轉(zhuǎn)基因擬南芥中雌激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

胡曉龍等

摘要 [目的]探索雌激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)（XVE）在擬南芥中高效表達(dá)外源蛋白的條件。[方法]構(gòu)建XVEAtNFYA10：3×flag植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥并獲得了陽(yáng)性植株；采用3種不同的誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)外源蛋白的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果]1/2MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)10 d后的擬南芥轉(zhuǎn)基因苗外源融合蛋白表達(dá)量最高，進(jìn)一步研究表明1/2MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)10 d后的擬南芥轉(zhuǎn)基因苗在受誘導(dǎo)后8、16、24和32 h外源融合蛋白均有表達(dá)，在16 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，并持續(xù)到32 h。[結(jié)論]AtNFYA10：3×flag融合外源基因最優(yōu)表達(dá)條件為1/2MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)10 d后的擬南芥轉(zhuǎn)基因苗雌激素誘導(dǎo)16 h。

關(guān)鍵詞 雌激素；轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)；擬南芥；蛋白表達(dá)

中圖分類號(hào) S188；Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）11-03175-04

Abstract [Objective] To optimize the protein expression using an estrogeninduced transcriptional activation system. [Method] The plasmid XVEAtNFYA10：3×flag was constructed and transferred into Arabidopsis， and the positive plants were obtained. Three approaches were used to test the protein expression level. [Results] The data showed that the protein expression level came to a head in tenday old transgenic Arabidopsis on the 1/2 MS medium， and the protein was induced to express 8 hour later， and reach a peak from 16 hours to 32 hours. [Conclusion] The best condition for AtNFYA10：3×flag protein expression in Arabidopsis was tenday old Arabidopsis induced for 16 hours.

Key words Estrogen； Transcriptional activation system； Arabidopsis thaliana； Protein expression

目前已從動(dòng)物、植物、病毒及微生物中分離到許多適用于植物基因工程的啟動(dòng)子。按照其作用方式和功能可分為3類：組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)方式不受時(shí)間、部位、誘導(dǎo)物質(zhì)的影響，在所有組織中都啟動(dòng)基因表達(dá)，在植物基因工程中得到了大量的研究和應(yīng)用。如花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子[1]、水稻肌動(dòng)蛋白基因（actin1）的啟動(dòng)子[2]和玉米泛素基因（ubiquitin）的啟動(dòng)子[3]等都是常用的啟動(dòng)強(qiáng)度很高的組成型啟動(dòng)子。由于不同物種之間有較大差異，不同來(lái)源的強(qiáng)啟動(dòng)子在異源系統(tǒng)中不一定都表現(xiàn)出強(qiáng)驅(qū)動(dòng)能力。CaMV）35S啟動(dòng)子在煙草，擬南芥等雙子葉植物系中都表現(xiàn)出非常高的啟動(dòng)活性，但是在大麥中則幾乎沒(méi)有啟動(dòng)活性[4]。另外由于其表達(dá)比較隨機(jī)，常導(dǎo)致外源基因在植物的全部發(fā)育時(shí)期所有組織中表達(dá)，產(chǎn)生大量異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，加重了植物的合成與代謝負(fù)擔(dān)，阻礙了植物的正常生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致死亡[5]。組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控的基因則只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，此類啟動(dòng)子克服了外源基因在受體植物中非特異性的持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，目前得到了廣泛的研究與應(yīng)用[6-7]。但是如果需要外源基因大量表達(dá)時(shí)，特定組織部位則因表達(dá)量過(guò)低又達(dá)不到預(yù)期效果。誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，是指在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，該種類型的啟動(dòng)子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。與前面2類啟動(dòng)子相比，該類啟動(dòng)子可以快速有效地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因的“開(kāi)、關(guān)”，可根據(jù)需要誘導(dǎo)基因表達(dá)，這樣就不會(huì)造成植物體內(nèi)資源的浪費(fèi)或者在誘導(dǎo)前期過(guò)量表達(dá)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子常以誘導(dǎo)信號(hào)命名，可分為光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、激素誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子等[8]。

雌激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)（XVE）包含2個(gè)控制目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄單元。第1個(gè)轉(zhuǎn)錄單元是強(qiáng)組成型啟動(dòng)子G1090控制的融合基因序列。該融合基因序列由細(xì)菌抑制子LexA（X）的DNA結(jié)合區(qū)、VP16（V）反式激活區(qū)和人雌激素受體（E） 的調(diào)節(jié)區(qū)組成[9]。第2個(gè)轉(zhuǎn)錄單元包括八個(gè)拷貝的LexA啟動(dòng)子序列、46 35S微型啟動(dòng)子[10]以及外源目的基因。在沒(méi)有雌激素存在時(shí)，XVE融合蛋白的人雌激素受體（E） 的調(diào)節(jié)區(qū)與HSP90等胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，作為單體定位在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)有雌激素存在時(shí)，XVE融合蛋白的人雌激素受體（E） 的調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合雌激素，釋放HSP90，并二聚化轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)，與外源目的基因上游8個(gè)拷貝的LexA啟動(dòng)子序列結(jié)合，激活目的基因的表達(dá)[11]。利用報(bào)告基因GFP的研究表明，該系統(tǒng)經(jīng)雌激素誘導(dǎo)之后，GFP的表達(dá)水平比由CaMV 35S驅(qū)動(dòng)的GFP高8倍[9]。XVE系統(tǒng)由于其較低的本底表達(dá)水平以及高效表達(dá)的特性得到了廣泛的研究與應(yīng)用[12]。但是不同的目的基因誘導(dǎo)表達(dá)效率可能不同，獲得表達(dá)量最大的時(shí)間點(diǎn)也可能與GFP有差異。另外以往的研究?jī)H限于對(duì)該系統(tǒng)誘導(dǎo)后目的基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，對(duì)其翻譯水平的檢測(cè)鮮有報(bào)導(dǎo)。因此對(duì)于特定的目的基因在特定的轉(zhuǎn)基因材料里利用該系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的最優(yōu)化誘導(dǎo)條件的探索就顯得很有必要。NFYA是一類結(jié)合CCAATbox的重要轉(zhuǎn)錄因子，包括3個(gè)亞基，NFYA、NFYB和NFYC[13]。在擬南芥中已鑒定了10個(gè)NFYA，13個(gè)NFYB和13個(gè)NFYC基因[14]。NFY家族在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境反應(yīng)中發(fā)揮了重要調(diào)控作用并受到miR169家族成員的調(diào)控[15-16]。實(shí)驗(yàn)室一直致力于miR169/NFYA 模塊調(diào)控功能的研究，其中通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP）方法鑒定NFYA調(diào)控的下游序列是一個(gè)重要環(huán)節(jié)， 能否獲得大量表達(dá)的NFYA蛋白成為試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，同時(shí)也為利用此系統(tǒng)表達(dá)其他蛋白建立一個(gè)技術(shù)體系。鑒于此，筆者以AtNFYA10為目的基因，構(gòu)建由雌激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)（XVE）調(diào)控其表達(dá)的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)擬南芥的培養(yǎng)方式、雌激素使用濃度、施用方法、不同處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量等因素進(jìn)行系統(tǒng)摸索，獲得一套適合于擬南芥中AtNFYA10高效誘導(dǎo)表達(dá)的方法，以期為今后其他同類基因的高效誘導(dǎo)表達(dá)及調(diào)控機(jī)制的解析提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。所用的野生型擬南芥為Col0生態(tài)型，大腸桿菌宿主菌為TOP10，農(nóng)桿菌宿主菌為GV3101，均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑。pER8flag載體，由研究室宗娜博士饋贈(zèng)，在3個(gè)flag序列的5′端有xhoI和BstBI 酶切位點(diǎn)；pEASYT1 Cloning Vector，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Taq DNA Polymerase，購(gòu)自北京澤星生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶，均購(gòu)自NEB公司，T4 DNA連接酶，購(gòu)自Promega公司；麗春紅、Hygromycin B、PMSF和DTT，均購(gòu)自Amresco公司；PVDF膜，購(gòu)自MILLIPORE （Cat.No：ISEQ00010）；雌激素，購(gòu)自Sigma公司（No.E8875，用DMSO溶解成10 mmol/L母液儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆茫?；Protease Inhibitor Cocktail Tablets，購(gòu)自Roche公司（No.04693132001）；Monoclonal ANTIFLAG抗體，購(gòu)自Sigma公司（No.F1804）；熒光二抗Goat antiMouse IR Dye，購(gòu)自O(shè)DYSSEY公司（No.C2102401）；膠回收試劑盒，購(gòu)自Axygen公司；引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。測(cè)序由北京博艾永華生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 AtNFYA10flag融合基因誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)擬南芥AtNFYA10基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)引物YA10flagFW：5′CTCGAGATGCAAACTGAGGAGC3′和YA10flagRV：5′TTCGGATATATTAAGTTTGCAGC AGCC3′，下劃線序列分別為xhoI和BstBI酶切位點(diǎn)。以cDNA作為模板，進(jìn)行AtNFYA10基因CDS全長(zhǎng)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物亞克隆至pEASYT1載體，鑒定正確之后的質(zhì)粒經(jīng)xhoI和BstBI雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pER8flag載體連接，獲得植物表達(dá)載體pER8AtNF10flag，表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主菌TOP10，菌落PCR法篩選出含有目的基因的重組子提取質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)xhoI和BstBI雙酶切鑒定，挑選酶切鑒定正確的質(zhì)粒送測(cè)序。挑選測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)至GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用PCR的方法來(lái)篩選陽(yáng)性重組子。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的獲得。運(yùn)用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥[17]，收取T0代種子，并用25 mg/L Hygromycin B進(jìn)行抗性篩選。具有抗性的轉(zhuǎn)化苗再經(jīng)PCR鑒定，獲得至少3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化的株系。收獲T1代種子再經(jīng)2次篩選獲得T3代純系，用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

1.2.3 擬南芥植株的培養(yǎng)。 ①土培法。營(yíng)養(yǎng)土與蛭石1∶1混勻后將擬南芥幼苗移栽到土中，14 h光照/10 h黑暗，24 ℃/22 ℃（白天/夜間）培養(yǎng)，光照強(qiáng)度250 mEinsteins/m2·s。②水培法。將擬南芥幼苗用Hoaglands營(yíng)養(yǎng)液[18]水培，培養(yǎng)條件同上。③1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)。將擬南芥種子用70%乙醇+0.05%Triton X100溶液浸泡振蕩10 min后倒掉液體，再用95%乙醇清洗3次后用無(wú)水乙醇清洗1次，種子晾干后均勻播撒到1/2MS培養(yǎng)基上。置于24 h光照，24 ℃條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度250 mEinsteins/m2·s。

1.2.4 雌激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因擬南芥表達(dá)外源AtNFYA10：3×flag融合蛋白。①土培材料的誘導(dǎo)處理。取轉(zhuǎn)基因擬南芥3個(gè)株系的T3代純系種子為材料，土培生長(zhǎng)1個(gè)月后，用50 μmol/L雌激素噴灑葉片進(jìn)行誘導(dǎo)。取16 h處理的擬南芥葉片3～4片放入加了小鋼珠的1.5 ml離心管中，液氮中迅速冷凍，于-70 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，進(jìn)行后續(xù)的westernblot檢測(cè)，每個(gè)試驗(yàn)做3次生物學(xué)重復(fù)。②水培材料的誘導(dǎo)處理。取轉(zhuǎn)基因擬南芥3個(gè)株系的T3代純系種子為材料，Hoaglands營(yíng)養(yǎng)液水培生長(zhǎng)1個(gè)月后，用50 μmol/L雌激素噴灑葉片，并在培養(yǎng)液中加入5 μmol/L雌激素進(jìn)行誘導(dǎo)處理。取16 h處理的擬南芥葉片3～4片放入加了小鋼珠的1.5 ml離心管中，液氮中迅速冷凍，于-70 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫M(jìn)行后續(xù)的western-blot檢測(cè)，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。③固體培養(yǎng)基培養(yǎng)材料的誘導(dǎo)處理。取轉(zhuǎn)基因擬南芥3個(gè)株系的T3代純系種子為材料，放入無(wú)抗1/2MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)10 d后，轉(zhuǎn)移至加有5 μmol/L雌激素的1/2MS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)。取16 h處理的擬南芥幼苗3～4棵放入加了小鋼珠的1.5 ml離心管中，液氮中迅速冷凍，于-70 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，進(jìn)行后續(xù)的western-blot檢測(cè)，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。然后對(duì)3個(gè)株系進(jìn)行進(jìn)一步處理并于0、8、16、24和32 h分別取樣進(jìn)行westernblot檢測(cè)，每個(gè)試驗(yàn)同樣進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 AtNFYA10：3×flag融合蛋白表達(dá)量的Westernblot檢測(cè)。①植物總蛋白的提取。從-70 ℃冰箱中取出凍存材料，研磨至細(xì)末狀，加入100 μl的蛋白提取緩沖液（50 mmol/LTrisHCl，pH 8.0；120 mmol/L NaCl；10% Glycerol；Triton X100；5 mmol/L PMSF；10 mmol/L DTT；1×Protease Inhibitor Cocktail），劇烈振蕩十幾秒鐘，冰浴十幾秒鐘后繼續(xù)振蕩，反復(fù)多次直至混勻；4 ℃，14 000 r/min，離心15 min后于冰上吸取上清備用。②蛋白免疫印記（Western blot）。SDSPAGE膠的配置及樣品處理、上樣及轉(zhuǎn)膜等步驟參照Handbook of Immunoblotting of Proteins [19]，待轉(zhuǎn)膜結(jié)束，將PVDF膜取下，放入盛有麗春紅溶液的培養(yǎng)皿中，染色1～2 min；清水洗滌2～3遍，用熒光照相系統(tǒng)（Chemi DOCIt Imaging System，UVP）照相，選取Rubisco的大亞基為上樣對(duì)照；然后將PVDF膜放于用PBST配置的5%脫脂奶粉封閉液中，于搖床上室溫封閉處理2 h，加入一抗（1∶5 000），4 ℃振蕩過(guò)夜后PBST洗滌3次，每次5 min；加入二抗（1∶5 000），室溫遮光60 min，TBST洗滌3次，每次5 min；最后用ODYSSEY熒光照相系統(tǒng)對(duì)PVDF膜掃描，獲得目的蛋白的熒光條帶。

1.2.6 Western blot數(shù)值分析。以Rubisco大亞基蛋白麗春紅染色條帶作為上樣對(duì)照，用Image J軟件對(duì)麗春紅和熒光條帶進(jìn)行定量處理[20]，熒光條帶值除以麗春紅條帶值所得數(shù)值即為樣品所含目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以此數(shù)值再進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌激素誘導(dǎo)表達(dá)AtNFYA10：3×flag擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的獲得 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥Col0花蕾，收獲種子后播種于含有25 mg/L Hygromycin的1/2 MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)1月左右，挑選抗性小苗轉(zhuǎn)移到蛭石基質(zhì)培養(yǎng)，待小苗長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)取葉提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，鑒定陽(yáng)性的植株收獲T1代種子。圖1為轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定結(jié)果，所用引物為YA10flagFW：5′CTCGAGATGCAAACTGAGGAGC3′和PER8R：5′GAAACCGATGATACGGAC3′。共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系20個(gè)（圖1）。隨機(jī)取其中3個(gè)繼續(xù)培養(yǎng)獲得T3代純系，以此為材料進(jìn)行下一步的研究。

2.2 不同培養(yǎng)方式雌激素誘導(dǎo)外源AtNFYA：3×flag融合蛋白表達(dá)的分析 分別對(duì)3種培養(yǎng)方式培養(yǎng)的3個(gè)擬南

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)研究表明，在1/2MS培養(yǎng)基中24 h光照連續(xù)培養(yǎng)10 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗，經(jīng)5 μmol/L雌激素誘導(dǎo)培養(yǎng)至16 h，受轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)XVE調(diào)控的NFYA10：3×flag融合蛋白表達(dá)量達(dá)到最高峰，然后略有下降后一直持續(xù)到32 h這個(gè)時(shí)間段都維持一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài)。也對(duì)土培法生長(zhǎng)一個(gè)月的轉(zhuǎn)基因材料用50 μmol/L雌激素噴灑葉片的方式及水培法生長(zhǎng)一個(gè)月的轉(zhuǎn)基因材料用50 μmol/L雌激素噴灑葉片和5 μmol/L雌激素灌根的方式誘導(dǎo)后進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果表明在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10 d的幼苗對(duì)雌激素的應(yīng)答最為敏感，外源基因的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生長(zhǎng)了1個(gè)月的擬南芥苗。因此選定1/2MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)10 d后的擬南芥轉(zhuǎn)基因苗雌激素誘導(dǎo)16 h為最優(yōu)的AtNFYA10：3×flag融合基因表達(dá)條件，為后續(xù)的試驗(yàn)工作的順利進(jìn)行提供了條件，也為利用此系統(tǒng)表達(dá)其他外源蛋白提供了一個(gè)參考。同時(shí)根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果顯示出采用雌激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同的生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)于雌激素的誘導(dǎo)響應(yīng)水平存在差異。這在研究文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道。其中的原因還有待進(jìn)一步闡明。

利用雌激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)（XVE）誘導(dǎo)外源基因在擬南芥以及西紅柿轉(zhuǎn)基因植株中大量表達(dá)在科學(xué)研究中得到廣泛的研究與應(yīng)用。但由于雌激素與植物內(nèi)源雌激素形成共軛雌激素后會(huì)導(dǎo)致雌激素對(duì)該系統(tǒng)的誘導(dǎo)失效。所以該系統(tǒng)不適用于如大豆等內(nèi)源雌激素水平高的植物物種中。另外由于雌激素大量使用會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染以及雌激素受光照后不穩(wěn)定[21]，此系統(tǒng)不適合應(yīng)用于要進(jìn)行田間實(shí)驗(yàn)的植物中。所以開(kāi)發(fā)表達(dá)效率更高應(yīng)用范圍更廣泛的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)也顯得很有必要。

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