無RNase 的Dnase 消化除去其中的DNA 模板后，75 ℃10 min 將DNase 滅活，再次抽提純化制備出所需cRNA，分別按照20 μL/管分裝，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 VS V 熒光R T-PC R 檢測分型引物探針序列

取制備的cRNA 作1∶100 稀釋，測定其260 nm和280 nm 的吸光度值（A260 和A280）并計算拷貝數(shù)，用75% TRIZol 水溶液（TRIZol:水=3∶1）稀釋至1.0×108拷貝數(shù)/mL。然后進(jìn)行分裝，1.0 mL/管。

1.6 熒光RT-PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.6.1 引物和探針濃度的優(yōu)化 將引物濃度以0.1 μM 為間距從0.1 μM 至0.8 μM 遞增，探針濃度以0.025 μM 為間距從0.025 μM 至0.2 μM 遞增。將不同濃度配比的引物和探針進(jìn)行比較。

1.6.2 Mg2+濃度的優(yōu)化 應(yīng)用篩選好的引物探針，將Mg2+的濃度以0.5 mM 為間距從1.5 mM 至6.0 mM 遞增。并將調(diào)整后不同濃度Mg2+擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較。

1.6.3 其他條件的優(yōu)化 引物探針及Mg2+的濃度篩選好后，對Taq DNA 聚合酶用量，反應(yīng)參數(shù)和循環(huán)數(shù)等條件做進(jìn)一步的優(yōu)化。

1.7 靈敏度試驗 將已知TCID50的兩血清型病毒分別進(jìn)行10 倍梯度稀釋，提取RNA 用建立的方法進(jìn)行熒光RT-PCR 測定；將已知拷貝數(shù)的兩血清型RNA 作系列稀釋，用建立的檢測方法進(jìn)行熒光RT-PCR 測定，分別確定其檢測極限。

1.8 特異性試驗 用所建立的方法對VSV-NJ，VSV-IND，東部馬腦脊髓炎病毒核酸，西部馬腦脊髓炎病毒核酸，馬動脈炎病毒核酸，馬流感病毒H3N8 核酸，馬皰疹病毒1 型核酸，口蹄疫病毒核酸進(jìn)行檢測，以及30 份已知陰性樣品的呼吸道拭子進(jìn)行檢測，以驗證該方法的特異性。

1.9 重復(fù)性試驗 對3 份不同TCID50的病毒核酸用所建立的檢測方法分別檢測3 次，根據(jù)其各自的CT 值求出變異系數(shù)，以驗證該方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

1.10 臨床送檢樣品的檢測 用上述建立的方法和文獻(xiàn)報道的普通RT-PCR 方法對所采集的257份馬血樣品和85 份牛OP 液樣品進(jìn)行檢測，驗證方法的臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 TCID50測定結(jié)果 參考邵振華等[4]的方法，測得VSV-IND 的TCID50為10-6.2/50 μL，VSV-NJ 的TCID50為10-3.65/50 μL。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)多次試驗優(yōu)化最終建立如下體系，見表2。

2.3 熒光定量RT-PCR 反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化 經(jīng)多次重復(fù)性試驗，我們發(fā)現(xiàn)該檢測方法的最適循環(huán)參數(shù)為42 ℃30 min，92 ℃3 min，92 ℃15 s，55 ℃25 s，65 ℃30 s，42 ℃2 min，40 個循環(huán)，60 ℃時收集熒光。

表2 VS V-IND 和VS V-NJ 檢測分型反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

2.4 靈敏度試驗 將已知TCID50的兩血清型的病毒分別進(jìn)行10 倍系列稀釋，提取RNA，用建立的方法進(jìn)行檢測，IND 型水皰性口炎熒光定量RT-PCR 檢測方法結(jié)果顯示，檢測極限可達(dá)0.158 TCID50。NJ 型水皰性口炎熒光定量RT-PCR 檢測方法結(jié)果顯示，檢測極限可達(dá)0.0045 TCID50。

圖1 為IND 型水皰性口炎病毒RNA（TCID50=10-6.2/50 μL）的熒光RT-PCR 結(jié)果。圖2 為NJ 型水皰性口炎病毒RNA（TCID50=10-3.65/50 μL）的熒光RT-PCR 結(jié)果。

圖1 IND 型水皰性口炎病毒R NA 的熒光R T-PC R 結(jié)果

圖2 NJ 型水皰性口炎病毒R NA 的熒光R T-PC R 結(jié)果

采用建立的方法分別對106～101拷貝數(shù)VSVIND cRNA 和VSV-NJ cRNA進(jìn)行熒光RT-PCR 檢測，確定靈敏度。結(jié)果顯示，本方法的分析靈敏度對于VSV-IND 以及VSV-NJ 均可達(dá)10 拷貝/反應(yīng)。見圖3。

圖3 VS V-IND 和VS V-NJ cR NA 熒光R T-PC R 檢測極限測定

2.5 特異性試驗 利用本試驗所建立的熒光定量RT-PCR 檢測方法對1.1 所列的病毒核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，建立的方法能很好鑒別VSVIND 和VSV-NJ，但不能檢出其他病原和已知陰性的樣品。表明所建立的檢測方法特異性好。

2.6 重復(fù)性試驗 對不同濃度TCID50兩血清型的病毒核酸用所建立的檢測方法重復(fù)檢測3 次的結(jié)果如表3，對通用檢測方法不同試驗獲得的Ct 值標(biāo)準(zhǔn)差分別位于0.34～0.54（IND）、0.19～0.29（NJ），變異系數(shù)分別為2.4%～2.8%（IND）、0.9%～1.4%（NJ）；證實(shí)所建立的方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可以滿足檢測的需要。見表3。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.7 臨床樣品檢測結(jié)果 用所建立的方法對257份進(jìn)出口馬血樣品和85 份牛OP 液進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示均為VSV 陰性，并與文獻(xiàn)報道的RTPCR 方法進(jìn)行了比較，二者符合率100%。結(jié)果見表4。

表4 臨床樣品檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

熒光定量RT-PCR 是近幾年一種新型的核酸定性、定量技術(shù)，極大地簡化了定量檢測過程，而且真正地實(shí)現(xiàn)了絕對定量。其自動化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、結(jié)果清晰，是目前病毒、細(xì)菌檢測技術(shù)發(fā)展的一個新領(lǐng)域。本研究在鑒別水皰性口炎病毒印第安納型和新澤西型時，針對L 基因（編碼病毒聚合酶）設(shè)計一對通用引物，可同時擴(kuò)增這2 個型的病毒核酸，然后使用TaqMan 探針鑒別這2 個型的毒株。本研究對兩個血清型檢測所用探針標(biāo)記的熒光發(fā)光基團(tuán)相同，采用兩步法進(jìn)行鑒別檢測，下一步將對兩種血清型的探針分別標(biāo)記不同熒光發(fā)光基團(tuán)，這樣可以一步鑒別兩種血清型病毒，達(dá)到快速、簡便、經(jīng)濟(jì)的目的，這也是本研究設(shè)計通用引物的原因所在。運(yùn)用建立的方法，所需的檢測時間包括處理樣品、PCR 擴(kuò)增反應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析可在3 h 左右完成，試驗結(jié)果表明，本方法的靈敏度可達(dá)10 拷貝/反應(yīng)，與已報道的熒光探針RT-PCR 檢測方法相當(dāng)。

通用引物是利用不同核酸序列之間存在的高度保守區(qū)來設(shè)計的。本試驗針對VSV 兩血清型L基因的保守區(qū)域設(shè)計的通用引物與普通的引物相比可以簡便、快捷的同時擴(kuò)增出VSV 兩血清型的目的片段。

由TCID50測定結(jié)果和熒光RT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線對比可得，VSV-NJ 型毒株TCID50值較低，但熒光RT-PCR 檢測病毒含量并不低，分析可能是NJ 型毒株與IND 型毒株相比對VERO 細(xì)胞致病力較低，雖然病毒增殖明顯，但病理反應(yīng)不明顯。

此外，通過特異性、敏感性、重復(fù)性試驗證明了該方法有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性，利用建立的熒光定量RT-PCR 方法檢測臨床樣品342 份，結(jié)果均為陰性。與已知其他方法檢測結(jié)果一致，表明本方法檢測結(jié)果可信程度高，為VSV 的分型鑒別檢測以及防治奠定了重要的基礎(chǔ)。

[1] Office International des Epizooties（OIE）.Vesicular Stomatitis[A].Manual of diagnostic tests and vacciners for terrestrial animals，Chapter 2.1.2[EB].http://www.oie.int.

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