金鐘藤葉揮發(fā)油化學成分分析及其化感潛力研究

李曉霞等

摘 要 采用水蒸氣蒸餾法提取金鐘藤葉中的揮發(fā)油，利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對金鐘藤葉揮發(fā)油進行分析，并以蘿卜（Raphanus sativus）、萵苣（Lactuca sativa）、水稻（Oryza sativa）和紅尾翎（Digitaria radicosa）為供試植物，采用培養(yǎng)皿濾紙法對金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液的化感效應進行生物測定。經(jīng)GC-MS分析，從金鐘藤葉揮發(fā)油中鑒定出41種化合物，占總油量的95.32%。其中含量較高的為β-欖香烯（24.64%）、β-丁香烯（21.61%）、（Z）-β-香檸檬烯（6.11%）、α-葎草烯（6.00%）、雙環(huán)大牻牛兒烯（5.36%）、植醇（3.24%）、藍桉醇（2.43%）等萜類、醇類等化合物，占揮發(fā)油總量的95.32%。生測結(jié)果顯示，金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對萵苣、蘿卜、水稻和紅尾翎4種受試植物的種子萌發(fā)均產(chǎn)生抑制作用，對萵苣、蘿卜和紅尾翎幼苗生長表現(xiàn)為抑制作用，而對水稻幼苗生長具有顯著促進作用。

關(guān)鍵詞 金鐘藤；葉揮發(fā)油；GC-MS；化感作用

中圖分類號 O657；S451 文獻標識碼 A

Chemical Compositions and Allelopathic Potential of

Volatile Oil from Merremia boisiana

LI Xiaoxia， HUANG Qiaoqiao， FAN Zhiwei *， SHEN Yide *， CHENG Hanting， LIU Lizhen

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture， China/Danzhou Scientific Observing and Experimental Station of Agro-Environment， Ministry of Agriculture， China/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Αbstract Volatile oil was obtained from the leaves of Merremia boisiana by steam distillation method， and main chemical components in the essential oil were identified by gaschromatography-mass. Allelopathy of volatile oil with saturated aqueous solution from M. boisiana on seed germination and seedling growth of 4 accompanying plant， Raphanus sativus， Digitaria radicosa， Oryza sativa and Lactuca sativa was bioassayed by culture dish method.Forty-one compounds were identified from the volatile oils of the inflorescence， accounting for 95.32% of the total volatile oil. The major constituents were identified as β-Elemene（24.64%）， β-Caryophyllene（21.61%）， （Z）-β-Bergamotene（6.11%）， α-Humulene（6.00%）， Bicyclogermacrene（5.36%）， Phytol（3.24%）and Globulol（2.43%）. The biological test results demonstrated that volatile oil of M. boisiana could inhibit the seed germination of all tested plants， and could inhibit the seedling growth of R. sativus， L. sativa and D. radicosa， but promoted the seedling growth of O. sativa.

Key words Merremia boisiana； Leaves of volatile oil； GS-MS； Allelopathy

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.033

金鐘藤[Merremia boisiana（Gagn.） v. Ooststr.]是旋花科（Convolvulaceae）魚黃草屬（Merremia Dennst.）植物，目前已在廣東、海南等地迅速蔓延擴散成災，是我國熱帶地區(qū)新近暴發(fā)的惡性雜草之一[1-2]。金鐘藤主要通過種子和藤莖進行繁殖，一旦成功侵入草地、林地和荒地便可連片生長，可“獨株成片”而形成單優(yōu)勢群落[3]，給生態(tài)環(huán)境造成極大威脅[4-5]。因此，關(guān)于金鐘藤如何入侵及如何迅速占據(jù)強大生態(tài)位的研究成為當下重要的課題。研究發(fā)現(xiàn)，金鐘藤水提物對菜薹種子萌發(fā)有抑制作用[6]，說明這與其含有豐富的次生代謝物質(zhì)有關(guān)；其次，高廣春等[7]對金鐘藤的酚類化合物進行研究，發(fā)現(xiàn)東莨菪內(nèi)酯和槲皮素具有抑制植物生長和抗菌的作用；最近，2013年黃喬喬等[8]關(guān)于金鐘藤的研究中也認為其化感作用能抑制蔬菜種子的萌發(fā)及伴生植物的生長。綜合上述研究，初步預測化感作用可能促進了金鐘藤的競爭能力。之前，筆者對金鐘藤葉脂溶性成分分析中發(fā)現(xiàn)烯類、醇類、萜類、酚類和酯類等多種具有化感作用的化合物[9]，然而關(guān)于金鐘藤葉揮發(fā)油化學成分及其化感作用的研究尚未展開，因此筆者采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，對其揮發(fā)油主要化學成分進行分析，并采用培養(yǎng)皿濾紙法測定了金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對蘿卜（Raphanus sativus Linnaeus）、萵苣（Lactuca sativa Linnaeus）、水稻（Oryza sativa Linnaeus）和紅尾翎[Digitaria radicosa（J. Presl）Miquel]4種供試植物種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，以明確金鐘藤葉中次生物質(zhì)的化學成分，為揭示它與其他生物之間的化學關(guān)系及闡明它所具有的強大生存競爭能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 金鐘藤葉于2012年7月采自海南省白沙縣。

1.1.2 儀器與試劑 毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HP6890/HP5973 GC/MS聯(lián)用儀）（美國安捷倫公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)）。所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取 取新鮮的金鐘藤葉325.0 mg，按《中華人民共和國藥典》2005年版第一部附錄[10]中的水蒸汽蒸餾方法，對金鐘藤葉的揮發(fā)油進行提取，得到淡黃色油狀物，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，得金鐘藤葉揮發(fā)油0.42 g，得油率為0.13%。

1.2.2 揮發(fā)油GC-MS分析方法 提取所得的揮發(fā)油經(jīng)氯仿溶解后進行氣相色譜和質(zhì)譜測定。

檢測儀器：儀器為美國惠普公司的毛細管氣相色譜G質(zhì)譜聯(lián)用儀（HP6890/HP5973GC/MS聯(lián)用儀）。

氣相色譜條件：色譜柱為ZB-5MSI 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫45 ℃（保留2 min），以5 ℃/min升溫至320 ℃，保持5 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓52.54 kPa，載氣流量1.0 mL/min；分流比50 ∶ 1，溶劑延遲時間為4.0 min。

質(zhì)譜測定條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 236 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍20～500 u。

數(shù)據(jù)處理及質(zhì)譜檢索：通過HPMSD化學工作站，結(jié)合NIST2005標準質(zhì)譜圖庫和WILEY275質(zhì)譜圖庫進行鑒定，采用色譜峰面積歸一化法計算相對含量。

1.2.3 揮發(fā)油化感作用的生物測定 揮發(fā)油化感作用的生物測定方法參照王朋等[11]的方法。取適量金鐘藤揮發(fā)油加入500 mL分液漏斗中，充分震蕩，保持液面有油滴后靜置過夜。取下層清液，即金鐘藤揮發(fā)油飽和水溶液[30 ℃時飽和溶解度為（16.1±3.0）mg/L]用于生物活性測定。

將直徑為9 cm的培養(yǎng)皿洗凈、烘干，鋪2層滅菌定性濾紙，分別加金鐘藤揮發(fā)油飽和水溶液5 mL，以蒸餾水為對照，設3個重復。待濾紙浸濕后將飽滿、大小均勻的蘿卜、萵苣、水稻和紅尾翎種子各20粒放入培養(yǎng)皿中，置于人工氣候箱（濕度70%，溫度為25 ℃，光照時間14 h/d，光照強度20 000 lx）恒溫培養(yǎng)。實驗期間，保持濾紙濕潤。每天觀察并記錄發(fā)芽種子的數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計7 d，計算最終發(fā)芽率（以胚根或胚軸突破種皮達1～2 mm為種子萌發(fā)標準）；7 d之后測定受體植物的根長（胚軸末端至根末端的長度）和苗高（胚軸頂端至幼苗頂端的長度）。

1.3 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計方法

對照抑制百分率=（1-處理/對照）×100%；實驗數(shù)據(jù)采用DPS7.55軟件進行處理，并進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金鐘藤揮發(fā)油的主要化學成分及其相對含量

金鐘藤葉揮發(fā)油化學成分的總離子流如圖1，共分離出58個峰，采用計算機檢索各相應的質(zhì)圖譜，并參考標準圖譜鑒定了41種化合物，占色譜總餾分出峰面積的95.32%，用峰面積歸一化法測定其質(zhì)量分數(shù)，具體結(jié)果見表1。

分析結(jié)果顯示，金鐘藤葉揮發(fā)油化學成分以萜類為主，占總量的85.92%，含量較高的成分依次為β-欖香烯（24.64%）、β-丁香烯（21.61%）、（Z）-β-香檸檬烯（6.11%）、α-葎草烯（6.00%）、雙環(huán)大牻牛兒烯（5.36%）、雅欖藍烯（2.39%）、σ-欖香烯（2.10%）、氧化石竹烯（2.09%）等。其次是醇類，主要有植醇（3.24%）、藍桉醇（2.43%）等，占總量的9.96%。再次是烴類占總量的3.87%。此外，還含有一些酯類（占總量的0.15%）和酮類（占總量的0.081%）。

2.2 金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液的化感作用

2.2.1 金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對4種供試植物種子萌發(fā)的影響 金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對萵苣、蘿卜、水稻和紅尾翎4種供試植物種子萌發(fā)抑制率的影響見圖2。從圖2可以看出，金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對不同受體植物種子萌發(fā)具有不同的化感作用，其中，紅尾翎種子對揮發(fā)油最為敏感，抑制率達45.00%，顯著高于其他處理組；水稻種子萌發(fā)抑制程度僅次于紅尾翎，而揮發(fā)油飽和水溶液對萵苣和蘿卜種子萌發(fā)抑制作用不明顯。

2.2.2 金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對4種供試植物幼苗生長的影響 金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對萵苣、蘿卜、水稻和紅尾翎4種供試植物幼苗生長的影響見圖3。從供試植物來看，金鐘藤揮發(fā)油飽和水溶液對萵苣、蘿卜和紅尾翎根長、莖長都低于對照，說明金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對萵苣、蘿卜和紅尾翎的生長均有抑制作用，其中紅尾翎幼苗的生長受到的抑制作用顯著高于萵苣和蘿卜幼苗的生長，且根長的抑制作用（抑制率為79.99%）強于對莖長的抑制作用（抑制率為66.55%）；而對水稻幼苗生長的影響則表現(xiàn)為促進作用。

3 討論與結(jié)論

本研究對金鐘藤葉揮發(fā)油化學成分分析中發(fā)現(xiàn)β-欖香烯（24.64%）、β-丁香烯（21.61%）、（Z）-β-香檸檬烯（6.11%）、氧化石竹烯（2.09%）等萜類物質(zhì)相對含量占總揮發(fā)油的85.92%是金鐘藤葉揮發(fā)油的主要成分，此外還有植醇（3.24%）、藍桉醇（2.43%）、乙酸金合歡酯（0.15%）等醇、酯類。研究結(jié)果表明，萜類[12-18]、酯類[18-19]、醇類[20-21]和酮類[21]等多種次生代謝物具有化感作用的功能。Nesrine Zahed[12]等對柔毛肖乳香（Schinus molle L.）果和葉揮發(fā)油化學成分及化感作用進行研究，發(fā)現(xiàn)柔毛肖乳香揮發(fā)油化學成分主要為β-phellendrene（35.9-65.4%）、α-phellendrene（24.3-20.1%）、月桂烯（12.8-7.7%）和α-蒎烯（5.9-1.7%）等萜類化合物，其揮發(fā)油對小麥的化感作用呈現(xiàn)濃度效應，且對小麥種子萌發(fā)和根長的抑制效果較強；Bradow&Connick等[13]報道，植物精油中檸檬烯、蒎烯等萜類化合物能強烈抑制種子發(fā)芽和幼苗生長；馬瑞君等[14]對黃帚橐吾[Ligularia virgaurea（Mαxim.）Mattf. ex Rehd. & Kobuski]揮發(fā)物開展了化感作用研究，發(fā)現(xiàn)該植物中含有大量的萜類物質(zhì)，并證實了該物質(zhì)是引起其發(fā)生化感作用的基礎(chǔ)性物質(zhì)；于鳳蘭等[15]對油蒿（Αrtemisiα jαponicα Thunb.）揮發(fā)油化感作用研究中發(fā)現(xiàn)導致影響受體植物種子萌發(fā)和幼芽生長的關(guān)鍵物質(zhì)是萜類物質(zhì)；Muller等[16-17]認為α-蒎烯、氧化石竹烯等萜類不僅能通過呼吸作用影響其它植物生長，還能通過淋溶帶入土壤，從而影響植物種子萌發(fā)和幼苗生長。張曉芳等[18]的研究結(jié)果表明，白三葉草（Trifolium repens L.）揮發(fā)物對稗草和苘麻均有化感作用，其揮發(fā)物的化學成分以烯和酯類化合物為主；Rice等[20]等證實三十烷醇是苜蓿（Medicago sativa L.）對作物起刺激作用的關(guān)鍵物質(zhì)；Αlan等[21]的研究結(jié)果表明，根系分泌的醇類、酮類能抑制和迫害其他植物生長。Weidenhamer等[22]認為揮發(fā)性化感物質(zhì)在水中具有一定的溶解度，且其水溶液有一定的化感作用。本研究中，金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對供試植物表現(xiàn)出較強的生物活性，筆者認為金鐘藤葉揮發(fā)油具有一定的水溶性，且其揮發(fā)油飽和水溶液化學成分中含有多種具潛在化感功能的物質(zhì)，但要明確其具體揮發(fā)性化感成分，還需進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液處理后萵苣、蘿卜、水稻和紅尾翎種植物種子發(fā)芽率都受到抑制，且對紅尾翎的種子發(fā)芽率抑制作用最強；金鐘藤葉揮發(fā)油飽和水溶液對萵苣、蘿卜和紅尾翎幼苗的生長均有抑制作用，而對水稻幼苗的生長表現(xiàn)為促進作用。結(jié)合上述結(jié)果初步證實金鐘藤葉揮發(fā)油具化感作用，然而其葉片揮發(fā)油中何種化合物是致感因子將需進一步深入研究。

參考文獻

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志： 第64（1）卷[M]. 北京： 科學出版社， 1979： 78-79.

[2] 練琚蕍， 曹洪麟， 王志高， 等. 金鐘藤入侵危害的群落學特征初探[J]. 廣西植物， 2007， 27（3）： 482-486.

[3] 朱細儉， 黃少峰. 金鐘藤的初步調(diào)查情況[J]. 廣東林勘設計， 2003（3）： 33-34.

[4] 童國建， 陳沐榮， 余海濱. 金鐘藤的危害性初報[J]. 中國盛林病蟲， 2005， 24（3）： 17-18.

[5] 李鳴光， 成秀媛， 劉 斌. 金鐘藤的快速生長和強光合能力[J]. 中山大學學報， 2006， 45（3）： 70-72.

[6] 曾宋君， 曾 倞， 鄭雪萍， 等. 外來入侵物種金鐘藤的水抽取物對菜薹種子萌發(fā)的影響[J]. 種子， 2005， 24（11）： 22-24.

[7] 高廣春， 吳 萍， 曹洪麟， 等. 金鐘藤中酚類化合物的研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2006， 14（3）： 233-237.

[8] Huang Q Q， Shen YD， Li X X， et al. Native Expanding Merremia boisiana is not more Allelopathic than Its Non～Expanding Congener M. vitifolia in the Expanded Range in Hainan[J]. American Journal of Plant Sciences， 2013（4）： 774-779.

[9] 李曉霞， 范志偉， 沈奕德， 等. 金鐘藤葉石油醚萃取部分脂溶性成分[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學， 2012， 32（9）： 67-71.

[10] 《中華人民共和國藥典》國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[M]. 北京： 化學工業(yè)出版社， 2005： 182.

[11] 王 朋， 王 瑩， 孔垂華. 植物揮發(fā)性單萜經(jīng)土壤載體的化感作用——以三裂葉豚草為例[J]. 生態(tài)學報. 2008， 28（1）： 62-68.

[12] Nesrine Zahed， Karim Hosni， Nadia Ben Brahim， et al. Allelopathic effect of Schinus molle essential oils on wheat germination[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2010， 32（6）： 1 221-1 227.

[13] Bradow J M， Connick W J. Volatile seed germination inhibitors from plant residues[J]. Journal of Chemical Ecology， 1990， 16（3）： 645-666.

[14] 馬瑞君， 王明理， 朱學泰， 等. 黃帚橐吾揮發(fā)物的化感作用及其主要成分分析[J]. 應用生態(tài)學報， 2005， 16（10）： 1 826-1 829.

[15] 于鳳蘭， 馬茂華， 孔令韶. 油蒿揮發(fā)油的化感作用研究[J]. 植物生態(tài)學報， 1999， 23（4）： 345-350.

[16] Muller C H， Haines B L. Volatile growth inhibitors produced by aromatic shrubs[J]. Science， 1964， 143： 471-473.

[17] 王大力， 祝心如. 三裂葉豚草的化感作用研究[J]. 植物生態(tài)學報， 1996： 20（4）： 330-337.

[18] 張曉芳， 王金信， 謝 娜， 等. 白三葉草揮發(fā)物的化感作用及其化學成分分析[J]. 植物保護學報， 2011， 38（4）： 374-378.

[19] Rice E L. Allelopathy[M]. New York： Academic Press， 1974.

[20] Rice S K， Sweeley C C， Leavitt R A. Triacontanol： A new naturally occurring plant grouth regulator[J]. Science， 1977， 165： 1 339-1 341.

[21] Alan R P， Chung S J. The science of allelopathy[M]. The United States of America， 1986： 9-12.

[22] Weidenhamer J D， Macias F Α， Nikolans H， et al. Just how insoluble are monoterpenes？[J]. Journal of Chemical Ecology， 1993， 19（8）： 1 799-1 807.

責任編輯：沈德發(fā)