鴛鴦茉莉不同發(fā)育時(shí)期POD同工酶體系優(yōu)化

陳小琴等

摘 要 以不同花色、不同發(fā)育時(shí)期的鴛鴦茉莉（Brunfelsia acuminate Benth.）花瓣為材料，通過(guò)單因素試驗(yàn)方法，分別以不同濃度及pH值的Tris-HCl和磷酸緩沖液（PBS），獲得提取花瓣中過(guò)氧化物酶（POD）的最佳濃度和pH值，并對(duì)不同花色、不同發(fā)育時(shí)期花瓣的POD活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果分別選出0.4 mol/L Tris-HCl，pH7.0和0.1 mol/L PBS，pH7.0 2種緩沖液組合，其中以后者的提取效果最好，并通過(guò)POD同工酶譜得以證明；不同發(fā)育時(shí)期POD活性：白花>淡紫花>紫花，花瓣顏色褪變與POD活性呈正相關(guān)，且差異均達(dá)顯著水平（p<0.05）；花瓣中不同形態(tài)的POD活性之間差異顯著，可溶態(tài)POD活性遠(yuǎn)大于結(jié)合態(tài)的POD活性。

關(guān)鍵詞 雙色茉莉；過(guò)氧化物酶；同工酶；體系優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào) S682.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

POD Isozyme System Optimization of Brunfelsia acuminate

（Solanaceae）in Different Development Stages

CHEN Xiaoqin， GUO Zhixiong， LIN Lin， WANG Bei， KE Yiyong

WU Jialing， PU Xiaolong， FU Lihong， PAN Dongming*

Institute of Storage Scienci and Technology of Horticultural Products， Fujian

Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract The petals of Brunfelsia acuminata Benth during development stages were used to determine POD activity through single-factor experiment design with different concentration and pH value of Tris-HCl and PBS buffers in the extraction of petal POD to obtain the optimal combination. The results showed that： Among the selected buffers 0.4 mol/L Tris-HCl（pH7.0）and 0.1 mol/L PBS（pH7.0）， he latter was better， which could be confirmed by POD isoenzyme spectrum； POD activity in different development stages was as follows： white > mauve > purple， and POD activity was positively related with the petal color fading with an extremely significant level（p<0.05）； The POD activity of different forms in petals varied considerably； The soluble POD activity exceeded the conjuncted one.

Key words Brunfelsia acuminata； POD； Isoenzyme； System optimization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.011

花色苷（Anthocyanins）作為負(fù)責(zé)顏色從紅到紫和藍(lán)的最大色素群[1]，主要分布在花朵、果實(shí)和葉子的表皮細(xì)胞或皮下細(xì)胞的液泡中，是影響植物色彩表達(dá)的主要因素之一[2]。同時(shí)，花色苷作為植物生長(zhǎng)、發(fā)育期間響應(yīng)外界環(huán)境變化而產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物之一[3]，其生物合成與體內(nèi)降解機(jī)理的闡釋對(duì)其生理生態(tài)功能的揭示有著重要意義[4]。對(duì)于花色苷的生物合成與代謝途徑，生物化學(xué)家已進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究[5-6]。

與花色苷合成途徑方面的深入研究相比，花色苷降解及降解處理方面還知之甚少[7]。花色苷降解分為體外（in vitro）、體內(nèi)（in vivo）降解，分別受不同因素影響[4]。有報(bào)道稱(chēng)，花色苷的體外降解受理化因子制約[8-10]，它的積累、顏色表現(xiàn)及其穩(wěn)定性很大程度受多種因素影響，比如自身化學(xué)結(jié)構(gòu)和濃度、金屬離子絡(luò)合、類(lèi)黃酮濃度、pH條件[11]、溫度和光、輔助色素、酶、氧等[8]。而其體內(nèi)降解過(guò)程至今仍鮮有了解[4]。有研究認(rèn)為，花色苷的體內(nèi)降解應(yīng)是在多種酶催化下完成的[4]，這些酶主要包括β-糖苷酶（β-Glycosidases）、多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）[12-13]。其中，POD是高等植物體內(nèi)重要的代謝酶，參與植物體內(nèi)重要的生理活動(dòng)，與植物的抗性有密切的關(guān)系。

在水果研究中發(fā)現(xiàn)，POD是能使花青素減少的酶[14]。在葡萄酒及葡萄汁的相關(guān)研究顯示，花色苷降解和POD具有相當(dāng)?shù)年P(guān)系[7]。此外，在荔枝采后褐變過(guò)程中，已被證明花色苷的降解與POD活性的逐漸升高相關(guān)[15]。從POD對(duì)花色苷的降解機(jī)理來(lái)看，花色苷不能直接作為POD的底物[4]。與PPO一樣，POD也不能直接氧化降解花色苷，類(lèi)似報(bào)道還見(jiàn)于葡萄[16]和荔枝[17]等果實(shí)，POD均不能直接氧化其花色苷，但花色素卻能作為POD的底物[16-17]。

鴛鴦茉莉（Brunfelsia acuminata Benth.）屬茄科（Solanaceae）鴛鴦茉莉?qū)伲a(chǎn)巴西?；ㄩ_(kāi)放2～5 d，顏色從深紫變?yōu)榘咨?，這個(gè)過(guò)程始于花瓣衰老之前進(jìn)行[1]。因開(kāi)花時(shí)間不同，所以在同一植株上能同時(shí)看到各種不同顏色的花朵，形成獨(dú)特的景觀效果，具有極高的觀賞價(jià)值。研究表明，大花鴛鴦茉莉（Brunfelsia calycina Benth.）花瓣中的花色素主要由錦葵素（Malividin）、矮牽牛素（Petunidin）、花翠素（Delphinidin）組成， 且這些花色素的合成終止于花朵開(kāi)放之前，之后隨著花朵開(kāi)放花色變淺，花色素含量不斷下降[7]。并已證實(shí)這種現(xiàn)象的產(chǎn)生，是由于POD的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)而導(dǎo)致花瓣中花色素苷的降解，這個(gè)過(guò)程需要新mRNA和蛋白質(zhì)的合成，表明POD確實(shí)參與花色苷的體內(nèi)降解，且這一降解先于衰老過(guò)程，是另一個(gè)具特征性、專(zhuān)一性的途徑[4]。Oren-Shamir也認(rèn)為POD和花色苷酶參與了鴛鴦茉莉花色苷的降解[3]。

目前，關(guān)于花色苷的體內(nèi)降解機(jī)制迄今仍不太清楚。雖有研究顯示，花色苷酶（Anthocyanase）、PPO、POD和果膠酶（Pectinase），是參與降解花色苷的主要酶[4]。這在理論上有助于花色苷體內(nèi)降解機(jī)理的解析，實(shí)踐上從控制酶活角度來(lái)促進(jìn)或防止、穩(wěn)定花色苷的降解提供了依據(jù)[4]。而POD參與鴛鴦茉莉花色苷降解的生理生化及分子機(jī)制方面研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)基于POD的角度，主要探討不同pH值及濃度的Tris-HCl和磷酸鹽緩沖液（PBS）對(duì)不同發(fā)育時(shí)期不同花色鴛鴦茉莉中POD活性變化的影響，為下游鴛鴦茉莉中POD的分離純化提供參考，為進(jìn)一步探討鴛鴦茉莉POD參與花瓣中花色苷降解代謝的機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鴛鴦茉莉（Brunfelsia acuminate Benth.），于2013年4月18日取自福建農(nóng)林大學(xué)作物學(xué)院旁，隨機(jī)采取東、南、西、北4個(gè)方向生長(zhǎng)健壯、花色正、花型一致的盛開(kāi)花朵，取花瓣。具體花色如圖1，每種顏色（深紫、淡紫、白色）各稱(chēng)取0.20 g（精確到0.01）。

1.2 方法

1.2.1 Tris-HCl體系優(yōu)化 用不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L）及pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的Tris-HCl緩沖體系。單因素試驗(yàn)：先在0.1 mol/L Tris-HCl濃度下，通過(guò)測(cè)定POD的活性，比較以上5個(gè)pH值梯度下Tris-HCl的提取效率，從中篩選出該濃度下Tris-HCl的最佳pH值。再比較不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L）的Tris-HCl提取花瓣的POD活性。最終獲得Tris-HCl體系提取的最佳pH值和最佳濃度。重復(fù)3次。

1.2.2 PBS體系優(yōu)化 取不同濃度（0.05、0.1、0.15、0.2 mol/L）和pH值（5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的PBS緩沖體系，重復(fù)3次。具體試驗(yàn)步驟同上。

1.2.3 不同結(jié)合狀態(tài)的POD活性比較 不同結(jié)合狀態(tài)POD的提取參照Lee等[18]并加以改進(jìn)。

可溶態(tài)POD提取：取花瓣研究方法0.2 g，加入含0.1 mol/L Tris-HCl，pH6.8（1 ∶ 3 W/V）提取緩沖液，并放置冰上浸提2 h，每20 min用渦旋振蕩器搖15 s。12 000 ×g，4 ℃，5 min，取上清，沉淀再用提取緩沖液洗3次。

結(jié)合態(tài)POD提?。簩⑸弦徊降玫降某恋砑?xì)胞壁蛋白質(zhì)，用600 μL，0.1 mol/L Tris-HCl（含1 mol/L NaCl），pH 6.8提取液。室溫下，振蕩提取2 h。12 000 ×g，4 ℃，5 min，取上清液，即為結(jié)合態(tài)POD。

1.2.4 POD活性測(cè)定 參照愈創(chuàng)木酚比色法[16]加以改進(jìn)。加入1 mL POD反應(yīng)液（0.1 mol/L，pH6.8 PBS，含0.125% H2O2 和0.2%愈創(chuàng)木酚（V/V）；最后加入粗酶液（紫色50 μL、淡紫花10 μL、白花5 μL）啟動(dòng)反應(yīng)，在可見(jiàn)光光度計(jì)470 nm下測(cè)其吸光值變化，反應(yīng)2 min，每5 s取值1次。將每分鐘OD增加0.01定義為1個(gè)活力單位。POD活性單位（U/g FW）。

1.2.5 POD同工酶電泳 采取聚丙烯酰胺凝膠電泳，參考車(chē)建美等[19]研究的方法。染色方法采用醋酸-聯(lián)苯胺染色法[20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差（One-WayANOVA）分析，結(jié)合LSD與Duncan法，經(jīng)方差分析和多重比較計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tris-HCl對(duì)POD活性的影響

2.1.1 0.1 mol/L Tris-HCl的最適pH值確定 由圖2可知，紫花、白花的表現(xiàn)變化趨勢(shì)相同，整體呈先上升后下降，POD活性在pH7.0時(shí)為最高；紫花的POD活性，除與pH7.5相比無(wú)顯著性差異外，比其余pH時(shí)的活性明顯增高，達(dá)顯著水平（p<0.05）（圖2-A）；白花的POD活性在不同pH組間差異均不顯著（圖2-B）。因此，在0.1 mol/L濃度下，最適pH為7.0。

0.1 mol/L Tris-HCl pH7.0時(shí)，白花、紫花的POD單位酶活分別為293.23、14.12（U/g FW）。2色花之間的POD活性差異極顯著（p<0.01），白花是紫花的20倍。說(shuō)明白花的POD活性最大。

2.1.2 pH7.0 Tris-HCl的最適濃度篩選 由圖3可知，紫花、白花的POD活性均隨Tris-HCl濃度的升高而增強(qiáng)，在0.4 mol/L時(shí)達(dá)最高。紫花在Tris-HCl濃度為0.4 mol/L時(shí)與其它濃度達(dá)顯著性差異（p<0.05）；白花在Tris-HCl濃度為0.1 mol/L時(shí)與其它濃度達(dá)顯著性差異（p<0.05）。

對(duì)不同的pH值及濃度Tris-HCl的單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，0.4 mol/L、pH7.0 Tris-HCl可作為進(jìn)一步試驗(yàn)的最佳提取液。

2.2 PBS對(duì)POD活性的影響

2.2.1 0.05 mol/L PBS的最適pH值確定 由圖4可知，紫花、白花pH>7.0的PBS POD活性均明顯增強(qiáng)，紫花pH 8.0與pH 5.8、pH 6.5的POD活性差異顯著（p<0.05），其余差異不明顯；白花pH7.0、pH7.5與pH5.8、pH6.0、pH6.5對(duì)POD活性的影響差異顯著（p<0.05）。因此，0.05 mol/L PBS的最適pH為pH7.0。

2.2.2 pH7.0時(shí)PBS的最適濃度篩選 由圖5可知，紫花、白花的POD活性均呈先升后降；紫花在PBS濃度為0.1和0.15 mol/L與0.05 mol/L達(dá)差異顯著（p<0.05）；白花在PBS濃度為0.05 mol/L與其他濃度差異顯著（p<0.05）。由于PBS濃度越高，越會(huì)產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象，而導(dǎo)致POD的溶解度下降。因此，以濃度0.1 mol/L pH7.0 PBS作為下一步體系優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 進(jìn)一步比較Tris-HCl和PBS對(duì)POD活性的影響

對(duì)Tris-HCl和PBS緩沖體系優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，0.4 mol/L，pH 7.0 Tris-HCl與0.1 mol/L，pH7.0 PBS對(duì)不同花色鴛鴦茉莉花瓣中POD提取效果均較好，進(jìn)一步研究比較二者對(duì)POD活性的影響（圖6）。由圖6可知，隨著花瓣顏色褪去，POD活性不斷增強(qiáng)；白花的POD活性最大，3種顏色花之間的POD活性差異顯著（p<0.05）；用Tris-HCl（0.4 mol/L，pH7.0）和PBS（0.1 mol/L，pH7.0）緩沖體系，都能較好提取紫花、淡紫花中的POD，二者差異不明顯，而對(duì)白花POD活性的影響差異達(dá)顯著水平（p<0.05）。因此，PBS（0.1 mol/L，pH7.0）提取效果較好。

2.4 Tris-HCl和PBS對(duì)POD同工酶的影響

將體系優(yōu)化獲得的Tris-HCl（0.4 mol/L，pH7.0）和PBS（0.1 mol/L，pH7.0）2個(gè)緩沖液，對(duì)3種顏色6個(gè)樣本的鴛鴦茉莉進(jìn)行POD同工酶電泳分析，其電泳圖及相應(yīng)的遷移率模式圖7A～B可以看出：2種緩沖液提取的同工酶譜都較為清楚，但用PBS提取白花，POD酶譜條帶（圖7A-6）更粗且更加明顯。因此，2種緩沖體系對(duì)鴛鴦茉莉花瓣中POD活性的提取效果均較好，但考慮白花的POD活性及今后對(duì)POD的進(jìn)一步純化，以PBS（0.1 mol/L，pH7.0）提花瓣中的POD效果更佳。根據(jù)相對(duì)遷移率的不同，計(jì)算鴛鴦茉莉POD同工酶所有的擴(kuò)增酶帶數(shù)，共找到6條（圖7A：abcdef），遷移率依次為0.044 1、0.161 8、0.274 5、0.328 4、0.5、0.519 6。從紫花到白花的變化，POD活性是上升的，如圖7A（a、e）所示的2條特征酶譜，POD活性明顯增強(qiáng)。

2.5 不同結(jié)合狀態(tài)的POD活性比較

由圖8可知，3種顏色花的可溶態(tài)POD活性的變化，隨緩沖液洗脫次數(shù)的增加而明顯下降，白花、淡紫花、紫花第一次到第二次洗脫下降幅度分別是239.1%、197.2%、94.2%；POD活性下降幅度大小依次是白花>淡紫花>紫花，白花可溶態(tài)POD活性由第一次590.3（U/g FW）降至174.1（U/g FW）。而結(jié)合態(tài)POD，無(wú)論是從哪種花色提取得到的，活性都非常低，說(shuō)明結(jié)合態(tài)的POD在鴛鴦茉莉花瓣中含量都很低。

3 討論與結(jié)論

3.1 鴛鴦茉莉花瓣中POD同工酶體系的建立

鴛鴦茉莉花瓣P(guān)OD同工酶提取的體系優(yōu)化結(jié)果：研磨時(shí)加入20% PVPP，0.4 mol/L，pH7.0 Tris-HCl和0.1 mol/L，pH7.0 PBS提取效果均較好（紫花、淡紫花），但白花以0.1 mol/L pH7.0 PBS為宜。采取聚丙烯酰胺凝膠電泳法，醋酸-聯(lián)苯胺染色法進(jìn)行同工酶的染色。

3.2 鴛鴦茉莉花瓣中POD存在的主要狀態(tài)

不同形態(tài)的POD活性試驗(yàn)可得，不同花色花瓣中的POD活性，可溶態(tài)遠(yuǎn)大于結(jié)合態(tài)，二者差異極顯著；且隨著洗脫次數(shù)增加，可溶態(tài)POD活性急劇下降。說(shuō)明鴛鴦茉莉花瓣中POD的絕大部分是以可溶態(tài)形式存在。因此，對(duì)鴛鴦茉莉花瓣中POD活性地檢測(cè)只需要取第一次粗提液即可。

3.3 鴛鴦茉莉花瓣中POD與花色苷之間的關(guān)系

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，3種顏色的鴛鴦茉莉花花瓣中POD活性，由高到低依次為白花>淡紫花>紫花，不同花色間POD活性差異極顯著（p<0.01）。隨著發(fā)育時(shí)期延長(zhǎng)，紫色褪去，花瓣中POD活性呈不斷上升趨勢(shì)。POD活性與花色的褪變呈正相關(guān)，即花色越淡，POD活性越強(qiáng)，并且其組分活性也發(fā)生了劇烈變化（見(jiàn)圖7 a、e）。此試驗(yàn)結(jié)果初步表明，POD活性變化與鴛鴦茉莉花色變化密切相關(guān)。推測(cè)POD參與了鴛鴦茉莉花色素苷代謝的過(guò)程。這與前人報(bào)道的有關(guān)POD參與了大花鴛鴦茉莉花色素苷降解的結(jié)果一致，即POD活性增強(qiáng)，則花色苷降解，花色褪去[3， 7，15]。但對(duì)于POD如何與花色苷發(fā)生反應(yīng)的機(jī)制沒(méi)有做深入的研究。

鴛鴦茉莉開(kāi)花后，花色在極短時(shí)間內(nèi)（3～5 d）由深紫色變成白色，這為花色苷的體內(nèi)代謝機(jī)制提供了一個(gè)獨(dú)特的研究材料，此外，類(lèi)似的如木芙蓉（Hibiscus mutabilis L.），其花色1日3變，即早晨白色，中午粉紅色，傍晚深紅色。有關(guān)醉芙蓉（木芙蓉的一個(gè)變種）花色變化機(jī)理研究報(bào)道，其花色變化主要是原花青素向花色素轉(zhuǎn)化的過(guò)程，屬于花青素的生物合成；而鴛鴦茉莉的花色變化主要因花色苷的降解引起[21]，二者的代謝途徑不同。

有關(guān)鴛鴦茉莉花瓣中POD參與花色苷降解的機(jī)制機(jī)理目前研究較少。為此，對(duì)不同發(fā)育期鴛鴦茉莉花瓣內(nèi)POD提取液的體系優(yōu)化、及其不同形態(tài)POD活性的測(cè)定極其重要，不僅為以后鴛鴦茉莉POD純化提供參考，也為后續(xù)研究鴛鴦茉莉花色變化的機(jī)理提供一個(gè)切入點(diǎn)。

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責(zé)任編輯：古小玲