高壓靜電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿組織培養(yǎng)的影響初探

郭龍芳等

摘要 [目的]研究高壓靜電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿組織培養(yǎng)的影響。[方法]利用電場(chǎng)處理紫花苜蓿的子葉和下胚軸，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)定3個(gè)水平，研究電場(chǎng)對(duì)外植體出愈率的影響。[結(jié)果]誘導(dǎo)愈傷組織的最佳濃度組合是1.8 mg/L 2，4D+0.3 mg/L 6BA；下胚軸在培養(yǎng)7 d后出愈率最高條件為頻率3.85 kHz，場(chǎng)強(qiáng)2 kV/cm，時(shí)間20 min；20 d后，由于用20 min處理的下胚軸逐漸凋亡，因此下胚軸出愈率最高的條件為頻率3.85 kHz，場(chǎng)強(qiáng)2 kV/cm，時(shí)間15 min。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)電場(chǎng)處理后外植體木質(zhì)化程度較高。[結(jié)論]高壓靜電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿組織培養(yǎng)具有一定影響。

關(guān)鍵詞 電場(chǎng)；紫花苜蓿（Medicago sativa L）；組織培養(yǎng)；木質(zhì)化；影響

中圖分類號(hào) S541+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）11-03182-04

Abstract [Objective] To study effects of electric field on alfalfa tissue culture. [Method] The cotyledon and hypocotyl of alfalfa is treated with electric field combined with tissue culture technology. We adopted the orthogonal experimental design and set up three levels， in order to study the influence of explant callus induction rate. [Result] The results indicated that the optimal concentration combination of callus induction is 2，4D： 1.8 mg/L， 6BA： 0.3 mg/L； the condition of the highest callus induction rate is frequency 3.85 kHz， field strength 2 kV/cm， time 20min after 7 days cultivation of hypocotyl. After 20 days， 20min treatment has promoted hypocotyl apoptosis， therefore the condition of the highest hypocotyl callus induction rate is frequency 3.85 kHz， field strength 2 kV/cm， time 15 min. In addition， we found that explant lignification degree is higher after electric field treatment. [Conclusion] Electric field has a certain effect on tissue culture of alfalfa.

Key words Electric field； Alfalfa； Tissue culture； Lignification； Effect

紫花苜蓿（Medicago sativa L）是多年生草本植物，是優(yōu)良的牧草和生物能源物質(zhì)，莖稈可以作為生物燃料，葉片可作為優(yōu)質(zhì)飼料、蛋白質(zhì)添加劑等副產(chǎn)品，具有很高的綜合利用價(jià)值，是一種很有潛力的土壤修復(fù)植物。但種子產(chǎn)量低，優(yōu)良性狀退化，在種子遺傳轉(zhuǎn)化率、氨基酸含量不均衡及耐鹽性、抗病蟲(chóng)害等方面仍有待進(jìn)一步提高。

靜電生物效應(yīng)研究最早、范圍最廣的領(lǐng)域是利用高壓靜電場(chǎng)處理植物的種子，提高種子活力，其研究的范圍從經(jīng)濟(jì)作物到玉米、油葵等大田作物，藥用植物到蔬菜、水果、微生物等。靜電場(chǎng)處理種子的生物效應(yīng)研究起源于半個(gè)世紀(jì)前，我國(guó)在60年代開(kāi)始進(jìn)行探索，到20世紀(jì)70年代，高壓靜電場(chǎng)的效應(yīng)問(wèn)題引起了越來(lái)越多人的注意[1-2]，到90年代開(kāi)始大量的研究，主要探索經(jīng)電場(chǎng)處理后的種子萌發(fā)率、幼苗生長(zhǎng)抗旱性的變化并測(cè)定了種子萌發(fā)期和幼苗期的生理生化指標(biāo)。根據(jù)報(bào)道，“經(jīng)高壓靜電場(chǎng)處理后，種子的呼吸強(qiáng)度、根系活力、發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均有所提高，禾苗長(zhǎng)勢(shì)好，整齊粗壯，抗病能力強(qiáng)，成熟早，產(chǎn)量也有不同程度的增加。種子在受到靜電場(chǎng)的刺激下，種子蛋白發(fā)生凝聚，電導(dǎo)率降低，過(guò)氧化氫酶活性提高，三磷酸腺苷（ATP）含量提高，這些都有利于胚芽吸收和利用，遺傳特性也得到了改善，增強(qiáng)了吸水能力，強(qiáng)化了基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速溶解和輸送，萌發(fā)速度快，幼苗生長(zhǎng)快而健壯[3-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，靜電場(chǎng)處理過(guò)的種子播種一天后吸收強(qiáng)度增強(qiáng)30%，10 d后增強(qiáng)70%～200%[8]。試驗(yàn)主要結(jié)合組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，用電場(chǎng)處理外植體的子葉和下胚軸，最大可能的保留突變體植株，避免由于自然條件和自身因素的限制，突變細(xì)胞被大量淘汰而造成基因庫(kù)的浪費(fèi)。紫花苜蓿是異花授粉植物，自交結(jié)實(shí)率低，不到1%，雜交育種和雜種優(yōu)勢(shì)利用比較困難[9-11]，所以將生物技術(shù)與常規(guī)育種方法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行新品種培育，縮短育種年限，改良苜蓿品質(zhì)，提高育種效率已是一個(gè)世界性的普遍趨勢(shì)[12-13]，

因此，將誘變育種與組織培養(yǎng)相結(jié)合無(wú)疑是很有意義的。筆者主要探索電場(chǎng)對(duì)苜蓿愈傷組織培養(yǎng)的影響，結(jié)合離體培養(yǎng)技術(shù)分析經(jīng)處理后的愈傷組織對(duì)苜蓿愈傷組織生長(zhǎng)、分化的影響，以期為提高苜蓿轉(zhuǎn)基因效率提供良好的突變體受體材料和試驗(yàn)參考數(shù)據(jù)，并為加快我國(guó)苜蓿的育種步伐奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。選取籽粒飽滿的準(zhǔn)格爾苜蓿種子，由中國(guó)農(nóng)科院草原研究所提供。

1.1.2 主要儀器。試驗(yàn)采用的電場(chǎng)是由2塊直徑60 cm圓形金屬平板電極產(chǎn)生，兩極板間距5 cm。放外植體的培養(yǎng)皿單層置于接地電極板上，調(diào)節(jié)2極板電場(chǎng)頻率和電壓設(shè)定處理?xiàng)l件；可調(diào)頻高壓電源，購(gòu)自大連理工大學(xué)靜電與特種電源研究所，可產(chǎn)生極板的電場(chǎng)頻率和電壓，可調(diào)頻率范圍為3.6～18.0 kHz。

1.2 方法

1.2.1 種子滅菌及無(wú)菌苗的制備。將苜蓿種子放入25 ml的三角瓶中，用濃度70%酒精浸泡2 min，棄掉酒精再加入濃度10%的次氯酸鈉，浸泡45 min左右，期間搖晃數(shù)次，倒掉消毒液，隨后用無(wú)菌水沖洗3～5次，最后在無(wú)菌水中浸泡3～4 h，把種子放在無(wú)菌濾紙上吸干多余的水分，置1/2MS（medium of Murashige and Skoog，2013）固體培養(yǎng)基上，光照強(qiáng)度為3 000 lx，16 h光照/8 h黑暗，溫度（25±1） ℃。

1.2.2 外植體的處理。取7 d左右無(wú)菌苗的子葉和下胚軸，子葉被剪成四塊，下胚軸剪成3～4 mm的小段，放到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備。（1）無(wú)菌苗培養(yǎng)基。1/2MS+濃度0.3%瓊脂粉+15 g/L蔗糖。（2）誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基。1/2MS+濃度0.3%瓊脂粉+15 g/L蔗糖，分別附加濃度分別為1.5、1.8和2.0 mg/的2，4D，以及濃度分別為0.3、0.5和1.0 mg/L的6BA，共9組不同濃度的組合。

1.2.4 胚性愈傷組織的培養(yǎng)。在超凈臺(tái)內(nèi)，將子葉和下胚軸放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿放20個(gè)外植體，子葉和下胚軸分別設(shè)2個(gè)重復(fù)，共36個(gè)培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)15 d后，計(jì)數(shù)不同濃度組合下培養(yǎng)基上愈傷組織的數(shù)量，并將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)胚狀體的培養(yǎng)基上。

1.2.5 誘導(dǎo)胚狀體的培養(yǎng)。設(shè)定2組培養(yǎng)基，1組為UM培養(yǎng)基+0.2 mg/L KT+2 g/L水解酪蛋白+0.3 mg/L 6BA+2.5 mg/L 2，4D；另1組為UM培養(yǎng)基+2 g/L水解酪蛋白+0.3 mg/L 6BA+2.5 mg/L 2，4D，研究KT對(duì)胚狀體的發(fā)生與成熟的影響。在無(wú)菌條件下，用鑷子將胚性愈傷組織掰成直徑為2 mm的小塊，然后再放到培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿里放20塊，培養(yǎng)36 d后，計(jì)數(shù)成熟胚狀體的數(shù)量，再將成熟胚狀體移到不含任何生長(zhǎng)激素的1/2MS+0.3%瓊脂粉+15 g/L蔗糖上，完成生根。

1.2.6 電場(chǎng)處理外植體。將子葉和下胚軸在無(wú)菌條件下放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿放20個(gè)外植體，子葉和下胚軸分別設(shè)3個(gè)重復(fù)，共54個(gè)培養(yǎng)皿，1 080個(gè)外植體，取子葉和下胚軸各3個(gè)培養(yǎng)皿放在高壓靜電場(chǎng)的2平行極板間，其具體操作如圖1。在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)7 d后，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上愈傷組織的數(shù)量，20 d后，計(jì)數(shù)胚性愈傷組織的數(shù)量，并將其轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)胚狀體的培養(yǎng)基上。

電場(chǎng)處理外植體后，出愈率明顯提高，特別是在f=3.85 kHz，E=2 kV/cm，T=20 min時(shí)，下胚軸出愈率為91.4%，高于未處理的出愈率81.2%。并且電場(chǎng)處理后的外植體木質(zhì)化程度加強(qiáng)，可能是促進(jìn)木質(zhì)素的沉積使細(xì)胞壁變得堅(jiān)硬牢固，其具體原因需進(jìn)一步去探討。在后續(xù)的試驗(yàn)中，將會(huì)用不同激素濃度組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚狀體，找出誘導(dǎo)分化率的最佳組合。因此，靜電場(chǎng)對(duì)紫花苜蓿外植體的出愈率等均有刺激作用，但其作用機(jī)理仍有待今后繼續(xù)研究。

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