無籽沙糖橘CrS1—1基因的克隆與表達(dá)分析

吳秀蘭 何思欣

摘 要 為研究顯花植物自交不親和的分子機(jī)理，以無籽沙糖橘為試材，克隆無籽沙糖橘花粉S1基因的cDNA和DNA全長序列，命名為CrS1-1，該基因cDNA和DNA全長均為450 bp。半定量PCR分析結(jié)果表明，該基因在花粉中特異表達(dá)。Real-time PCR分析表明，該基因在無籽沙糖橘自花授粉72h表達(dá)量達(dá)到最大，而無籽沙糖橘×有籽沙糖橘異花授粉72 h的表達(dá)量最低。

關(guān)鍵詞 無籽沙糖橘；自交不親和性；CrS1-1；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S666 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning and Function Analysis of CrS1-1 Gene in

Citrus reticulata Blanco cv. Wuzishatangju

WU Xiulan*， He Sixin

College of Life Science， Zhaoqing University， Zhaoqing， Guangdong 526061， China

Abstract In this study， the full-length sequences of cDNA and DNA of CrS1-1 gene were obtained from a mandarin Wuzishatangju（Citrus reticulata Blanco）. The length of cDNA or DNA is 450 bp. Tissue-specific expression of CrS1-1 was detected using semi-quantitative RT-PCR and quantitative real-time PCR. CrS1-1 expressed exclusively in anthers. When 'Wuzishatangju' was self-pollinated， the expression level of CrS1-1 in pistils reached a maximum at 72 h， and decreased thereafter. While in cross-pollination of‘Wuzishatangju× ‘Shatangju， the expression was very weak at 72 h.

Key words Wuzishatangju； Self-incompatibility； CrS1-1； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.020

植物自交不親和性（Self-incompatibility，SI）是顯花植物為防止近親繁殖、促進(jìn)異花授粉而形成的一種機(jī)制，是分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。根據(jù)遺傳背景可將SI分為配子體自交不親和（Gemetophytic self-incompatibility，GSI）和孢子體自交不親和（Sporophytic self-incompatibility，SSI）。果樹自交不親和大多屬于GSI自交不親和，主要由花柱S-RNase基因和花粉F-box基因關(guān)鍵因子決定[1-6]。除了花粉和花柱關(guān)鍵因子外，還有很多非關(guān)鍵因子，如鈣結(jié)合蛋白（CaBP）[7-8]、泛素結(jié)合蛋白（actin-bing proteins）[9]、鋅指蛋白（Zinc-finger protein）[10]、HT-B[11-12]、γ-硫堇（γ-thionin，MdD1）[13]、S1 Protein等[14]可能也參與自交不親和反應(yīng)。這些非關(guān)鍵因子在花粉和花柱相互識(shí)別過程中，可能起到識(shí)別和降解S-RNase、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)花粉管生長等作用，最終由關(guān)鍵因子與非關(guān)鍵因子共同作用而導(dǎo)致自交不親和的發(fā)生[6，11，15-16]。Foote等[14]通過虞美人（Papaver rhoeas L.）離體及活體花粉萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)S1蛋白可以抑制S1基因型的花粉萌發(fā)，而不能抑制非S1基因型的花粉萌發(fā)，認(rèn)為S1蛋白參與了自交不親和性反應(yīng)。但在柑橘研究中，關(guān)于S1蛋白在自交不親和反應(yīng)中的作用尚未見報(bào)道。本研究以無籽沙糖橘成熟花粉為試材，克隆無籽沙糖橘S1基因cDNA和DNA的全長序列，命名為CrS1-1。并分析了該基因在不同組織器官、自交及異交授粉后不同時(shí)段的表達(dá)特性， 為研究S1蛋白在自交不親和反應(yīng)中的作用及柑橘選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，于2012年春季取無籽沙糖橘7個(gè)器官（芽、葉、花粉、花絲、柱頭、花柱、子房），以及無籽沙糖橘自交授粉、無籽沙糖橘×有籽沙糖橘異花授粉后不同時(shí)段（0、12、24、48、72、96、120、144 h）的雌蕊。所有材料液氮速凍后，于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA、基因組DNA的提取及其cDNA第一鏈的合成 基因組DNA提取采用CTAB法[17]，并略加改進(jìn)。總RNA提取采用天恩澤公司的Column Plant RNAOUT試劑盒進(jìn)行，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。cDNA第一鏈合成參照Life Technology公司生產(chǎn)的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。RNA酶抑制劑（RNase Inhibitor）及DNase I（RNase Free）購于TaKaRa公司。

1.2.2 S1基因的克隆 S1采用3′和5′RACE法克隆：根據(jù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)甜橙基因組S1（Cs8g11080）序列，分別設(shè)計(jì)特異引物S1-3′ RACE和S1-5′ RACE（表1）。嚴(yán)格按照Clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit操作說明進(jìn)行。用Agarose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）回收PCR產(chǎn)物，連接到pMD19-T vector（TaKaRa）克隆載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株，PCR檢測并酶切鑒定后送北京華大基因（BGI）公司測序。

S1基因cDNA全長克隆：利用生物軟件DNA Man將5′ RACE、3′ RACE測序結(jié)果，以及甜橙Cs8g11080序列進(jìn)行拼接，并用ORF Finder（Open Reading Frame Finder）進(jìn)行ORF預(yù)測。設(shè)計(jì)包含起始密碼和終止密碼的上、下游引物S1-F和S1-R（表1），對預(yù)測ORF進(jìn)行驗(yàn)證。以花粉cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10×PCR buffer 5.0 L，dNTP 1.0 L，上下游引物各0.5 L，模板cDNA 1 L，ExTaq 0.5 L，加ddH2O至總體積50 L。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；厥?、轉(zhuǎn)化及測序同上。

S1基因組DNA全長的克?。悍椒ㄅc擴(kuò)增cDNA全長相同。

通過NCBI中BLASTx進(jìn)行S1蛋白同源性搜索與比對，利用Clustal X軟件進(jìn)行同源性分析，使用MEG 5軟件UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 利用TOYOBO公司的7300 Real-time PCR擴(kuò)增儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)，熒光染料試劑盒用SYBR Premix Ex Taq。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于Real-time PCR分析，引物為QS1-F和QS1-R（表1）。以ACTB為內(nèi)參引物（表1）。擴(kuò)增體系為20 μL：SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板cDNA 20 ng，加ddH2O至20 μL。Real-time PCR擴(kuò)增程：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s，40 cycles，每次循環(huán)在第3步采集熒光。內(nèi)參基因和待測基因均設(shè)置3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成

采用柱式植物RNAout（TIANDZ）提取無籽沙糖橘花器官總RNA后，取5 μL點(diǎn)樣于1.2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，28S RNA與點(diǎn)樣孔之間無明顯亮帶，說明無DNA污染；28S RNA和18S RNA條帶清晰明亮，并且5S RNA可見，說明提取的總RNA完整，無降解，適宜進(jìn)行后續(xù)的cDNA第一條鏈的合成。

2.2 S1基因的克隆與序列分析

根據(jù)S1基因（Cs8g11080）序列設(shè)計(jì)的特異引物S1-3′ RACE和S1-5′ RACE，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2-A、B），克隆測序后分別得到486 bp的3′ 端（圖2-A），以及366 bp的5′ 端（圖2-B）序列。將克隆得到RACE序列與Cs8g11080中間序列進(jìn)行拼接，得到450 bp（圖2-C），該序列含起始和終止密碼子的S1 ORF。根據(jù)拼接所得序列，設(shè)計(jì)特異引物S1-F和S1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2-D），克隆測序后獲得長度為450 bp序列（表2），經(jīng)比對后，發(fā)現(xiàn)該序列與拼接序列相一致。通過NCBI在線比對，發(fā)現(xiàn)該序列與其他植物的S1基因序列具有較高的同源性，可以確定所獲得的基因?yàn)楦涕倩ǚ跾1基因家族中的一員，命名為CrS1-1。

ORF Finder分析表明，CrS1-1基因包含一個(gè)450 bp的完整開放閱讀框，編碼一個(gè)含149個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（表2），推定的分子量為18.13 ku，理論等電點(diǎn)為6.19。

2.3 CrS1-1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用NCBI對CrS1-1氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果見圖3。由圖3可知，CrS1-1基因編碼的蛋白與甜橙S1蛋白（Cs8g11080）同源性最高，達(dá)到99%。其次是擬南芥S1蛋白（NM00112557），同源性為78%。

2.4 半定量與Real-time PCR表達(dá)分析

利用半定量和定量PCR對CrS1-1在無籽沙糖橘不同組織器官，以及自交和異交后不同時(shí)間段雌蕊的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，該基因在芽、葉、花粉中均有表達(dá)，其中花粉的表達(dá)量最高，為特異性表達(dá)。在花柱、花絲、柱頭、子房中基本不表達(dá)（圖4-A）。Real-Time PCR分析結(jié)果見圖4-B，由圖4可知，該基因在花粉中表達(dá)量最高，達(dá)到10.62，而在子房中的表達(dá)量最低，僅為0.21，不同器官的表達(dá)水平排序分別為花粉>葉>花柱>柱頭>芽>花絲>子房。其結(jié)果與半定量結(jié)果基本一致。

由于CrS1-1在花粉中特異性表達(dá)，為研究該基因授粉后的表達(dá)情況，檢測了無籽沙糖橘自花授粉、無籽沙糖橘×有籽沙糖橘異交授粉后8個(gè)不同時(shí)間段的基因表達(dá)水平，Real-time PCR結(jié)果見圖5。雌蕊中無籽沙糖橘自交授粉后0 h基本不表達(dá)，12 h到24 h表達(dá)量上升，48 h到72 h迅速上升，3 d之后有迅速下降，6 d后表達(dá)量降到很低。而在無籽沙糖橘×有籽沙糖橘異交授粉后0 h到48 h呈下降表達(dá)，72 h表達(dá)量迅速下降，之后緩慢上升。

3 討論與結(jié)論

自交不親和性是顯花植物為防止近親繁殖、促進(jìn)異化授粉而形成的一種機(jī)制。研究結(jié)果表明，自交不親和性反應(yīng)是一個(gè)多基因協(xié)同作用的復(fù)雜過程，在模式植物中，除花柱S-RNase和花粉F-box基因（SLF/SFB）2個(gè)自交不親和反應(yīng)關(guān)鍵決定因子外，還有非關(guān)鍵因子如：鈣結(jié)合蛋白、泛素、S1蛋白自交不親和蛋白等也參與其中[4，9，12]。Ye等[18]發(fā)現(xiàn)無籽沙糖橘的阻抑部位在子房，其表現(xiàn)是無籽沙糖橘自交72 h時(shí)花粉管在子房內(nèi)部開始自身盤繞生長，無法接近胚珠，并且向著遠(yuǎn)離胚珠的子房底部盤繞生長。隨后Miao等[19]對S-RNase進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)S-RNase在無籽沙糖橘自交后72 h表達(dá)量達(dá)到最高，120 h以后迅速遞減，168 h幾乎不表達(dá)，而該基因在無籽沙糖橘異交后72 h幾乎不表達(dá)，這與細(xì)胞學(xué)上觀察到無籽沙糖橘自交后72 h出現(xiàn)花粉管卷曲，異交后72 h花粉管正常生長的時(shí)間相吻合。

本研究無籽沙糖橘花粉中克隆到一個(gè)自交不親和CrS1-1基因，半定量PCR結(jié)果表明，CrS1-1基因在無籽沙糖橘上具有明顯的組織器官表達(dá)特異性，與成建紅等[20]在櫻桃上報(bào)道花粉關(guān)鍵基因PaSFB9基因具有組織器官特異性表達(dá)結(jié)果一致，也與薔薇科果樹扁桃（Prunus dulcis）[21]、甜櫻桃（P. avium）[22]和蘋果（Malus×domestica）[23]等植物花粉SFB/SLF基因的表達(dá)特異性一致。Real-time PCR進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該基因在花粉中表達(dá)量明顯高于其它部位，約為葉片的5倍、芽的9倍。無籽沙糖橘自交不同時(shí)段Real-time PCR分析表明，無籽沙糖橘自交后72 h表達(dá)量達(dá)到最高，96 h后迅速遞減，144 h表達(dá)量很低；無籽沙糖橘×沙糖橘異交后不同時(shí)段Real-Time表明異交后72 h表達(dá)很低。這與無籽沙糖橘S-RNase自交及異交不同時(shí)段不同組織表達(dá)結(jié)果相一致，也與細(xì)胞學(xué)上觀察到無籽沙糖橘自交后72 h出現(xiàn)花粉管卷曲而異交后72 h花粉管正常生長的時(shí)間相吻合[18-19]。推測CrS1-1基因參與了關(guān)鍵因子自交不親和反應(yīng)，從而抑制了花粉管的正常生長導(dǎo)致花粉管出現(xiàn)卷曲，不能到達(dá)胚珠完成正常的授粉受精過程，形成無籽果實(shí)。但CrS1-1如何參與關(guān)鍵因子進(jìn)行自交不親和反應(yīng)仍需進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：趙軍明