Plackett睟urman和Box睟enhnken Design設(shè)計優(yōu)化促進紅松多酚合成誘導(dǎo)條件的研究

劉冉 王振宇 尹紅力 李婷婷

摘要 [目的]優(yōu)化促進紅松多酚合成的誘導(dǎo)條件。[方法]以紅松不定芽為試驗材料，通過單因素試驗、PlackettBurman 設(shè)計試驗和BoxBenhnken Design設(shè)計試驗研究8種誘導(dǎo)子（苯丙氨酸、肉桂酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、殼聚糖、酵母提取物、鑭、銪）對紅松不定芽中多酚合成的影響，并且對促進多酚合成的誘導(dǎo)子組合條件進行優(yōu)化。[結(jié)果]除了肉桂酸外， 其他7種誘導(dǎo)子都能不同程度地提高多酚含量。PlackettBurman 試驗確定了3種影響多酚合成的關(guān)鍵因素：殼聚糖、鑭和茉莉酸甲酯。BoxBenhnken Design試驗對3種關(guān)鍵因素（殼聚糖、鑭、茉莉酸甲酯）協(xié)同作用的誘導(dǎo)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化得到的最佳誘導(dǎo)條件為：殼聚糖濃度79.58 mg/L、鑭濃度42.21 μmol/L、茉莉酸甲酯濃度16.63 μmol/L，預(yù)測多酚含量最高可達到14.28 mg/g，實際多酚含量為13.42 mg/g，與對照組相比提高了122.19%。[結(jié)論]PlackettBurman 設(shè)計結(jié)合BoxBenhnken Design響應(yīng)面分析法可以很好地對促進多酚合成的誘導(dǎo)條件進行優(yōu)化，3種誘導(dǎo)子（殼聚糖+鑭+茉莉酸甲酯）協(xié)同組合比單一誘導(dǎo)子更有效地提高紅松不定芽中多酚含量，更有利于地促進多酚的合成。

關(guān)鍵詞 紅松；多酚；誘導(dǎo)子；協(xié)同作用

中圖分類號 S791.26；Q946.889 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）27-09269-05

Optimization of Induction Conditions of Promoting the Synthesis of Polyphenols from Pinus koraiensis by PlackettBurman and BoxBenhnken Design

LIU Ran¹， WANG Zhenyu1，2*， YIN Hongli¹et al

（1. College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Abstract [Objective]The research aimed to optimize the induction condition of promoting the synthesis of polyphenols of Pinus koraiensis. [Method]The adventitious buds of Pinus koraiensis were used to study the effects of 8 inductors on the synthesis of polyphenols by singlefactor test， PlackettBurman design test and BoxBenhnken design test. 8 kinds of inductors were phenylalanine， cinnamic acid， methyl jasmonate， salicylic acid， chitosan， yeast extract， lanthanum and europium. The condition of promoting the synthesis of polyphenols inducers combination was optimized. [Result]Besides cinnamic acid， 7 kinds of inductors could improve the content of polyphenols in different degrees. 3 kinds of key factors which influenced the synthesis of polyphenols were established by PlackettBurman design test： chitosan，lanthanum and methyl jasmonate. The induciton conditions with 3 kinds of key factors were optimized by BoxBenhnken design test. The optimal induction condition was as follows： chitosan concentration 79.58 mg/L， lanthanum concentration 42.21 μmol/L and methyl jasmonate 16.63 μmol/L. The predicted value of the content of polyphenols was 14.28 mg/g and its experimental value was 13.42 mg/g. Compared with the control group， the content of polyphenols was increased by 122.19%. [Conclusion]The combination of PlackettBurman design and BoxBenhnken design response surface analysis could optimize the induction condition of promoting the synthesis of polyphenols well. The combination of 3 inductors （chitosan+lanthanum+methyl jasmonate） could more effectively improve the content of polyphenols， be more conducive to promote the synthesis of polyphenols than a single inductor in adventitious buds of Pinus koraiensis.

Key words Pinus koraiensis； Polyphenols； Inductor； Synergy

紅松（Pinus koraiensis）是中國東北地區(qū)的優(yōu)勢樹種，是一種藥用裸子植物，具有極高的經(jīng)濟價值。多酚類物質(zhì)是從植物中分離出來的一類次生代謝產(chǎn)物。由于其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它具有顯著的生理活性如抗氧化、螯合金屬、調(diào)節(jié)酶的活性、調(diào)節(jié)細胞增殖等，有助于預(yù)防癌癥和心腦血管疾病的發(fā)生^[1-2]。紅松多酚可以作為一種天然、無毒、高效的抗氧化劑廣泛應(yīng)用于食品、保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域，因此如何采取有效的措施提高紅松多酚含量具有重要的意義。在植物次生代謝過程中，某些生物誘導(dǎo)子（如酵母提取物、真菌菌絲體和植物細胞壁片斷等）或非生物誘導(dǎo)子（如植物激素、稀土元素、紫外線、重金屬等）能作為一種特定的信號，誘導(dǎo)特定基因的表達，從而調(diào)節(jié)植物細胞次生代謝產(chǎn)物的合成^[3]。誘導(dǎo)子目前被廣泛應(yīng)用于植物細胞培養(yǎng)領(lǐng)域來提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)量，有效地促進許多次生代謝產(chǎn)物如萜類、生物堿類、多酚類等物質(zhì)的合成^[4-5]。添加誘導(dǎo)子已被證明是提高植物次生代謝產(chǎn)物的有效方法，而能否利用誘導(dǎo)子之間的相互作用來發(fā)掘更大的植物生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的能力成為新的研究熱點^[6]。筆者首先研究了8種誘導(dǎo)子（苯丙氨酸、肉桂酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、殼聚糖、酵母提取物、鑭、銪）對紅松不定芽多酚中多酚含量的影響，初步篩選有利于多酚合成的誘導(dǎo)子種類和誘導(dǎo)濃度的參考范圍。在此基礎(chǔ)上，采用PlackettBurman 試驗篩選影響多酚含量的關(guān)鍵因素，然后利用響應(yīng)面分析法研究3種誘導(dǎo)子的協(xié)同作用對紅松不定芽中多酚合成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

成熟的紅松種子來源于小興安嶺地區(qū)的伊春紅松林，采集后保存于-4 ℃的冰箱中。

1.2 紅松幼苗的培養(yǎng)

將成熟紅松種子滅菌后剝?nèi)ヅ呷?，將完整胚作為外植體接種在DCR固體培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，將此時誘導(dǎo)生成的紅松不定芽作為各種誘導(dǎo)子處理的原材料。

1.3 誘導(dǎo)子處理

將苯丙氨酸、肉桂酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、殼聚糖、酵母提取物、硝酸鑭、氧化銪8種誘導(dǎo)子配制成溶液，過濾、滅菌后添加到DCR培養(yǎng)基，使得最終培養(yǎng)基中誘導(dǎo)子濃度達到設(shè)計的不同濃度梯度，以未添加誘導(dǎo)子作為對照。所有的處理設(shè)3次重復(fù)。每個培養(yǎng)瓶中接種6株紅松不定芽，25 ℃黑暗培養(yǎng)8 d后收獲，測定鮮重增長率和多酚含量。

1.4 紅松不定芽鮮重增長率的測定

鮮重增長率=[（收獲重量-初始重量）/初始重量]×100%

1.5 多酚提取和含量測定

多酚提取采用超聲波提取法，收集培養(yǎng)8 d的新鮮紅松不定芽約1.0 g進行液氮研磨，加入 20 ml濃度60%乙醇提取液，超聲功率150 W、溫度30 ℃提取2 h后，在5 000 r/min下離心10 min，定容到25 ml容量瓶中，即為多酚提取液。

取2 ml多酚提取液，用蒸餾水定容到10 ml容量瓶中，作為多酚含量測定樣品。具體方法按照參考文獻[7]的方法進行。沒食子酸作為標準樣品，其標準曲線為：

y=0.011 1x（R²= 0.999 2）

式中，x為沒食子酸濃度，μg/ml。

1.6 PlackettBarman法篩選影響多酚合成的主要因素

選用試驗次數(shù)N=7的PlackettBurman試驗設(shè)計，考察了苯丙氨酸、鑭、銪、水楊酸、酵母提取物、殼聚糖、茉莉酸甲酯7個因素，每個因素取2個水平，以多酚含量Y（mg/g）為響應(yīng)值。每個因素取2個水平：低水平“-1”和高水平“+1”。采用minitab 15.0對數(shù)據(jù)進行回歸分析。

1.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)PlackettBarman試驗結(jié)果，利用Minitab15.0軟件，根據(jù)BoxBenhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計殼聚糖濃度、鑭濃度、茉莉酸甲酯濃度三因素三水平響應(yīng)面分析試驗，優(yōu)化殼聚糖+鑭+茉莉酸甲酯協(xié)同作用的誘導(dǎo)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種誘導(dǎo)子對紅松多酚含量影響的單因素試驗

2.1.1 前體物質(zhì)對紅松多酚合成的影響。

多酚作為一類重要的次生代謝產(chǎn)物，通過苯丙烷代謝途徑合成。苯丙烷代謝途徑上的第一步反應(yīng)是L苯丙氨酸在PAL催化形成反式肉桂酸，是苯丙烷代謝途徑上的第一個反應(yīng)，因此苯丙氨酸和肉桂酸是松多酚合成重要的前體物質(zhì)^[8]。

由圖1可知，紅松不定芽中多酚含量隨苯丙氨酸濃度的提高呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。當苯丙氨酸的濃度達到2.00 mmol/L時，多酚含量達到最大值，為（9.47±0.47）mg/g，與對照組相比提高56.79%，說明2.00 mmol/L最有利于紅松不定芽中多酚類物質(zhì)的合成。高濃度的苯丙氨酸（600 mmol/L）處理紅松不定芽，多酚含量低于對照組。這是由于高濃度的苯丙氨酸對紅松不定芽細胞產(chǎn)生毒害作用，使得細胞活力降低，多酚合成的能力也降低。因此，苯丙氨酸的最佳添加濃度為2.00 mmol/L。

由圖2可知，低濃度（0.05～0.20 mmol/L）的肉桂酸對紅松不定芽多酚含量的影響與對照組相比無明顯差異，而高濃度（0.50～2.00 mmol/L）的肉桂酸顯著降低了多酚含量。結(jié)果表明，前體物質(zhì)肉桂酸并不能促進紅松不定芽中多酚的合成，反而對多酚的合成起抑制作用。

在植物細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，前體物質(zhì)飼喂是一種常見且有效地提高次生代謝產(chǎn)物合成的手段。郭麗梅等^[9]研究了前體物質(zhì)對粉葛（Pueraria Lobata）細胞次生代謝的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度的苯丙氨酸對總黃酮積累有較大的促進作用，而肉桂酸對粉葛細胞中黃酮含量的影響不明顯。這與該試驗結(jié)果基本一致。

2.3.3 回歸模型的驗證。

考慮到實際操作的可行性，將紅松多酚合成的優(yōu)化條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為殼聚糖濃度80 mg/L、鑭濃度42 μmol/L、茉莉酸甲酯濃度17 μmol/L，在此條件下進行3組平行試驗，多酚的平均含量為13.42 mg/g，相對誤差為6.02%，略低于預(yù)測值。通過殼聚糖+鑭+茉莉酸甲酯協(xié)同組合，與3種單一誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)效果進行比較。由表4可知，殼聚糖+鑭+茉莉酸甲酯協(xié)同作用更有利于紅松不定芽中多酚含量的提高，對多酚合成的促進效果最佳。

3 結(jié)論

該研究選取8種誘導(dǎo)子，研究對紅松不定芽中多酚合成的影響，其中苯丙氨酸和肉桂酸屬于前體物質(zhì)，茉莉酸甲酯和水楊酸屬于植物激素，殼聚糖和酵母提取物屬于生物誘導(dǎo)子，鑭和銪屬于稀土元素。單因素試驗結(jié)果表明，除了肉桂酸不能提高紅松不定芽中多酚含量以外，其他7種誘導(dǎo)子都能在不同程度提高多酚含量，促進多酚合成。PlackettBurman試驗結(jié)果顯示，7種誘導(dǎo)子因素影響多酚含量的顯著性大小依次為殼聚糖>鑭>茉莉酸甲酯>苯丙氨酸>銪>水楊酸>酵母提取物，確定影響多酚含量的3種關(guān)鍵因素為殼聚糖、鑭、茉莉酸甲酯。通過對殼聚糖-鑭-茉莉酸甲酯組合誘導(dǎo)條件進行BoxBenhnken Design響應(yīng)面優(yōu)化試驗，優(yōu)化得到的最佳誘導(dǎo)條件為殼聚糖濃度79.58 mg/L、鑭濃度4221 μmol/L、茉莉酸甲酯濃度16.63 μmol/L，預(yù)測多酚含量最高可達14.28 mg/g，實際多酚含量為13.42 mg/g，與對照組相比提高122.19%。同時，3種誘導(dǎo)子（殼聚糖+鑭+茉莉酸甲酯）協(xié)同組合比單一誘導(dǎo)子具有更佳的誘導(dǎo)多酚合成的效果。因此，利用誘導(dǎo)子之間的協(xié)同作用是一種有效的提高植物生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物合成能力的途徑。

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