SIRT1、p53、Ki—67在結(jié)直腸癌中的表達及意義

康軍朋等

【摘 要】目的：研究SIRT1在結(jié)直腸癌中的表達情況，分析它與臨床病理學(xué)特征及相關(guān)基因表達水平的關(guān)系，以期探討結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的機制。方法：應(yīng)用免疫組化Envision兩步法檢測60例結(jié)直腸癌組織和30例正常結(jié)直腸黏膜組織中SIRT1的表達情況，分析SIRT1的臨床病理學(xué)意義，以及與p53、Ki-67之間的相互關(guān)系。結(jié)果：60例結(jié)直腸癌中，SIRT1在結(jié)直腸癌中的陽性表達率高于正常結(jié)直腸黏膜（P<0.05）。SIRT1表達與結(jié)直腸癌浸潤深度（P=0.021）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.020）、pTNM分期（P=0.003）、p53的表達（P=0.024）、Ki-67的表達（P=0.021）均呈正相關(guān)，SIRT1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：SIRT1在結(jié)直腸癌組織中呈高表達，且與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，SIRT1的表達與p53、Ki-67的表達呈正相關(guān)，提示SIRT1可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，并可能成為判定結(jié)直腸癌惡性程度及評估手術(shù)治療患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，聯(lián)合檢測SIRT1、p53和Ki-67的表達對評估結(jié)直腸癌患者的病情提供一定的理論依據(jù)，并可作為有效的治療靶點。

【關(guān)鍵詞】SIRT1；結(jié)直腸腫瘤；p53；Ki-67

【中圖分類號】R735.5 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）04-2069-02

結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）是最常見的惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤中的發(fā)病率已位居第3位[1]，侵襲和轉(zhuǎn)移仍然是其不良預(yù)后的主要原因，其轉(zhuǎn)移的潛在性通常難以預(yù)測，尚缺乏有效的早期診斷手段，嚴(yán)重危害人民的健康。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（sirtuin type 1，SIRT1）是目前腫瘤學(xué)研究的熱點基因之一，是依賴于NAD+的Ⅲ類組蛋白脫乙酰酶，是Sir2的哺乳動物同源物，在體內(nèi)通過去乙酰化修飾作用，調(diào)節(jié)基因表達，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1蛋白在多種實體瘤中高表達，它可通過凋亡相關(guān)因子p53[2]途徑調(diào)節(jié)多種生理學(xué)底物，如HIC1、FOXO、DBC1等的轉(zhuǎn)錄、翻譯，還可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶2[3]（Matrix metalloproteinase-2）、C-MYC[4]等、沉默抑癌基因[5]、促進多藥耐藥基因（MDR1）的表達[6]影響細(xì)胞壽命，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展與耐藥以及腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。本研究應(yīng)用免疫組化染色方法，檢測SIRT1在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討SIRT1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象：收集2007年3月至2012年4月在保定市第一中心醫(yī)院行手術(shù)切除的結(jié)直腸癌存檔蠟塊60例為實驗組及結(jié)直腸鏡活檢證實為正常的結(jié)直腸黏膜30例為對照組，所有CRC患者診斷明確，術(shù)前均未行任何放化療及內(nèi)分泌治療，均經(jīng)外科手術(shù)切除后送檢病理檢查，證實為原發(fā)性CRC，且為首發(fā)，均未合并心臟病、腦血管疾病及其他系統(tǒng)疾病，病理資料完整。兩組病例的性別、年齡之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組男性33例，女性27例；結(jié)腸35例，直腸25例；年齡23-77歲，平均年齡54.7±11.6歲；所有病例資料完整，包括血清CEA值。全部標(biāo)本術(shù)后立即取材，經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)處理后石蠟包埋。

1.2 免疫組化：采用Envision兩步法。將石蠟切片中仍能見到癌組織的石蠟切片做SIRT1指標(biāo)的免疫組織化學(xué)檢測，通過對病例資料進行查漏登記，發(fā)現(xiàn)有些病例免疫組化結(jié)果中無p53、Ki-67，將相應(yīng)病例的組織蠟塊挑出，與SIRT1同時行免疫組化檢測。所用試劑：兔抗人SIRT1單克隆抗體（克隆號[E104]ab32441）購于美國Abcam公司，工作濃度均為1：100；p53、Ki-67為即用型單克隆抗體，二抗為快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，均購自福州邁新公司，免疫組化檢測試劑盒、濃縮型DAB試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。參照試劑盒說明操作，以PBS代替一抗做陰性對照，已知陽性切片做陽性對照，光鏡下觀察染色結(jié)果，所有切片染色結(jié)果均由兩名資深病理醫(yī)師復(fù)審，以提高結(jié)果的可靠性。

1.3 結(jié)果判定：SIRT1蛋白主要定位于細(xì)胞核中，P53蛋白定位于細(xì)胞核，無背景著色情況下以胞核出現(xiàn)黃色或棕色顆粒者為陽性染色；每例均隨機觀察10個高倍視野，用半定量積分法判斷結(jié)果：①黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②計數(shù)10個高倍視野，陽性細(xì)胞在同類細(xì)胞中所占百分率<25%為0分，26%-50%為1分，51%-75%為2分，>75%為3分；③按上述兩項指標(biāo)的分?jǐn)?shù)乘積高低分為：0分為陰性（-），1-3分為弱陽性（+），4-6分為中度陽性（++），7-9分為強陽性（+++）。Ki-67結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：記數(shù)陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)所占的比例，以5%為單位進行半定量評估，≤5%定義為陰性表達，>5%定義為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，以α=0.05作為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1在CRC和正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達

SIRT1陽性著色定位于細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色顆粒者為陽性著色（圖1），94例結(jié)直腸癌中SIRT1陽性表達率為81.7%（49/60），30例正常結(jié)直腸粘膜中SIRT1陽性表達率分別為36.7%（11/30），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.225，P=0.000）。

圖1a SIRT1在正常結(jié)直腸黏膜組中呈陰性表達 SP法

圖1b SIRT1在結(jié)直腸癌組織中呈陽性表達 SP法

2.2 SIRT1表達與CRC臨床病理特征的關(guān)系

CRC中SIRT1的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分化、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及癌胚抗原（CEA）等無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；SIRT1的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈顯著正相關(guān)，晚期、浸潤較深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性率高于早期、浸潤較淺、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，表1）。

2.3 CRC中SIRT1、p53、Ki-67的表達及相關(guān)關(guān)系

SIRT1陽性表達49例中，p53陽性表達率為69.4%（34/49），SIRT1陰性表達11例中，p53陽性表達率為27.3%（3/11），二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.761，P=0.016）；SIRT1陽性表達病例49中，Ki-67陽性表達率為83.6%（41/49），SIRT1陰性表達病例11例中，Ki-67陽性表達45.5%（5/11），二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.354，P=0.021，表2），SIRT1表達與p53、Ki-67表達呈正相關(guān)。

3 討論

SIRT1廣泛表達于胎兒及成人組織中，作為sirtuin家族中研究最為廣泛的成員之一，已被證實與多種生理學(xué)事件相關(guān)，其生理功能均涉及DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄沉默、細(xì)胞生長周期調(diào)控、能量代謝、血管生成、神經(jīng)保護等，通過限制能量攝入過程激活SIRT1，可延長細(xì)胞壽命，故有“長壽基因”之稱[7]。目前SIRT1在腫瘤細(xì)胞中的作用尚未得到統(tǒng)一，現(xiàn)有累積的證據(jù)支持SIRT1在腫瘤的形成中具有雙重作用，一方面由于SIRT1具有抗炎、基因組穩(wěn)定性和促進癌細(xì)胞死亡的作用，SIRT1基因缺失將導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性及致癌作用，另一方面，SIRT1可通過刺激腫瘤信號傳導(dǎo)通路，創(chuàng)建腫瘤微環(huán)境利于癌細(xì)胞的生長和存活，且具有鈍化抑癌基因和DNA損傷修復(fù)蛋白的作用，被認(rèn)為是腫瘤促進因子。相關(guān)研究證實SIRT1在不同組織中有不同的致瘤作用，在皮膚癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌中高表達，而在膀胱癌中表達降低，SIRT1在腫瘤中的這種雙重作用可能與亞細(xì)胞定位狀態(tài)密切相關(guān)[8]，核漿中具有不同的特異性底物，且由于其調(diào)節(jié)底物眾多，近年來備受關(guān)注。本實驗研究發(fā)現(xiàn)SIRT1陽性表達定位于細(xì)胞核，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中有陽性表達，SIRT1在CRC組織中較正常組織中表達增高，且SIRT1的表達與CRC的腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)，SIRT1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明SIRT1的高表達可能與腫瘤的侵襲、預(yù)后有關(guān)，SIRT1可能通過某種機制促進腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并可能成為判斷結(jié)直腸癌惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)[9]SIRT1通過去乙?；艘蜃覰F-κB的RelA/P65亞基降低其轉(zhuǎn)錄活性而負(fù)性調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase-9，MMP9）而影響癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。Lovaas等[3]研究證實SIRT1在晚期前列腺癌組織中高表達，并通過去乙?；|(zhì)金屬蛋白酶2（Matrix metalloproteinase-2，MMP2）的表達來促進前列腺腫瘤細(xì)胞的侵襲。

p53是最早發(fā)現(xiàn)的SIRT1的生理底物[2]，SIRT1可去乙?；扳g化p53蛋白而發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。p53在體內(nèi)有野生型和突變型兩種，野生型p53具有抑癌作用，突變型p53由于喪失其抑癌功能使細(xì)胞無限增殖而誘發(fā)腫瘤，由于野生型p53半衰期短，利用免疫組化方法只能檢測到突變型p53的表達。研究顯示[10]SIRT1 和 p53 之間的關(guān)系較為復(fù)雜，在野生型p53表達的細(xì)胞中SIRT1過表達具有致癌作用，在突變型p53表達的細(xì)胞作用卻相反。在本研究中發(fā)現(xiàn)，SIRT1表達與p53表達呈顯著正相關(guān)，提示這兩個因子在結(jié)直腸癌的發(fā)展進程中可能起到了正調(diào)節(jié)協(xié)同作用，腫瘤中SIRT1的表達和p53突變有關(guān)，但是這種關(guān)系尚需進一步研究證實，因為p53突變可能會改變SIRT1對p53活性的生物學(xué)影響。SIRT1介導(dǎo)的p53去乙酰化在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中存在多個反饋條路，包括與抑癌基因HIC1、DBC1形成的HIC1-SIRT1-p53通路、DBC1-SIRT1-p53通路，還可與miRNA-34a、Myc以及Necdin形成反饋條路，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。SIRT1的抑制劑尼克酰胺[11]可以抑制慢性淋巴細(xì)胞白血病中高表達的SIRT1的活性，如果淋巴細(xì)胞表達野生型p53，那么尼克酰胺可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進其凋亡。由于SIRT1通過p53途徑調(diào)節(jié)的底物因子眾多，其機制相當(dāng)復(fù)雜，p53與SIRT1之間的關(guān)系還需搜集更多的臨床數(shù)據(jù)進行深入研究。

Ki-67基因定位于10號染色體，是一種DNA結(jié)合蛋白，表達于除G0外的整個細(xì)胞周期中，是反映組織細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)，其陽性著色的細(xì)胞百分比可用來客觀評價細(xì)胞的增殖狀態(tài)。研究表明，細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67的表達與乳腺癌的臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)聯(lián)，并且在評估新輔助化療及內(nèi)分泌治療的療效方面具有重要的預(yù)測價值。Ki-67高表達可作為乳腺癌的不良預(yù)后因素，其與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后高度相關(guān)。本實驗中結(jié)直腸癌組織中Ki-67在SIRT1陽性組的表達水平明顯高于SIRT1陰性組，這與Feng等[12]研究結(jié)果一致，提示SIRT1陽性病例中更多的腫瘤細(xì)胞處于增殖活躍狀態(tài)，SIRT1陽性表達的腫瘤患者預(yù)后教陰性表達者差。

綜上所述，SIRT1可能參與了CRC的發(fā)生、發(fā)展，聯(lián)合檢測SIRT1、p53、Ki-67比單獨檢測SIRT1的表達可能具有更重要的臨床意義，可作為評估CRC惡性程度及臨床預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物。CRC的治療目前以手術(shù)治療為主，輔以化療治療，而耐藥的形成往往使腫瘤細(xì)胞免受化療藥物而影響化療療效及預(yù)后。Chu等[13]研究證明，SIRT1參與腫瘤細(xì)胞的放化療耐受，與腫瘤耐藥性關(guān)系密切，用SIRT1去乙?；敢种苿┛朔[瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，有可能具有應(yīng)用前景。Chen[14]等研究表明抑制SIRT1不僅幫助消除慢性髓細(xì)胞白血病干細(xì)胞，也能阻止耐藥性的產(chǎn)生，對治療其他惡性腫瘤也有益，這無疑對術(shù)后輔助化療及晚期失去手術(shù)機會依賴化療的患者提供了臨床指導(dǎo)意義。SIRT1作為一種新的治療靶點，值得進一步研究。

參考文獻

[1] 呂強，邢沈陽，趙志輝等，結(jié)直腸癌的研究現(xiàn)狀及展望，中國實驗診斷學(xué)，2009，13（8）：1134-7.

[2] Yi J，Luo J.SIRT1 and p53，effect on cancer，senescence and beyond[J]. Biochim Biophys Acta，2010，1804（8）：1684-89.PMID：20471503

[3] Lovaas JD，Zhu L，Chiao CY，et al.SIRT1 enchances matrix metalloproteinse-2 expression and tumor cell invasion in prostate cancer cells[J].Prostate，2012， Oct 4. doi： 10.1002/pros.22592. PMID： 23038275

[4] Mao B， Zhao G，Lv X，et al.Sirt1 deacetylates C-MYC and promotes C-MYC/Max association[J].Int J Biochem Cell Biol，2011，43（11），1573-1581.PMID：21807113

[5] Pruitt K，Zinn Rl，Ohm JE，et al.Inhibition of SIRT1 reactivates silenced cancer genes without loss of promoter DNA hypermethylation[J].PLOS Genet，2006，2（3）：e40.PMID：16596166

[6] Chu F， Chou PM， Zheng X， et al.Control of multidrug resistance gene mdr1 and cancer resistance to chemotherapy by the longevity gene sirt1[J].Cancer Res，2005，65（22）：10183-10187.PMID：16288004

[7] Li Y，Tollefsbol TO.P16（INK4a）suppression by glucose restriction contributes to human celluar lifespan extension through SIRT1-mediated epigenetic and genetic mechanism[J].PLos One，2011，6（2）e17421.PMID：21390332

[8] Song NY， Surh YJ. Janus-faced role of SIRT1 in tumorigenesis[J]. Ann N Y Acad Sci，2012，1271：10-9.PMID： 23050959

[9] Nakamaru Y， Vuppusetty C， Wada H，et al. A protein deacetylase SIRT1 is a negative regulator of metalloproteinase-9[J].FASEB J. 2009，23（9）：2810-9. PMID： 19376817

[10] Brooks C L， Gu W. How does SIRT1 affect metabolism， senescence and cancer[J]？ Nat Rev Cancer，2009，9（2）：123–128.PMID：19132007.

[11] Audrito V， Vaisitti T， Rossi D， et al.Nicotinamide blocks proliferation and induces apoptosis of chronic lymphocytic leukemia cells through activation of the p53/miR-34a/SIRT1 tumor suppressor network [J].Cancer Res，2011，71（13）：4473-83. PMID： 21565980

[12] Feng AN， Zhang LH， Fan XS， et al. Expression of SIRT1 in gastric cardiac cancer and its clinicopathologic significance[J]. Int J Surg，Pathol，2011，19（6）：743-50. PMID： 21865267

[13] Chu F， Chou PM， Zheng X， et al.Control of multidrug resistance gene mdr1 and cancer resistance to chemotherapy by the longevity gene sirt1 [J].Cancer Res，2005，65（22）：10183-10187. PMID： 16288004

[14] Chen W. Accelerating cancer evolution： a dark side of SIRT1 in genome maintenance[J]. Oncotarget，2012，3（4）：363-4. PMID： 22622047

通訊作者簡介：

郭淑芹，女，河北保定人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌腫瘤醫(yī)學(xué)。