糖尿病大鼠心肌對(duì)缺血再灌注損傷耐受性研究

摘要：目的 探討在體糖尿病大鼠心肌對(duì)缺血再灌注損傷（IRI）的耐受性。方法 單次腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）制備糖尿病大鼠模型，取非糖尿病大鼠及糖尿病大鼠各12只，適應(yīng)性飼養(yǎng)4w后隨機(jī)分為非糖尿病假手術(shù)組（N-Sham組）、非糖尿病缺血再灌注組（N-IR組）、糖尿病假手術(shù)組（D-Sham組）、糖尿病缺血再灌注組（D-IR組）。連續(xù)監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)左室收縮壓（LVSP）及左室舒張末壓（LVEDP），比色法測(cè)血漿肌酸激酶（CK）活性，電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，N-IR組與D-IR組均出現(xiàn)LVSP下降，LVEDP升高，CK活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，與N-IR組比較，D-IR組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），線粒體結(jié)構(gòu)損傷未見明顯改善及惡化。結(jié)論 4w糖尿病大鼠心肌對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性與非糖尿病大鼠比較無明顯差異。

關(guān)鍵詞：心肌保護(hù)；糖尿??；缺血再灌注損傷

缺血性心臟病近年來發(fā)病率不斷上升，已成為導(dǎo)致人類死亡的主要原因。早期使閉塞的冠脈恢復(fù)灌注是挽救瀕臨壞死的心肌的主要治療方法，但不得不面對(duì)另一個(gè)難題～缺血再灌注損傷（ischemia and reperfusion injury，IRI）。糖尿病被認(rèn)為是急性心臟缺血事件的獨(dú)立高危因素[1]，同樣也是心血管意外及冠脈重建手術(shù)預(yù)后不良的重要危險(xiǎn)因素[2]。目前糖尿病患心臟對(duì)IRI的耐受性尚有爭(zhēng)議。本研究通過復(fù)制在體糖尿病大鼠心肌缺血再灌注模型，比較觀察左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、血漿肌酸激酶（creatinekinase，CK）活性及線粒體超微結(jié)構(gòu)，研究糖尿病大鼠心肌對(duì)IRI的耐受性。

1 資料與方法

1.1主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma公司）；肌酸激酶（CK）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；HX-300S小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；透射電鏡FEI（美國(guó)）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠（由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重250～300g。實(shí)驗(yàn)操作過程嚴(yán)格遵循有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)規(guī)定。

1.3方法

1.3.1糖尿病模型的制備 所有大鼠禁食12h，腹腔注射2%STZ（以PH 4.2、0.1mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解），60mg/Kg單次性腹腔注射[3]，72h后取尾靜脈血連續(xù)監(jiān)測(cè)空腹血糖，血糖>16.7mmol/L，并出現(xiàn)糖尿病\"三多一少\"癥狀（多飲、多食、多尿、體重減輕）視為造模成功，非糖尿病大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖液作為對(duì)照，后不限飲水，普通鼠糧自由進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)4w。

1.3.2心肌I/R模型制備 大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉成功后仰臥位固定，監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化，腹腔注射肝素500U/Kg，氣管切開，小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣，PE-50導(dǎo)管經(jīng)右頸總動(dòng)脈逆行插入左心室（插管成功可見動(dòng)脈波形變?yōu)榛€為零的正弦波形），接壓力換能器監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)。沿胸骨左緣打開胸腔，暴露心臟，在左心耳根部與肺動(dòng)脈圓錐間下方約2mm處進(jìn)針穿線，在線環(huán)內(nèi)放置3mm長(zhǎng)的硅膠管，6/0線結(jié)扎并將線結(jié)系在硅膠管表面，結(jié)扎冠脈左前降支（left anterior descending coronary artery， LAD），缺血30min，剪開線結(jié)再灌注120min。常規(guī)心電圖監(jiān)測(cè)心肌缺血變化，以結(jié)扎后ST段抬高（或心電圖QRS波突然增高、增寬或T波高聳），心肌紫紺，松扎后ST段下降1/3以上，心外膜充血者為合格模型。

1.3.3實(shí)驗(yàn)分組 取非糖尿病及糖尿病大鼠各12只，隨機(jī)分為4組：非糖尿病假手術(shù)組（N-Sham組）、非糖尿病缺血再灌注組（N-IR組）、糖尿病假手術(shù)組（D-Sham組）、糖尿病缺血再灌注組（D-IR組），每組6只。假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

1.3.4結(jié)果采集 ①各組均于缺血前（T0）、缺血30min（T1）及再灌注120min（T2）時(shí)記錄左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）；②再灌注120min時(shí)經(jīng)左心室取血2ml，2500r/min離心10min，離心半徑6cm，取上層血漿放于-80℃冰箱中保存，待標(biāo)本收集完畢后嚴(yán)格按照試劑盒說明一同測(cè)定CK活性；③實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死大鼠迅速取下心臟，在結(jié)扎線下方取下一小塊心肌組織，切成1×1×2mm3的長(zhǎng)條，并馬上固定于4%的戊二醛溶液中，交由徐州醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心電鏡室行電鏡觀察心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。定量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，然后采用單因素方差分析（one-way ANOVA）對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行比較，差異顯著時(shí)采用最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行兩兩比較，組內(nèi)比較采用Bonferroni法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 各組缺血前血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與T0比較，N-IR組及D-IR組在再灌注末LVSP降低，LVEDP升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與N-IR組比較，D-IR組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2血漿CK活性 與假手術(shù)組比較，N-IR組及D-IR組CK活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），N-IR組與D-IR組比較，血漿CK活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3線粒體超微結(jié)構(gòu) 由圖可見，N-Sham組與D-Sham組肌絲結(jié)構(gòu)排列清晰，無明顯攣縮，線粒體包膜完整，嵴排列整體、連續(xù)；N-IR組與DM-IR組肌絲排列紊亂、斷裂，可見攣縮改變，線粒體腫脹，嵴明顯減少，部分?jǐn)嗔眩钚钥栈?，形成電子透亮區(qū)。見圖1。

N-Sham組 N-IR組

D-Sham組 D-IR組

圖1 各組線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

3 討論

心肌缺血再灌注損傷（IRI）的發(fā)生機(jī)制可能與氧自由基大量產(chǎn)生、鈣離子超載、內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等有關(guān)，最終可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡為主的心肌不可逆損傷[4]。糖尿病是心血管疾病最常見的易患因素之一，它可使心肌纖維重構(gòu)致鈣通道異常，引起基礎(chǔ)心功能降低[5]。糖尿病患者發(fā)生缺血性心臟病是非糖尿病患者的2～3倍，該類患者一旦合并冠心病，死亡率極高[6]。

糖尿病心肌對(duì)缺血再灌注損傷的耐受程度尚有爭(zhēng)議，Tosaki A[7]等在糖尿病大鼠模型上證實(shí)，STZ注射致大鼠糖尿病形成后2w，離體灌流的大鼠心肌缺血/再灌注后室顫和室速發(fā)生率較年齡匹配的非糖尿病大鼠均降低42%，并出現(xiàn)缺血后心功能改善和I/R誘導(dǎo)的鈉和鈣超載及鉀、鎂離子丟失的減輕，4w和6w糖尿病大鼠未見上述心肌保護(hù)作用，而8w則出現(xiàn)心功能惡化。但在4w和8w糖尿病大鼠心肌I/RI的對(duì)照研究顯示，8w糖尿病大鼠的損傷明顯重于4w糖尿病大鼠，4w糖尿病大鼠的損傷明顯輕于正常對(duì)照組[8]。也有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變?cè)?～12w，心功能改變發(fā)生在6～14w。本實(shí)驗(yàn)用單次腹腔注射STZ復(fù)制糖尿病大鼠模型，后適應(yīng)性飼養(yǎng)4w，采用在體結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30min，再灌注120min的方法復(fù)制在體大鼠心肌缺血再灌注模型，比較觀察血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVSP和LVEDP、心肌酶CK及線粒體超微結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示4w糖尿病大鼠對(duì)心肌IRI的耐受性較非糖尿病大鼠無明顯增強(qiáng)或減弱。

盡管在大鼠糖尿病模型中急性期與慢性期的時(shí)間劃分尚不明確，但已證實(shí)的是糖尿病急性期對(duì)心肌抗缺血再灌注損傷的能力是增強(qiáng)的，而慢性期心臟功能明顯惡化，對(duì)這一損傷的抵抗作用是明顯降低的，推測(cè)急性糖尿病動(dòng)物模型存在\"代謝預(yù)處理\"現(xiàn)象[10]，且可能與一系列生存信號(hào)通路（PI3K-Akt-eNOS、PKC、ERK1/2等）的激活有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示4w糖尿病大鼠與非糖尿病大鼠心肌對(duì)IRI的耐受性無明顯差異，推測(cè)糖尿病大鼠心肌對(duì)IRI的耐受程度與其病程有關(guān)。

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