液相色譜法快速測定雞肉中氧氟沙星手性對映體殘留量

葉宇飛等

摘 要：建立了雞肉樣品中氧氟沙星對映體液相色譜熒光檢測（liquid chromatography fluorescence detector，

LC-FLD）殘留量快速分析方法。雞肉樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取后，用C18固相萃取小柱凈化，洗脫液吹干后用流動相復(fù)溶即可進行液相色譜分析。分析時采用LeapsilTM C18色譜柱，以水相（含2 mmol/L硫酸銅和2.5 mmol/L異亮氨酸，pH3.5）和甲醇作為流動相進行梯度分析，熒光檢測器檢測，其中激發(fā)波長為297 nm，發(fā)射波長為487 nm，外標(biāo)法定量。本方法在5.0、50、100 μg/kg和150 μg/kg 4 個添加水平下，左氧氟沙星對映體平均添加回收率在75.5%～86.1%之間，批內(nèi)變異系數(shù)在1.97%～4.42%之間，批間變異系數(shù)在3.02%～6.02%之間；右氧氟沙星對映體平均添加回收率在77.3%～84.9%之間，批內(nèi)變異系數(shù)在2.15%～4.21%之間，批間變異系數(shù)在3.87%～5.84%之間。方法對兩種對映體的檢測限均為1.5 μg/kg，定量限均為5.0 μg/kg。

關(guān)鍵詞：氧氟沙星；手性對映體；液相色譜法；固相萃取

Determination of Residual Ofloxacin Enantiomers in Chicken Muscle by Liquid Chromatography

YE Yu-fei1， Liu Yong-jun2， ZHAO Jian1， Lü Yan1， WU Yin-liang1，*

（1. The Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China；

2. The Center for Animal Disease Control and Prevention， P.R. China， Beijing 100125， China）

Abstract： A method was developed for determining residual ofloxacin enantiomers in chicken muscle by liquid chromatography with fluorescence detection. Samples were extracted with phosphate buffer solution. The extract was purified by solid phase extraction （SPE） using a C18 cartridge and the eluent was then dried by nitrogen blowing and dissolved in mobile phase. The analytes were separated on a LeapsilTM C18 column using a mobile phase composed of a mixture of methanol and aqueous solution of （pH 3.5） 2 mmol/L copper sulfate and 2.5 mmol/L isoleucine. Excitation wavelength was 297 nm and emission wavelength was 487 nm. Quantitation was performed by using the external standard calibration method. The average recoveries for the two enantiomers in spiked chicken muscle were 75.5%–86.1% at four fortified levels ranging from 5 to 150 μg/kg， and the intra- and inter-batch coefficients of variation （CVs） were 2.15%–4.21% and 3.87%–5.84%， respectively. The limits of detection （LOD） and quantitation （LOQ） were 1.5 and 5.0 μg/kg for the two enantiomers of ofloxacin， respectively.

Key words： ofloxacin； enantiomers； liquid chromatography； solid phase extraction

中圖分類號：TS251.7 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）05-0025-04

氧氟沙星（ofloxacin），又名氟嗪酸，屬于氟喹諾酮類（fluoroquinolones）抗菌藥，具有抗菌譜廣，組織穿透性好，低濃度即呈現(xiàn)較強的殺菌作用及價格低廉等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于臨床以及畜牧業(yè)生產(chǎn)中。然而，它在動物源性食品中的殘留以及引起病原菌的耐藥性問題已受到普遍的關(guān)注和重視?？涩F(xiàn)對于評估該藥物對健康造成的危害時，僅對該藥物作為純的單一化合物來看等，未考慮該藥物是手性藥物這一特征。而手性藥物不同異構(gòu)體之間在毒性、致畸、致癌、致突變上往往存在差異，必然導(dǎo)致對其危害估計不是過高就是過低?，F(xiàn)生產(chǎn)中仍然大量使用氧氟沙星外消旋體，而大量實驗表明氧氟沙星在實驗動物中的代謝具有立體選擇性[1]，導(dǎo)致氧氟沙星兩對映體含量不一致。因此為安全評估該藥物對人體健康造成的危害，首先應(yīng)建立該藥物在動物組織中的對映體殘留分析方法。

由于氟喹諾酮類抗生素對動物性食品安全的影響較大，目前無論國內(nèi)外對動物性食品中的氟喹諾酮類抗生素殘留的分析方法較多，主要有酶聯(lián)免疫吸附法[2-3]、液相色譜法[4-7]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]等；但對生物樣品中氧氟沙星對映體水平上的分析方法研究多集中在生物體液，而對動物組織中的對映體分析報道國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。氧氟沙星的手性分離方法主要包括采用手性流動相或衍生的方法以及采用手性色譜柱進行分離[10-20]。本實驗采用手性流動相添加劑法實現(xiàn)了氧氟沙星映體的拆分，并在參考前人對動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留分析的基礎(chǔ)上，建立了提取、凈化效果較好，分離較快的雞肉中氧氟沙星對映體殘留量分析方法，該方法的建立為進一步研究氧氟沙星在對映體水平上的毒性毒理、代謝等奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空白雞肉樣品 市購，實驗用肉雞為健康肉雞，體質(zhì)量0.5 kg左右，用藥前測定是否含氧氟沙星。

氧氟沙星（99%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；左旋氧氟沙星（99%） 河南赫福萊生物制藥有限公司；甲醇（色譜純） 美國默克公司；甲酸（色譜純） 美國天地有限公司；Bond Elut C18（200mg3/mL） Varian公司；pH7.0磷酸鹽緩沖液 實驗室自制；其他試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC超高效液相色譜儀 美國Waters公司；SIGMA3K15離心機 北京博勵行有限公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

稱取氧氟沙星和左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品或原藥各100.0 mg于10 mL容量瓶中，分別用甲醇定容至刻度，即成質(zhì)量濃度1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，―18 ℃條件下保存，保質(zhì)期為6 個月。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

用流動相稀釋氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制質(zhì)量濃度分別為2.0、10、20、50、100、200 μg/L和500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

稱取2.0 g雞肉樣品于帶蓋的50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL磷酸鹽緩沖液，然后以10 000 r/min以上的速度均質(zhì)60 s，蓋上蓋子以8 000 r/min的速度離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，同樣步驟重復(fù)提取一次，合并上清液，混勻后取10 mL提取液過已經(jīng)2 mL甲醇、2 mL磷酸鹽緩沖溶液依次活化的C18小柱，待樣品溶液流過固相萃取小柱后，依次用2 mL超純水和2 mL磷酸鹽緩沖溶液淋洗柱子，待全部溶液過柱后，抽干C18小柱，然后用2 mL甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)50℃水浴氮氣吹干后用1.00 mL流動相溶解，過0.22 μm濾膜后進行液相色譜分析。

1.3.3 儀器條件

色譜柱LeapsilTM C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：pH3.5的2 mmol/L硫酸銅溶液（含2.5 mmol/L

異亮氨酸）∶甲醇=9∶1（V/V）；流速0.5 mL/min，

柱溫30℃；進樣量10 μL。激發(fā)波長297 nm，發(fā)射波長487 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離條件的選擇和優(yōu)化

對于氧氟沙星對映體的分離，研究較多，按儀器分主要為毛細管電泳手性拆分和高效液相色譜手性拆分，而應(yīng)用最廣泛最成熟的當(dāng)屬采用手性流動相添加劑法分析氧氟沙星對映體。而當(dāng)采用手性流動相添加劑法時，Cu2+經(jīng)常為配合離子，手性氨基酸為配合劑，手性氨基酸則通常為苯丙氨酸和異亮氨酸。Shao Bing等[18]曾詳細研究了異亮氨酸和硫酸銅溶液的濃度及兩者比例對氧氟沙星對映體的分離影響，確定硫酸銅溶液最佳濃度為4.0 mmol/L，異亮氨酸最佳濃度為5.0 mmol/L，

然而完全按照Shao Bing等[18]建立的方法進行分析時每個樣品分析時間較長，需要25 min， 同時熒光檢測器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）流通池也易堵塞， 為縮短分析時間和解決流通池易堵塞情況，本研究對色譜柱、硫酸銅和異亮氨酸濃度的濃度進行了選擇和優(yōu)化。

為縮短樣品分析時間，本研究首次嘗試采用UPLC對氧氟沙星對映體進行分析。由圖1可知，實驗中當(dāng)色譜柱采用內(nèi)徑較小的Acquity BHE C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）時，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中出現(xiàn)了4個色譜峰，而采用內(nèi)徑較大的色譜柱LeapsilTM C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）時只有2個色譜峰。這一現(xiàn)象目前尚未見相關(guān)報道，而根據(jù)已報道的文獻分析，氧氟沙星僅有2個對映體，因此本實驗采用LeapsilTM C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）進行后續(xù)的流動相優(yōu)化實驗。

優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)降低硫酸銅和異亮氨酸濃度有利于解決熒光檢測器流通池易堵塞問題，因此優(yōu)化實驗時硫酸銅和異亮氨酸的濃度為Shao等[18]優(yōu)化濃度的一半，分別為2 mmol/L和2.5 mmol/L。當(dāng)固定流動相比例（90∶10）和柱溫（40 ℃）時，分離度隨流速升高（0.3～0.7 mL/min）而降低（1.55～1.18），但分析時間逐步縮短；而柱溫對分離度的影響較小，當(dāng)固定流動相比例（90∶10）和流速（0.3 mL/min）時，分離度隨溫度升高（25～45℃）略有改善（1.35～1.45）。而改變流動相比例對分離度影響較大，當(dāng)固定流速0.3 mL/min和柱溫30 ℃時，流動相中有機相從10%變化到12%時，分離度從1.4降為0.94。綜合實驗結(jié)果，本研究中硫酸銅和異亮氨酸最終濃度分別為2 mmol/L和2.5 mmol/L，柱溫30 ℃，流動相中水相有機相比例為90∶10，在此條件下先出峰的為左氧氟沙星，后出峰的為右氧氟沙星。

2.2 前處理條件的選擇

仲鋒曾利用C18固相萃取小柱建立了雞肉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的凈化方法[21]。本研究考慮到該凈化方法較簡單方便，因此參考該方法對雞肉中的氧氟沙星進行了凈化效果實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧氟沙星利用該凈化方法凈化效果較好，當(dāng)采用液相色譜熒光檢測分析時雞肉樣品中不存在明顯的雜質(zhì)峰干擾。

2.3 線性實驗

根據(jù)1.3.1.2節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，對氧氟沙星2 種對映異構(gòu)體在2.0～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)以待測物峰面積對質(zhì)量濃度作圖，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=40 778x+9 772（左氧氟沙星）和y=39 517x+19 587（右氧氟沙星），相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.999 1和0.999 3，說明本方法適用于2 種氧氟沙星對映體殘留量的定量分析。

2.4 回收率、精密度和檢出限

從表1可見，各濃度點平均添加回收率在75.5%～86.1%之間。批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.97%～4.42 %，批間RSD為3.02%～6.02%，可見該方法能滿足現(xiàn)行藥物殘留分析的要求。本方法選擇5.0 μg/kg添加實驗中響應(yīng)最低樣品的信噪比，并按RSN為3計算2種氧氟沙星對映體的檢出限均為1.0 μg/kg，按RSN為10計算定量限均為5.0 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品和添加樣品的色譜圖詳見圖1。

2.5 方法應(yīng)用

利用該方法進行了氧氟沙星外消旋體在雞體內(nèi)氧氟沙星立體選擇性降解行為試驗，停藥后1 d測定雞肉中氧氟沙星2 個對映體含量，發(fā)現(xiàn)左旋體含量為0.021 μg/g（n=3），右旋體含量為0.012 μg/g（n=3），可見氧氟沙星外消旋體在雞體內(nèi)降解存在立體選擇性。

3 結(jié) 論

本研究建立了雞肉中氧氟沙星對映體的快速測定LC-FLD

方法。雞肉樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取后，通過C18固相萃取小柱凈化，凈化后的樣品利用手性流動相添加劑法在色譜柱上分離對映體，進行LC-FLD法測定。該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點，利用該方法可為進一步開展氧氟沙星在對映體水平上的毒性毒理、代謝等研究奠定基礎(chǔ)。

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