馬銀花愈傷組織RoWUS基因及其啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)分析

匡華琴等

摘 要 WUSCHEL（WUS）基因是植物干細(xì)胞的標(biāo)志基因。采用同源克隆法結(jié)合RACE技術(shù)從馬銀花愈傷組織中克隆得到RoWUS cDNA全長(zhǎng)序列，采用染色體步移法克隆得到該基因的啟動(dòng)子序列，登錄號(hào)分別為KF365488、KF861578。馬銀花RoWUS cDNA全長(zhǎng)1 123 bp，編碼302個(gè)氨基酸；DNA序列2 001 bp，包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子；啟動(dòng)子序列3 122 bp。生物信息學(xué)分析表明：RoWUS亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，是不穩(wěn)定的親水蛋白，無信號(hào)肽，具有跨膜結(jié)構(gòu)，包含homeodomain功能位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明：RoWUS單獨(dú)形成一個(gè)分支，與葡萄、大豆和苜蓿的親緣關(guān)系最近。對(duì)RoWUS的啟動(dòng)子進(jìn)行分析表明，該啟動(dòng)子除了含有豐富的TATA-box和CAAT-box等基本元件以外，還含有多個(gè)光響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件、激素應(yīng)答元件和其他功能元件。qPCR結(jié)果表明：RoWUS基因在馬銀花愈傷組織不同生長(zhǎng)時(shí)期中呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第5個(gè)繼代周期時(shí)表達(dá)量最高。外源赤霉素和脫落酸濃度為15 mg/L時(shí)表達(dá)量最高，說明RoWUS基因在該濃度時(shí)對(duì)赤霉素和脫落酸的響應(yīng)最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞 馬銀花；愈傷組織；WUS；啟動(dòng)子；基因克隆；生物信息學(xué)分析；熒光定量PCR

中圖分類號(hào) S685.21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The WUSCHEL（WUS）gene was a plant stem cell marker gene. The RoWUS gene was cloned from the callus of Rhododendron ovatum Planch by the homologous cloning and RACE technology（GenBank：KF365488）. The complete cDNA sequence was 1 123 bp，encoding 302 amino acids. The DNA sequence of RoWUS was 2 001 bp which included 3 exons and 2 introns. The RoWUS promoter fragment was cloned from the callus of R. ovatum Planch by the genome walking（GenBank：KF861578），and the sequence was 3 122 bp. Bioinformatics analysis showed that the protein was likely a kind of hydrophilcity and unstable protein which located in the nucleus. The protein had transmembrane structure without signal peptide，which obtained a homeodomain functional site. The phylogenetic tree analysis showed that RoWUS has the closest relationship with Vitis vinifera，Glycine max and Medicago truncatula. The promoter software analysis showed that the promoter fragment contained a number of TATA-box，CAAT-box elements and many other promoter elements，such as light response elements，environmental stress response elements，hormone response elements and some function unknown elements. The qPCR results indicated that RoWUS showed a downward trend after the first rising at different culture stages in R. ovatum Planch callus. It expressed at the highest levels in the 5th cycle. The RoWUS gene had strong response under the hormone treatments of GA3 and ABA，and the peak of expression level appeared at 15 mg/L GA3 and ABA.

Key words Rhododendron ovatum； Callus； WUSCHEL； Promoter； Cloning； Bioinformatics； qPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.017

植物干細(xì)胞是植物器官發(fā)育的源泉，其產(chǎn)生的子細(xì)胞具有持續(xù)分裂能力并能進(jìn)行自我更新，是頂端生長(zhǎng)過程中必不可少的[1-4]。WUSCHEL（WUS）基因能使它周圍的細(xì)胞具有干細(xì)胞的特征，是植物干細(xì)胞的決定基因，該基因的表達(dá)與干細(xì)胞的形成和器官的發(fā)生有密切關(guān)系[5]。WUS基因在莖端分生組織中心表達(dá)能誘導(dǎo)分生組織細(xì)胞增殖，該基因編碼一個(gè)同源異型結(jié)構(gòu)域（homeodomain）蛋白，此蛋白在多種生物中都存在，參與發(fā)育過程并且決定細(xì)胞的類型[5]。WUS基因通過與轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)合來抑制分化，使莖端分生組織中的干細(xì)胞保持未分化狀態(tài)，既能保持干細(xì)胞的多能性特征，又能維持分生組織的形態(tài)以及功能的完整，在植物器官和組織的生長(zhǎng)過程中對(duì)干細(xì)胞的維持和分化的調(diào)控起到極為重要的作用[6-15]。最近的研究結(jié)果表明，WUS基因在番茄花的形態(tài)發(fā)育、器官鑒別、花離層區(qū)和器官脫落過程以及控制番茄小室的數(shù)量中起到重要調(diào)控作用[16-17]。WUS突變體形成的莖端分生組織不具有正常功能，可能導(dǎo)致葉序混亂、莖和花的分生組織提前終止等現(xiàn)象發(fā)生，多數(shù)情況下花的大部分器官缺失只形成一個(gè)雄蕊，不產(chǎn)生心皮[18-19]。

馬銀花（Rhododendron ovatum Planch）是杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）常綠灌木或小喬木，為杜鵑花屬中的中國(guó)特有種，世界著名的觀賞花卉。馬銀花主產(chǎn)江蘇、浙江、廣東、廣西等?。▍^(qū)）海拔1 000 m以下的灌叢中，除了具有很高的園林價(jià)值之外，還具有一定的藥用價(jià)值，具有消熱利濕的功效。目前已從擬南芥、番茄、蘿卜等物種中克隆得到了WUS基因[20-25]，但已分離出的木本植物WUS基因還相當(dāng)少。迄今為止，杜鵑花中還沒有進(jìn)行該基因的相關(guān)研究，也還未見愈傷組織中克隆得到該基因的相關(guān)報(bào)道。為了深入研究RoWUS基因在馬銀花愈傷組織形成過程中對(duì)干細(xì)胞的維持和分化的調(diào)控作用，本研究以馬銀花試管苗為材料誘導(dǎo)愈傷組織，從愈傷組織中分離和克隆RoWUS基因及啟動(dòng)子，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過qPCR法研究其在馬銀花愈傷組織生長(zhǎng)過程中的表達(dá)規(guī)律及外源激素處理對(duì)該基因的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討馬銀花RoWUS在愈傷組織形成過程中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供的馬銀花（Rhododendron ovatum Planch.）無菌試管苗為材料誘導(dǎo)愈傷組織，取繼代20 d左右的松散愈傷組織用于總RNA的提取及后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 馬銀花愈傷組織DNA及總RNA的提取 愈傷組織DNA的提取采用改良CTAB法，總RNA使用柱式植物RNAOUT2.0（TIANDZ）試劑盒（北京天恩澤公司）提取，然后運(yùn)用超微量核酸檢測(cè)儀（ND lite）檢測(cè)樣品濃度和純度，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA和RNA完整性。

1.2.2 馬銀花愈傷組織cDNA合成 采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）試劑盒的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，用于保守區(qū)及3′-RACE的擴(kuò)增；5′-RACE cDNA 第一鏈的合成參照Clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒的說明書。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 RoWUS保守區(qū)引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增：在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得擬南芥、大豆、甜橙、葡萄等的基因序列，利用DNA MAN6.0軟件對(duì)其進(jìn)行同源比對(duì)分析，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)上下游引物RoWUS-F、RoWUS-R，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

RoWUS 3′-RACE和5′-RACE引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增：根據(jù)已得到的RoWUS基因保守區(qū)核苷酸序列設(shè)計(jì)2條3′-RACE正向特異引物RoWUS 3′GSP1、RoWUS 3′GSP2，結(jié)合GeneRacerTM 3′Primer和GeneRacerTM 3′Nested Primer引物，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA為模板進(jìn)行二輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增3′末端序列；再分別設(shè)計(jì)2條5′-RACE反向特異引物RoWUS 5′GSP1、RoWUS 5′GSP2，結(jié)合UPM引物，以反轉(zhuǎn)錄得到的5′端cDNA為模板進(jìn)行二輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增5'末端序列。

RoWUS ORF驗(yàn)證及gDNA引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增：在拼接得到的馬銀花RoWUS全長(zhǎng)序列的3′和5′端分別設(shè)計(jì)上下游特異引物ORF-F、ORF-R，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA為模板對(duì)ORF進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)利用該ORF驗(yàn)證引物，以馬銀花愈傷組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到該基因的DNA序列。

RoWUS啟動(dòng)子引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增：在已克隆得到的RoWUS DNA序列的5′端設(shè)計(jì)3條同向特異引物SP1、SP2、SP3。參照Genome Walking Kit（TaKaRa）的方法，首先以DNA為模板，用SP1與AP1進(jìn)行第一輪熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)；然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用SP2與AP1進(jìn)行第二輪熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)；再以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，用SP3與AP1進(jìn)行第三輪熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)。

所有引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物序列、退火溫度、擴(kuò)增目的片段大小及擴(kuò)增用途見表1。

PCR擴(kuò)增體系：RoWUS基因克隆PCR體系為cDNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Prime STARR GC Buffer（Mg2+ plus）12.5 μL，dNTPs Mixture（2.5 mmol/L）2 μL，PrimeSTARR HS DNA polymerase（2.5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 7.25 μL，總計(jì)25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。根據(jù)擴(kuò)增的目的片段大小不同PCR程序進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。啟動(dòng)子克隆PCR體系參考Genome Walking Kit（Takara）說明書。

1.2.4 目的片段的回收、克隆和測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后割膠回收目的產(chǎn)物，回收方法參照EzgeneTM Gel/PCR Extraction Kit（BIOMIGA）說明書。取4 μL目的產(chǎn)物與1 μL pEASYTM-Blunt Zero進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化至50 μL Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆于菌液中過夜培養(yǎng)，菌液經(jīng)PCR鑒定后送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 馬銀花愈傷組織RoWUS基因的生物信息學(xué)分析及啟動(dòng)子序列分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。使用DNA MAN6.0拼接序列并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行推導(dǎo)。采用ExPASy Protparam預(yù)測(cè)編碼蛋白的理化性質(zhì)；以PredictProtein進(jìn)行亞細(xì)胞定位；蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignaIP 4.1 Server；采用TMpred預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；NetPhos 2.0 Serve預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；ScanProsite預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能位點(diǎn)；經(jīng)InterProScan預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；以PHD在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISSMODEL對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用Neural Network Promoter Prediction（http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）軟件對(duì)RoWUS基因可能的核心啟動(dòng)子位置及可能存在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行分析；使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）結(jié)合PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html）軟件對(duì)該啟動(dòng)子序列潛在的順式作用元件進(jìn)行分析。

1.2.6 馬銀花愈傷組織不同生長(zhǎng)時(shí)期RoWUS的定量表達(dá)分析 以EF-1a為內(nèi)參基因，檢測(cè)RoWUS在馬銀花愈傷組織不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況。本試驗(yàn)采用TaKaRa SYBR ExScriptTM 試劑和羅氏LightCycler480儀器，使用柱式植物RNAOUT2.0（TIANDZ）試劑盒（北京天恩澤公司）提取馬銀花愈傷組織不同繼代周期（第1、3、5、7、9、40、45代）的總RNA，并用SYBR ExScriptTM RT-PCR試劑盒（TAKARA公司）合成cDNA，根據(jù)熒光引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。qPCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照Lin等的方法[26]。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和溶解曲線等分析，檢測(cè)引物的特異性，各不同生長(zhǎng)時(shí)期的cDNA模板混合樣以不同梯度稀釋（5×、25×、125×、625×），進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，獲得擴(kuò)增效率等相關(guān)參數(shù)。然后將不同生長(zhǎng)時(shí)期的馬銀花愈傷組織cDNA分別稀釋成10倍樣進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)樣本重復(fù)3次。qPCR引物見表1。

1.2.7 外源GA3和ABA處理下RoWUS的定量表達(dá)分析 以EF-1a為內(nèi)參基因，檢測(cè)馬銀花愈傷組織RoWUS在不同濃度GA3（0、5、10、15、20 mg/L）和ABA（0、5、10、15、20 mg/L）處理24 h后的表達(dá)情況。試驗(yàn)方法同1.2.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬銀花愈傷組織RoWUS cDNA、gDNA及啟動(dòng)子序列的獲得

經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期一致的保守片段，測(cè)序表明該序列長(zhǎng)度為199 bp，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明，該片段與蓖麻、葡萄、楊樹、矮牽牛等的WUS基因序列具有較高的同源性，初步推斷克隆得到馬銀花愈傷組織RoWUS的部分序列。經(jīng)二輪PCR擴(kuò)增后分別得到204 bp 5′-RACE序列和825 bp 3′-RACE序列，其中5′-UTR長(zhǎng)度為101 bp，3′-UTR長(zhǎng)度為94 bp，終止密碼子為TAA， Poly（A）尾長(zhǎng)18 bp。

序列拼接得到RoWUS全長(zhǎng)序列為1 123 bp，對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行PCR驗(yàn)證得到約900 bp目的片段，測(cè)序表明驗(yàn)證產(chǎn)物長(zhǎng)度為922 bp，包括完整的開放閱讀框，與拼接結(jié)果相符（圖1、2）。將RoWUS的核苷酸序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明該序列與葡萄、毛果楊、番茄、向日葵的同源性分別達(dá)到87%、86%、85%、84%，說明所得片段為WUS基因，將其命名為RoWUS，GenBank登錄號(hào)：KF365488。

對(duì)馬銀花基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到一條大約2 000 bp的片段（圖1），測(cè)序表明該片段大小為2 001 bp。DNAMAN 分析表明，該序列包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，3個(gè)外顯子序列與cDNA序列一致，在DNA序列上的位點(diǎn)分別是1～370；831～946；1 579～2 001。所有內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)均符合真核生物“GT-AG”規(guī)則。

經(jīng)三輪巢式PCR擴(kuò)增得到約3 500 bp的啟動(dòng)子序列（圖1），測(cè)序結(jié)果顯示該片段長(zhǎng)度為3 427 bp。根據(jù)DNA序列拼接結(jié)果和NCBI比對(duì)結(jié)果，表明所得序列為該基因的啟動(dòng)子序列，RoWUS 5′端調(diào)控序列長(zhǎng)度為3 122 bp，該序列在GenBank上的序列號(hào)為KF861578。

2.2 生物信息學(xué)分析

ProtParam預(yù)測(cè)可知馬銀花RoWUS的分子式為C1 444H2 186N416O477S13，由4 536個(gè)原子構(gòu)成，包括302個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為33.4 ku，理論等電點(diǎn)（pI）5.81，帶正電的氨基酸（Arg+Lys）有25個(gè)，帶負(fù)電的氨基酸（Asp+Glu）有30個(gè)，總平均疏水性為-0.830，屬于親水蛋白，此蛋白不穩(wěn)定系數(shù)達(dá)到58.52，是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白。

SignaIP 4.1 Server預(yù)測(cè)可知馬銀花RoWUS蛋白無信號(hào)肽。經(jīng)TMpred軟件預(yù)測(cè)RoWUS在164～183處形成一個(gè)由內(nèi)向外的跨膜螺旋。PredictProtein亞細(xì)胞定位表明，RoWUS定位于細(xì)胞核的可能性最高。根據(jù)NCBI-CDS對(duì)馬銀花愈傷組織RoWUS結(jié)構(gòu)域分析的結(jié)果，該蛋白屬于同源異型結(jié)構(gòu)域（homeodomain）蛋白超級(jí)家族，包含homeodomain功能位點(diǎn)（圖2）。Coils軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示RoWUS可能形成卷曲螺旋。NetPhos 2.0 Serve軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明RoWUS含有23個(gè)蛋白磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸（Ser）13個(gè)，蘇氨酸（Thr）3個(gè)，酪氨酸（Tyr）7個(gè)。PHD軟件預(yù)測(cè)表明RoWUS二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主，所占的比例為74.83%，其次為α螺旋結(jié)構(gòu)占15.23%，延伸鏈所占的比例較少，為9.93%。SWISSMODEL三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，RoWUS的主要結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)則卷曲、α螺旋和延伸鏈（圖3）。

將馬銀花RoWUS的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行在線Blast，結(jié)果顯示馬銀花RoWUS氨基酸序列與無油樟（Amborella trichopoda）、毛果楊（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）的同源性分別達(dá)到了93%、86%、79%、75%，比對(duì)結(jié)果表明馬銀花RoWUS與其他物種該基因同源性較高。為了研究RoWUS的進(jìn)化關(guān)系，本研究選取大豆、葡萄、番茄、毛白楊、銀杏等18種植物的WUS氨基酸序列，運(yùn)用MEGA5.0軟件的鄰位相連法（NJ）構(gòu)建WUS的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。進(jìn)化結(jié)果表明，WUSCHEL根據(jù)種屬關(guān)系被分為兩大類，其中被子植物聚為一類、裸子植物聚為另一類。在被子植物中水稻和玉米等單子葉植物聚為一類，其他雙子葉植物聚為另一類。馬銀花單獨(dú)形成一個(gè)分支，與葡萄、大豆和苜蓿的親緣關(guān)系較近，與樟子松、銀杏等裸子植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 馬銀花RoWUS啟動(dòng)子序列及其結(jié)構(gòu)分析

馬銀花RoWUS啟動(dòng)子具有3 122 bp的核苷酸序列，Neural Network Promoter Prediction預(yù)測(cè)到該啟動(dòng)子具有多個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)域，其中最可能的核心啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)镚TCGTTCATATATATATTTATGC

CCGATCAATCTGATTTTTCTCTGCGAT，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)ATG上游的-1 381 bp處的T（將起始密碼子ATG中的A定義為位+1）。

PlantCARE順式元件分析表明，該序列存在大量的調(diào)控元件，其中核心元件TATA-Box有57個(gè)、CAAT-Box有27個(gè)。 此外，還存在多個(gè)光響應(yīng)元件AE-box、G-Box、I-box、L-box、AT1-motif、ATCT-motif、GAG-motif、GATA-motif、TCCC-motif、TCT-motif和Sp1；激素應(yīng)答元件P-box、TATC-box、TCA-element、TGA-element和ABRE；逆境脅迫響應(yīng)元件ARE、TC-rich repeat、MBS及circadian，另外還存在一些其他功能的元件。

2.4 馬銀花愈傷組織不同生長(zhǎng)時(shí)期RoWUS的定量表達(dá)分析

qPCR結(jié)果經(jīng)擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析結(jié)果表明，EF-1a引物和qPCR引物特異性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線符合試驗(yàn)要求。馬銀花愈傷組織不同生長(zhǎng)時(shí)期RoWUS的相對(duì)表達(dá)情況見圖5。由圖5可以看出，RoWUS在馬銀花愈傷組織各個(gè)繼代周期都有表達(dá)，且呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，最后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。RoWUS在第1代之后表達(dá)量緩慢上升，第3代之后急劇上升，在第5代時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，此時(shí)細(xì)胞處于分裂旺盛期。第5代之后表達(dá)量迅速下降，從第7代之后表達(dá)量沒有明顯變化。

2.5 外源GA3和ABA處理下RoWUS的定量表達(dá)分析

馬銀花愈傷組織RoWUS在不同濃度赤霉素和脫落酸處理下的定量表達(dá)情況見圖6。試驗(yàn)結(jié)果表明，赤霉素濃度較低時(shí)RoWUS的響應(yīng)比較弱，隨著赤霉素濃度的升高RoWUS對(duì)赤霉素響應(yīng)逐漸增強(qiáng)，在濃度為15 mg/L時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，濃度進(jìn)一步增加時(shí)又降低。這可能是試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基中含有活性較高的細(xì)胞分裂素和一定濃度的生長(zhǎng)素導(dǎo)致的。用低濃度脫落酸處理時(shí)RoWUS相對(duì)表達(dá)量較穩(wěn)定，但是當(dāng)ABA濃度從10 mg/L增加到15 mg/L時(shí)RoWUS的相對(duì)表達(dá)量迅速上升，在15 mg/L時(shí)達(dá)到峰值。說明RoWUS在脫落酸濃度為15 mg/L時(shí)響應(yīng)最強(qiáng)，可以促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞快速分裂。

3 討論與結(jié)論

3.1 馬銀花愈傷組織RoWUS的功能推測(cè)

對(duì)馬銀花RoWUS的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)馬銀花RoWUS蛋白具有跨膜螺旋，不含信號(hào)肽，屬于可溶性的親水蛋白。亞細(xì)胞定位表明，RoWUS蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，這與譚文勃等[5]的研究結(jié)論一致。馬銀花RoWUS結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于同源異型結(jié)構(gòu)域（homeodomain）蛋白超級(jí)家族，包含homeodomain功能位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)多種生物中都存在同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白，番茄、狗薔薇等的WUS蛋白也含有高度保守的homeodomain結(jié)構(gòu)域[16，23]，該結(jié)構(gòu)域可以以單體或異源二聚體的方式與DNA序列特異性結(jié)合，參與真核生物的發(fā)育過程，在莖尖分生組織中通過調(diào)控可塑性干細(xì)胞來決定細(xì)胞類型，從而在許多器官的生長(zhǎng)和發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5]。

研究結(jié)果表明，WUS基因能使其周圍的細(xì)胞具有干細(xì)胞的特征，是植物干細(xì)胞的決定基因[5]，而本試驗(yàn)從馬銀花愈傷組織中分離得到RoWUS，表明存在WUS這個(gè)標(biāo)志基因的表達(dá)，說明馬銀花愈傷組織可能是干細(xì)胞。結(jié)構(gòu)分析表明，RoWUS蛋白具有與擬南芥相似的二三級(jí)結(jié)構(gòu)，都是由無規(guī)則卷曲、α螺旋和延伸鏈組成，由此可以推測(cè)他們?cè)诠δ芊矫婢哂邢嗨菩?。林慶光等[27-28]研究發(fā)現(xiàn)WUS的編碼產(chǎn)物是調(diào)控植物干細(xì)胞數(shù)量的內(nèi)源性信號(hào)分子，在擬南芥體胚發(fā)生中起促進(jìn)作用。Gallois等[29]的研究結(jié)果表明WUS的異位表達(dá)會(huì)在異位產(chǎn)生干細(xì)胞并且抑制這些干細(xì)胞的分化。因此，在馬銀花愈傷組織的發(fā)生過程中，RoWUS基因在干細(xì)胞維持和分化的調(diào)控途徑中也可能起到極其重要的作用。

3.2 馬銀花RoWUS基因啟動(dòng)子的潛在功能

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)表明，馬銀花愈傷組織RoWUS啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性受到多種環(huán)境因素和激素的誘導(dǎo)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示RoWUS啟動(dòng)子包含多個(gè)調(diào)控區(qū)域，這與Baurle等[30]的研究結(jié)果一致，這些調(diào)控區(qū)域在該基因的轉(zhuǎn)錄水平以及組織特異性方面起到重要的調(diào)控作用。植物干細(xì)胞的分化除了產(chǎn)生地上和地下器官以外，也會(huì)根據(jù)內(nèi)外環(huán)境信號(hào)來決定器官的發(fā)生、生長(zhǎng)以及衰老等生物學(xué)過程。很多植物的側(cè)根干細(xì)胞都是木質(zhì)部頂端的中柱鞘細(xì)胞，它們受生長(zhǎng)素等因子的誘導(dǎo)，被激活后進(jìn)入細(xì)胞分裂過程[31]。李傳友等[32]研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥的側(cè)根干細(xì)胞和根尖生長(zhǎng)點(diǎn)中，生長(zhǎng)素和激素在干細(xì)胞的建立和維持中起到重要作用。Shani和Castellano[33-34]研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素是影響干細(xì)胞微環(huán)境的外源性信號(hào)，能調(diào)控莖尖干細(xì)胞的分化、促進(jìn)器官原基形成。馬銀花RoWUS啟動(dòng)子含有多種激素應(yīng)答元件，赤霉素對(duì)植物的各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段起到重要影響，水楊酸在植物的抗旱、抗鹽、抗病等逆境條件下起到重要調(diào)控作用[35]。因此，該啟動(dòng)子對(duì)馬銀花愈傷組織中干細(xì)胞的分化也可能具有一定的調(diào)控作用。

3.3 馬銀花愈傷組織不同生長(zhǎng)時(shí)期RoWUS的表達(dá)模式

植物愈傷組織形成過程可分為誘導(dǎo)期、分裂期和分化期。在誘導(dǎo)期時(shí)，外植體上已分化的活細(xì)胞在外源激素和其他刺激因素的作用下，細(xì)胞的大小沒有明顯改變。在分裂期時(shí)細(xì)胞快速分裂成子細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)候，愈傷組織細(xì)胞停止分裂，進(jìn)入分化期，此時(shí)細(xì)胞的體積相對(duì)穩(wěn)定，不再減少，生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的很容易轉(zhuǎn)化為黃色或褐色[36]。大量研究已經(jīng)明確WUS基因可以促進(jìn)細(xì)胞分裂。本研究中RoWUS基因在第3代以前相對(duì)表達(dá)量較低，此時(shí)愈傷組織細(xì)胞較硬，致密性強(qiáng)，水分少，細(xì)胞分裂能力較弱，在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)很慢。從第3代以后RoWUS基因相對(duì)表達(dá)量迅速升高，并在第5代達(dá)到最高峰，此時(shí)愈傷組織細(xì)胞松軟，水分比較多而且透明，說明此時(shí)大部分細(xì)胞處于分裂期，細(xì)胞分裂能力強(qiáng)，能快速分裂成小細(xì)胞。隨著繼代周期代數(shù)增加，RoWUS基因相對(duì)表達(dá)量又迅速下降并趨于穩(wěn)定，說明大部分愈傷組織細(xì)胞處于分化期，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異的細(xì)胞。

3.4 外源GA3和ABA促進(jìn)馬銀花愈傷組織RoWUS的表達(dá)

許多研究結(jié)果表明，增加細(xì)胞分裂素濃度和降低赤霉素濃度可以調(diào)控分生組織中WUS基因的表達(dá)，這對(duì)于分生組織的保持和器官的形成是非常重要的[37]。但高濃度細(xì)胞分裂素與低濃度赤霉素比值在莖頂端分生組織調(diào)控模式中也不是唯一的方式，對(duì)于多數(shù)植物而言，該模式可以促進(jìn)器官分化。本研究中，低濃度時(shí)RoWUS基因?qū)Τ嗝顾睾兔撀渌犴憫?yīng)比較弱，隨著濃度的提高，RoWUS基因?qū)Τ嗝顾睾兔撀渌岬捻憫?yīng)逐漸增強(qiáng)，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)采用的培養(yǎng)基配方中含有活性很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素TDZ和一定濃度的生長(zhǎng)素NAA，從而影響了細(xì)胞分裂素與低濃度赤霉素比值，另外，本研究采用的試驗(yàn)材料為愈傷組織，與前人采用的材料不同，這也可能是導(dǎo)致RoWUS的相對(duì)表達(dá)量隨著激素濃度升高而上升的原因。RoWUS的相對(duì)表達(dá)量在赤霉素和脫落酸濃度為15 mg/L時(shí)達(dá)到峰值，說明此濃度時(shí)該基因中GA3和ABA元件的響應(yīng)最強(qiáng)，可以促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞快速分裂。當(dāng)濃度進(jìn)一步增加時(shí)，RoWUS基因?qū)Τ嗝顾睾兔撀渌岬捻憫?yīng)又減弱，可能是激素濃度過高時(shí)對(duì)愈傷組織產(chǎn)生了毒害作用。

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