一種新型的兒茶酚—O位—甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑對帕金森大鼠結(jié)腸動力及離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

摘要：目的 研究一種新型的兒茶酚-O位-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑對帕金森病大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌動力及上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，探討其引起腹瀉、便秘、腹痛等胃腸道副作用的可能機(jī)理。方法 利用離體帕金森病模型大鼠結(jié)腸平滑肌和粘膜標(biāo)本，采用胃腸道平滑肌動力記錄技術(shù)、短路電流測定技術(shù)測定平滑肌的收縮舒張以及粘膜上皮的離子轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)新型抑制劑恩他卡朋對正常大鼠的平滑肌沒有作用，但對帕金森病大鼠縱行肌的收縮具有抑制效應(yīng)，并呈現(xiàn)劑量依賴性的特征，而對環(huán)形肌則沒有明顯的影響。在正常鼠和帕金森病模型大鼠結(jié)腸粘膜的基底側(cè)加入恩他卡朋（250？滋M），引起的短路電流（ISC）分別為52.82± 5.86 ？滋A/cm2和 37.69 ± 8.91？滋A/cm2，帕金森模型組和正常組相比，均值降低；在結(jié)腸粘膜的基底側(cè)加入恩他卡朋（250？滋M），正常大鼠和模型大鼠的跨膜電阻分別為：46.29 ± 3.949 Ω·cm2 和 49.10 ± 6.385 Ω·cm2 。模型大鼠和正常組相比，跨膜電阻均值略有增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 新型抑制劑恩他卡朋對帕金森病大鼠縱行肌的收縮呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制效應(yīng)，并且可以引起帕金森病大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸上皮跨膜短路電流的降低。這些變化可能是造成服用恩他卡朋的患者產(chǎn)生腹瀉、便秘等胃腸道副作用的可能機(jī)理之一。

關(guān)鍵詞：新型的兒茶酚-O位；甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；帕金森病

左旋多巴是治療帕金森病最有效的藥物，但帕金森患者應(yīng)用其治療3～5年后，多數(shù)患者出現(xiàn)諸如療效減退及并發(fā)癥[1，2]，恩他卡朋是克服這些問題的新藥，是一種治療帕金森病有效的兒茶酚-O位-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）抑制劑，但應(yīng)用恩他卡朋后患者會出現(xiàn)明顯的胃腸道副作用，特別是腹瀉，或者有些則表現(xiàn)為便秘、腹痛，恩他卡朋引起胃腸道不良反應(yīng)的確切機(jī)制尚不明確[3～5]。

我們推測恩他卡朋之所以引起帕金森病患者胃腸道不良反應(yīng)，可能與其影響了腸道平滑肌動力變化，甚或影響了腸道上皮的相關(guān)離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，恩他卡朋影響帕金森病患者腸道上皮以及平滑肌動力改變的機(jī)制未有文獻(xiàn)報(bào)道。基于此種情形，本實(shí)驗(yàn)觀察了恩他卡朋對帕金森病模型大鼠離體結(jié)腸平滑肌的作用，以及其對大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)影響，探究其造成帕金森病患者應(yīng)用恩他卡朋造成腸道不良反應(yīng)的主要原因，對預(yù)防和應(yīng)對這些副作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠，體重200～300g，隨機(jī)分組，按照實(shí)驗(yàn)動物福利委員會許可，動物在室溫條件下，正常晝夜更替的光照，24h食水供應(yīng)，直至試驗(yàn)之日。動物來源于首都醫(yī)科大學(xué)動物科學(xué)部，國家等級動物飼養(yǎng)場。

1.2 主要試劑和配制 恩他卡朋為芬蘭公司產(chǎn)品（Orion Corporation），所有化學(xué)試劑均溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），且DMSO的體積分?jǐn)?shù)不超過0.1%。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，溶劑不改變基本的電生理參數(shù)。

1.3 大鼠結(jié)腸平滑肌收縮的記錄 大鼠斷頸處死后，切開腹部，快速取鄰近肛門7cm長的遠(yuǎn)端結(jié)腸，用Kreb，s沖洗腸內(nèi)容物，取遠(yuǎn)端結(jié)腸第一段到第四段（DC1-DC4），每一段沿腸系膜剪開，腔面膜朝下平鋪于硅膠上，周圍有冰冷的Kreb，s保持組織活性。全層的結(jié)腸沿縱行肌或環(huán)形肌剪成 2 mm寬，1～1.5 cm長的肌條，用外科縫線在肌條的兩端各縫扎一細(xì)線，一端固定在標(biāo)本支持棒上，另一端掛于壓力傳感器。肌條置于盛有恒溫（37 ± 0.5℃）、持續(xù)通氣（95%氧氣與5%二氧化碳）10 mL的Kreb's里內(nèi)。給肌條施加1g的靜息張力，肌條長度的改變被張力傳感器所記錄，肌條在水浴中適應(yīng)120min后，正式記錄自發(fā)收縮的頻率以及幅度。

1.4 用于測量短路電流的組織制備 大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸粘膜標(biāo)本制備：用頸椎脫臼法處死大鼠，打開腹腔，迅速從直腸淋巴結(jié)向上取約7cm遠(yuǎn)端結(jié)腸（該淋巴結(jié)通常位于直腸向上約3 cm處）。用頂端精細(xì)的鑷子，在解剖顯微鏡下，小心將粘膜下層﹑肌層和漿膜層與粘膜層鈍性分離，得到一薄層組織，包括上皮層和一些粘連的結(jié)締組織，大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸粘膜標(biāo)本即制備完成。

1.5 短路電流測定技術(shù) 本實(shí)驗(yàn)采用恒溫灌流裝置體外測量短路電流，將結(jié)腸粘膜標(biāo)本置于灌流裝置的Ussing小室中。在結(jié)腸粘膜的兩側(cè)注入5 ml K-HS，同時(shí)通入95%的氧和5%的二氧化碳，使溶液的pH維持在7.4左右，置于37℃水浴中30min，使其電參數(shù)達(dá)到穩(wěn)定。用電壓鉗將上皮固定在零電位，使組織短路，此時(shí)測得跨上皮電流為短路電流。

1.6 大鼠PD模型的制作 選取雄性SD大鼠，體重210～240 g。首先稱量體重，并按每100 g體重0.4 ml注射10%水合氯醛麻醉大鼠。將動物固定于立體定位儀上，根據(jù)圖譜坐標(biāo)前囟后5.6 mm，旁開2 mm，即AP=-5.6 mm （囟后為負(fù)，囟前為正），ML=±2 mm （右為負(fù)，左為正）調(diào)整坐標(biāo)桿，用記號筆打記號。4 μl 6-OHDA（2 μg/μl），總量為8 μg 勻速進(jìn)藥，1 μl/min，留針2min。緩慢上升針頭，沾少量生理鹽水濕潤切口，用生理鹽水浸泡明膠海綿，擠干后封孔，撒少量青霉素粉末，縫合皮膚，腹腔注射青霉素（0.5 ml/只）。正常對照組注射生理鹽水，其他與模型組相同。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 4.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以（x ± s）表示。

2結(jié)果

2.1 恩他卡朋對帕金森模型大鼠結(jié)腸平滑肌動力的影響 分別應(yīng)用恩他卡朋 2？滋M 、20？滋M、100？滋M、200？滋M、400？滋M，觀察恩他卡朋對帕金森模型大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸縱行肌的影響，見圖1， 可見縱行肌的收縮幅度由基礎(chǔ)值1233 ± 50.13 mg 分別下降到 1150 ± 64.96 mg、859.9 ± 43.54 mg、566.8 ± 92.6 mg、311.6 ± 74.86 mg 和 304.9 ± 53.7 mg。提示恩他卡朋對結(jié)腸縱行肌的收縮有抑制效應(yīng)，并呈現(xiàn)劑量依賴性的特征。而不同劑量的恩他卡朋對帕金森模型大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的環(huán)形肌，以及對正常大鼠的縱行肌和環(huán)形肌均無影響（數(shù)據(jù)結(jié)果未顯示）。

圖1 恩他卡朋對帕金森大鼠結(jié)腸平滑肌動力的影響。

分別加入恩他卡朋 2？滋M、20？滋M、100 ？滋M、200 ？滋M、400？滋M，對結(jié)腸縱行肌收縮的抑制效應(yīng)（n = 6）。數(shù)據(jù)用x±s表示。

2.2 恩他卡朋對帕金森模型大鼠結(jié)腸粘膜ISC變化的影響 見圖2，在正常大鼠和帕金森模型大鼠，在結(jié)腸粘膜的基底側(cè)加入恩他卡朋（250？滋M），引起的ISC分別為52.82± 5.86？滋A/cm2和37.69 ± 8.91？滋A/cm2，帕金森模型組和對照組相比，均值降低（見圖2A）；在結(jié)腸粘膜的基底側(cè)加入恩他卡朋（250？滋M），正常大鼠和帕金森PD模型大鼠的跨膜電阻分別為：46.29 ± 3.949 Ω·cm2 和 49.10 ± 6.385 Ω·cm2 ，帕金森組和正常組相比，跨膜電阻均值略有增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖2B）。

圖2 恩他卡朋在正常大鼠和帕金森模型模型大鼠誘發(fā)的ISC反應(yīng)

（A） 基底側(cè)加入恩他卡朋，正常大鼠和帕金森模型模型大鼠誘發(fā)的ISC反應(yīng)。（B） 基底側(cè)加入恩他卡朋，正常大鼠和帕金森模型模型大鼠跨膜電阻的改變。

3討論

在年齡65歲以上的人群中，有超過1%的比例受到帕金森病的影響。到目前為止，左旋多巴仍是帕金森病最有效的治療藥物。但是對于重癥晚期患者，或者應(yīng)用左旋多巴治療3～5年后的患者，大多數(shù)會出現(xiàn)諸如療效減退、異動癥等\"長期綜合征\"。目前臨床研究和使用證實(shí)，作為一種有效的、選擇性的、可逆的和作用于外周的兒茶酚-O位-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，恩他卡朋對治療帕金森病具有突出的臨床意義。恩他卡朋如果和左旋多巴/卡比多巴合并使用，可顯著改善帕金森病患者的臨床癥狀，作為新藥的恩他卡朋盡管頗有前景，但其副作用也比較常見。在胃腸道癥狀中，腹瀉尤為突出，恩他卡朋也可引起便秘和腹痛，有1%的患者因腹痛而中斷恩他卡朋的治療。中斷使用恩他卡朋數(shù)天后腹瀉等胃腸道不良反應(yīng)可以得到改善，機(jī)制不清。腹痛可以嚴(yán)重到中等程度，服用大劑量（>1600mg/d） 恩他卡朋時(shí)腹痛發(fā)生率和嚴(yán)重程度更高，原因未明[6]。

在對恩他卡朋誘發(fā)的副作用研究中，本文應(yīng)用正常大鼠急性實(shí)驗(yàn)，探討了恩他卡朋引起帕金森模型大鼠的副作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示恩他卡朋對結(jié)腸縱行肌的收縮有抑制效應(yīng)，并呈現(xiàn)劑量依賴性的特征。這可能會引起帕金森患者胃腸道平滑肌收縮和舒張的紊亂，出現(xiàn)動力障礙，腸腔內(nèi)容物傳輸處理受限，形成部分患者便秘。在結(jié)腸粘膜的基底側(cè)加入恩他卡朋誘發(fā)跨粘膜上皮的短路電流，發(fā)現(xiàn)帕金森模型大鼠的基短路電流與對照組相比降低，提示恩他卡朋對帕金森模型大鼠結(jié)腸的離子轉(zhuǎn)運(yùn)整體上看呈現(xiàn)偏弱的態(tài)勢，可能與恩他卡朋引發(fā)患者副作用想關(guān)。

今后可以考慮以下幾個(gè)方面的深入研究：①觀察應(yīng)用恩他卡朋后的慢性實(shí)驗(yàn)。因?yàn)榕R床上患者服用恩他卡朋的時(shí)間比較長。②與目前臨床上一些典型的止瀉藥物相對照研究，提供更多的臨床應(yīng)用依據(jù)。③腸神經(jīng)系統(tǒng)在粘膜促分泌與平滑肌收縮之間的協(xié)同調(diào)控作用，應(yīng)該是進(jìn)一步研究的著力點(diǎn)之一。

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編輯/許言