HPLC法測定跳骨片中士的寧和馬錢子堿的含量

林武俊 陳小玉 劉可福

【關鍵詞】士的寧和馬錢子堿；跳骨片；高效液相色譜法；含量測定

【文章編號】1004-7484（2014）04-2418-01

跳骨片由馬錢子（制）、骨碎補、仙桃草等二十味中藥組成的中藥制劑，具有消腫定痛，活血舒筋，促進骨痂生長等作用，臨床用于治療各種骨折、脫臼、新久傷痛等具有良好療效。原有質量標準中含量測定這一項用薄層掃描法，該方法精密度較差，為更精確控制本品的質量，對成品中的士的寧和馬錢子堿的含量測定進行了改進和提高。參考有關文獻（1）（2）（3），用高效液相色譜法測定其主藥馬錢子（制）中的士的寧和馬錢子堿的含量，收到滿意的結果，可用于跳骨片的質量控制?，F(xiàn)報道如下。

1 實驗儀器與試藥

1.1儀器 日本島津LC—10AVP高效液相色譜儀；賽多利斯BP-221S電子天平；KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器。

1.2試藥 士的寧（批號110705-200306，供含量測定用）、馬錢子堿（批號110706-200505，供含量測定用）購于中國藥品生物制品檢定所；跳骨片由福州屏山制藥有限公司提供；乙腈為色譜純；其它試劑為分析純；水為超純水。

2 實驗方法

2.1色譜條件 色譜柱：Shimpack Vp-ods （4.6mmⅹ15cm）C18柱；柱溫：室溫；流動相為： 乙腈-0.01mol/L 庚烷磺酸鈉與0.02mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（用10%磷酸調節(jié)pH值為2.8）（21：79）；流速：1.0ml/min；檢測波長為260nm。理論塔板數(shù)應不低于2000。分離度大于1.5。

2.2對照品溶液的制備 分別精密稱取士的寧12.48mg和馬錢子堿11.15mg，置于同一100ml量瓶中，加三氯甲烷適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.1248mg/ml士的寧和0.1115mg/ml馬錢子堿作為儲備液。再精密吸取上述儲備液5ml，置于25ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成0.02496mg/ml士的寧和0.0223mg/ml馬錢子堿對照品溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備 取跳骨片20片，除去糖衣，研細，取1.5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加氫氧化鈉試液2ml，濕潤，精密加入三氯甲烷25ml，密塞，精密稱重，置水浴中加熱回流2小時，取出放冷，稱定重量，用三氯甲烷補足減失重量，搖勻，用鋪有少量無水硫酸鈉的濾紙濾過，棄去初濾液，精密吸取續(xù)濾液10ml，水浴蒸干，殘渣加加甲醇溶解置10ml容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45um）濾過，即得。

2.4陰性樣品考察 取缺味馬錢子陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，結果其它成分對士的寧和馬錢子堿的測定無干擾。

2.5 線性關系的考察線性關系的考察 精密吸取上述0.1248mg/ml士的寧和0.1115mg/ml馬錢子堿儲備液0.5、1、2.5、5、10、15、20μl，按上述色譜條件分別測定，記錄峰面積。以士的寧和馬錢子堿的進樣量（ug）為橫坐標，以相應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸。結果士的寧的回歸方程為：Y﹦8.8529e-007X+5.7695e-005，r﹦0.9999， 馬錢子堿的回歸方程為：Y=1.144e-006X+1.1779e-003，r=0.9999，表明士的寧和馬錢子堿進樣量分別在0.0624～2.496ug，0.05575～2.23ug范圍內，與其峰面積呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 精密吸取上述同一份對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10μl，測得士的寧峰面積平均值為280632，RSD﹦0.39%（n﹦6），測得馬錢子堿峰面積平均值為190689，RSD﹦0.34%（n﹦6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取跳骨片（批號130601），按供試品溶液的制備方法制得供試液，分別精密吸取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、6、12、24、36h進樣，每次20μl，測得士的寧峰面積平均值為275961，RSD﹦1.34%（n﹦6）， 測得馬錢子堿峰面積平均值為109019，RSD﹦1.91%（n﹦6），結果表明樣品36h內基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 精密稱取士的寧對照品14.14mg、14.28mg，馬錢子堿對照品12.91mg、13.10mg 分別置25ml量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液。分別精密量取上述對照品貯備液各1ml，置同一50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成每1ml含士的寧11.31?g、11.42?g、馬錢子堿10.33?g、10.48?g。取同一批供試品（批號130602）6份，按上述色譜條件測定，進樣量為20?l，分別進樣測定，測得士的寧平均含量0.259mg/g，RSD﹦0.21%（n﹦6）；馬錢子堿平均含量0.178mg/g，RSD﹦0.69%（n﹦6）。表明該方法實驗重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 分別精密稱取士的寧18.08mg、馬錢子堿12.71mg和分別置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成含士的寧0.1808mg/ml、馬錢子堿0.1271mg/ml的對照品貯備液。分別精密量取上述兩種貯備液1ml各6份，至錐形瓶中，揮干溶劑，稱取已知含量的樣品（批號130602）0.75g，精密稱重，按上述方法測定，對照品溶液取重復性項下作為對照溶液。計算回收率，結果見表1，表2。結果表明本法回收率良好，測量準確度較高。

2.10 含量測定 取跳骨片，去糖衣，研細，取1.5g，，按供試品制備項下制備供試液，在上述色譜條件下，分別進樣20ul測定， ，按外標法計算樣品含量，共測得10批樣品，結果見表3，表4。

3 討論

根據(jù)游離生物堿易溶于三氯甲烷的性質，采用堿性條件下使生物堿游離，再用三氯甲烷提取的方法制備供試液，根據(jù)空白干擾試驗和回收率試驗，證實此法既能排除干擾，雜質少，又可提取完全的目的。采用不同的提取方法制備樣品溶液，以回流提取法提取效率最高。參考中國藥典2010年版，采用庚烷璜酸鈉作為離子對試劑，與士的寧和馬錢子堿形成離子對，增加其在色譜柱固定相的保留，使采用反相HPLC法成為可能，在流動相中加入少量磷酸二氫鉀，并調節(jié)適宜的pH值，可提高柱效，減少色譜峰拖尾，峰型較好，提高了分離度。供試品色譜中士的寧與馬錢子堿得到較好的分離，其色譜峰保留時間與對照品一致。理論板數(shù)以士的寧峰計算大于2000。

跳骨片中的制馬錢子為主要的藥味，制馬錢子的主要有效成分是生物堿，士的寧和馬錢子堿各占其生物堿總量的約40%，安全使用范圍較小，對跳骨片中士的寧和馬錢子堿含量均應進行控制，對馬錢子中士的寧含量測定方法主要有分光光度法，比色法，薄層掃描法，高效液相色譜法等，其中以高效液相色譜法測定較為靈敏，準確，故本研究采用高效液相色譜法進行含量測定，具有簡便、快速、準確等優(yōu)點，且精密度和重現(xiàn)性較好，適合于跳骨片質量控制。

參考文獻

[1] 吳皓、蔡寶昌、鄭培新等.炮制對馬錢子中生物堿的影響[J].中國中藥雜志，1994，19（5）：277-279

[2] 潘金火、嚴國俊、周娟娟.馬錢子粉中士的寧和馬錢子堿含量測定方法的研究[J].中國藥學雜志，2010，（13）：1024-1029

[3] 宋金春、楊芝、張立.復方馬錢子片中士的寧和馬錢子堿含量的測定[J].醫(yī)藥導報，2002，21（2）：120-122