春蘭與大花蕙蘭雜交后代根狀莖增殖與分化條件

孫玉芬，寧惠娟，張韶伊，褚怡，范義榮

（浙江農(nóng)林大學(xué) 風景園林與建筑學(xué)院，浙江 臨安 311300）

春蘭與大花蕙蘭雜交后代根狀莖增殖與分化條件

孫玉芬，寧惠娟，張韶伊，褚怡，范義榮

（浙江農(nóng)林大學(xué) 風景園林與建筑學(xué)院，浙江 臨安 311300）

為了篩選適合根狀莖增殖分化的條件,以春蘭Cymbidium goeringii與大花蕙蘭Cymbidium hybridum雜交后代的根狀莖為材料進行培養(yǎng)，比較了不同基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機添加物等對根狀莖增殖與分化的影響。結(jié)果表明：1/2MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基對雜交根狀莖增殖與分化效果最適宜；2,4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和激動素（KT）對雜交組合春蘭與大花蕙蘭‘夢境’‘Wanderland’的根狀莖分化作用不顯著，1/2MS培養(yǎng)基添加1.0 mg·L-16-芐基腺嘌呤（6-BA）+1.0 mg·L-1萘乙酸（NAA）對春蘭與大花蕙蘭‘夢境’的雜交后代增殖分化效果最佳；使用有機添加物對根狀莖增殖有顯著影響，其中以椰汁增殖效果最好，其次為香蕉泥、土豆汁；添加100 g·L-1香蕉泥+ 50 mL·L-1椰汁最利于根狀莖的增殖與分化。圖1表4參16

園藝學(xué)；蘭花；雜交后代；根狀莖；增殖；分化

大花蕙蘭Cymbidium hybridum屬蘭科Orchidaceae蘭屬Cymbidium多年生草本植物，是蘭屬內(nèi)一些附生蘭雜交種的統(tǒng)稱，其大部分品種葉片長且披散，花無香味［1］，花大、多而色艷，花期2-4月。國蘭通常指蘭屬中的部分地生種，如春蘭C.goeringii，墨蘭C.sinense，寒蘭C.kanran，春劍C.goeringiivar.longibracteatu和蓮瓣蘭C.lianpan等，花小、色淡，但芳香、葉態(tài)優(yōu)美。利用蘭屬小花型地生蘭與大花蕙蘭雜交選育出的一類蘭花品種，結(jié)合了國蘭和大花蕙蘭的優(yōu)良性狀，具有較高的觀賞價值和市場前景。目前，蘭科植物的育種仍以常規(guī)的育種手段為主，根據(jù)育種目標選擇適宜的親本進行雜交，然后進行播種，從雜交后代中選擇符合目標性狀的植株進行擴繁或繼續(xù)進行雜交。國外對蘭屬附生蘭種間雜交的研究已有上百年歷史，培育出了數(shù)千個新品種，但對國蘭與附生蘭種間雜交的研究甚少，近年來國內(nèi)研究也多集中在雜交育種和胚培養(yǎng)方面［2-7］，增殖分化方面雜交蘭僅有原球莖的報道［8-9］，未見根狀莖的報道。本研究的目的是對春蘭與大花蕙蘭雜交后代種子萌發(fā)所獲得的根狀莖在不同培養(yǎng)基上的增殖與分化條件進行研究，篩選出最適培養(yǎng)條件，為培育具香味、花大、株型好，能在春節(jié)前后開花的新品種提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為2010年2月利用春蘭‘黃水仙’C.goeringii‘Huangshuixian’與大花蕙蘭2個品種‘夢境’C.hybridum‘Wanderland’和‘皇后’C．hybridum‘Princess Nobuko’進行雜交獲雜交種子（分別標記為A1和A2組合），當年10月種子成熟后無菌播種，培養(yǎng)基為1/2MS（Murashige and Skoog）+30 g·L-1蔗糖+5 g·L-1瓊脂+1 g·L-1活性炭，誘導(dǎo)形成的原球莖經(jīng)繼代培養(yǎng)4～5次，從中選取穩(wěn)定生長且較一致的根狀莖。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同基本培養(yǎng)基對根狀莖增殖與分化的影響 A1和A2根狀莖分別接在MS，1/2MS，Knudson C（KC），VW（Vacin and Went）和B5等5種培養(yǎng)基上（表1），培養(yǎng)基中附加有60.0 g·L-1香蕉泥、1.5 mg·L-16-芐基腺嘌呤（6-BA）和0.5 mg·L-1萘乙酸（NAA）。根狀莖切成約7 mm，經(jīng)稱量后接種于培養(yǎng)基中，每個處理20條，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計增殖結(jié)果，60 d后觀察生長特征，統(tǒng)計出苗數(shù)。

表1 不同基本培養(yǎng)基對根狀莖增殖和分化的影響Table 1 Different culture medium on the influence of the proliferation and differentiation of rhizomes

1.2.2 不同生長素和細胞分裂素對根狀莖增殖與分化的影響 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，生長素選則萘乙酸（NAA），2,4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），并與1.0 mg·L-16-BA進行組合；細胞分裂素選擇激動素（KT）和6-BA，并與0.2 mg·L-1NAA進行組合，設(shè)置對照組，質(zhì)量濃度設(shè)置見表2和表3，將A1根狀莖接在培養(yǎng)基上，20條·處理-1，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計增殖結(jié)果，60 d后觀察生長特征，統(tǒng)計出苗數(shù)，計算分化率。

1.2.3 不同有機添加物對根狀莖增殖與分化的影響 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加有0.5 mg·L-1NAA，分別添加椰汁、香蕉泥和土豆汁作為不同處理，質(zhì)量濃度設(shè)置見表4。其中香蕉、土豆均去皮后用榨汁機榨成勻漿備用。設(shè)置對照組，將A1根狀莖接在培養(yǎng)基上，20條·處理-1，重復(fù)3次。40 d后統(tǒng)計增殖結(jié)果，60 d后統(tǒng)計出苗數(shù)，計算分化率。

1.2.4 生根壯苗 將根狀莖誘導(dǎo)出的大于1 cm的不定芽小心地分開，接到生根培養(yǎng)基中。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基中添加20.0 g·L-1蔗糖，6.0 g·L-1瓊脂，1.0 g·L-1活性炭，pH 5.6～5.8，培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，光照14 h·d-1，光照強度2 000 lx。

1.4 數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)一段時間后統(tǒng)計新長出根狀莖數(shù)，計算增殖倍數(shù)，增殖倍數(shù)=新長出根狀莖數(shù)/接種根狀莖數(shù)。60 d后統(tǒng)計根狀莖的出苗數(shù)（苗以超過1.0 cm以上為標準），計算分化率，分化率=出芽根狀莖數(shù)/接種根狀莖總數(shù)×100%。結(jié)果采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，用鄧肯氏新復(fù)極差測驗法（Duncan）進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雜交組合后代根狀莖在不同基本培養(yǎng)基上增殖與分化的情況

在不同的基本培養(yǎng)基上分別接種A1和A2根狀莖，根狀莖在10 d后開始萌動，15 d左右外植體基部切口處出現(xiàn)許多白色顆粒狀愈合組織，之后這些組織進一步發(fā)育生長，25 d開始出現(xiàn)小芽。培養(yǎng)30 d后根狀莖的增殖結(jié)果見表1。由表1可知，基本培養(yǎng)基種類對雜交蘭根狀莖增殖分化影響較明顯?？傮w看來，1/2MS對于根狀莖增殖分化效果較好，1/2MS與MS相比較可知，過多的無機鹽也不利于雜交根狀莖的增殖和分化，KC和B5效果則較差。但是，A2根狀莖在VW培養(yǎng)基上的增殖效果要好于1/ 2MS，且其在VW培養(yǎng)基上增殖分化效果要好于A1根狀莖，這可能是由于雜交A1組合遺傳了親本大花蕙蘭更多的特性。綜合來看，1/2MS較適合雜交根狀莖的增殖和分化生長。

2.2 不同生長素和細胞分裂素對根狀莖增殖與分化的影響

在其他條件一致時，生長素NAA和2,4-D對根狀莖增殖和分化均有影響，結(jié)果見表2。隨著NAA質(zhì)量濃度的升高，根狀莖的增殖倍數(shù)也顯著提高，并以1.0 mg·L-1最佳，培養(yǎng)30 d后達到4.00。NAA為0.1～2.0 mg·L-1時，對分化率進行方差分析。結(jié)果表明：各處理的出苗根狀莖數(shù)和分化率差異顯著，說明NAA及其不同質(zhì)量濃度梯度對根狀莖增殖分化的影響不同。觀察到NAA為1.0和2.0 mg·L-1時形成較多叢生芽（圖1）。在0.1～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)，2,4-D對于根狀莖增殖分化的影響差異不顯著，培養(yǎng)60 d后觀察到分化的小苗較NAA處理的短而粗壯。綜合考慮，NAA促進增殖分化的效果優(yōu)于2,4-D。以1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA增殖分化效果最佳。

表2 NAA和2,4-D對根狀莖增殖和分化的影響Table 2 Effect of NAA，2,4-D on the proliferation and differentiation of rhizomes

在其他條件一致時，比較細胞分裂素6-BA和KT對根狀莖增殖分化的影響結(jié)果見表3。6-BA對根狀莖增殖分化具有極顯著的促進作用，6-BA質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時增殖倍數(shù)達3.90，根狀莖為嫩綠色，生長快，質(zhì)量濃度為0.5～4.0 mg·L-1時，分化率隨著質(zhì)量濃度升高而降低。當KT質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg·L-1時，根狀莖增殖較多，但多為嫩黃色，叢生芽狀，生長較慢，質(zhì)量濃度超過1.0 mg·L-1易導(dǎo)致根狀莖玻璃化。由方差分析可見：KT對根狀莖分化結(jié)果差異性不顯著。綜合考慮，0.2 mg·L-1NAA+ 2.0 mg·L-16-BA對根狀莖的增殖分化效果最佳。比較表2和表3中的處理4，前者1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA增殖分化效果更好。

表3 6-BA和KT對根狀莖增殖和分化的影響Table 3 Effect of 6-BA，KT on the proliferation and differentiation of rhizomes

2.3 不同有機添加物及其用量對根狀莖增殖與分化的影響

在其他條件一致時，比較不同添加物處理對根狀莖增殖和分化的影響，結(jié)果見表4。培養(yǎng)40 d后，單獨添加3種有機物對雜交蘭根狀莖增殖均有促進作用，效果由大到小為椰汁＞香蕉泥＞土豆汁，隨添加物用量的增加，根狀莖增殖倍數(shù)下降。100.0 g·L-1香蕉泥和50.0 mL·L-1椰汁混合添加增殖效果最佳，優(yōu)于所有有機物單獨添加的效果。在幼苗分化方面，土豆汁處理中，分化率顯著高于椰汁和香蕉泥處理，并在處理間存在顯著性差異。椰汁和香蕉泥處理間在分化率方面無顯著性差異。綜合考慮，100.0 g·L-1香蕉泥+50.0 mL·L-1椰汁對根狀莖的增殖分化效果最佳。

表4 有機添加物用量對根狀莖增殖和分化的影響Table 4 Effect of organic additive concentration on the proliferation and differentiation of rhizomes

圖1 根狀莖增殖并出芽（A），根狀莖分化成苗（B），形成的叢生芽（C）Figure 1 Rhizomes proliferation and budding（A），rhizomes differentiate into seedlings（B），clustered shoots（C）

2.4 壯苗生根

將分化出大于1 cm的不定芽接入生根培養(yǎng)基1/2MS+0.2 mg·L-1赤霉素（GA3）+1.0 mg·L-1NAA+25.0 g·L-1蔗糖+2.0 g·L-1活性炭中，培養(yǎng)至15 d時，無菌苗開始生根，生根率達95%以上，長出肉質(zhì)根，待形成完整且較健壯植株時（約3個月）即可移栽。

3 結(jié)論

不同基本培養(yǎng)基對蘭花雜交根狀莖增殖分化效果不同，以1/2MS效果較適宜，這與王利民等［10］、孫芳等［11］報道的結(jié)果一致。生長素NAA增殖分化效果優(yōu)于2,4-D，但是2,4-D有利于分化出較壯的小苗。這與朱根發(fā)等［1］報道的NAA對原球莖的增殖影響不大不同。6-BA對根狀莖增殖分化具有極顯著的促進作用，這與相關(guān)研究［1，12-13］結(jié)果相同，說明雜交蘭在原球莖（根狀莖）分化方面具有相似的特征。1.0 mg· L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA對根狀莖增殖和分化最適。KT對根狀莖分化結(jié)果差異性不顯著，與相關(guān)報道低質(zhì)量濃度KT對原球莖增殖有明顯促進作用［14-16］不同，可能是試驗設(shè)計的質(zhì)量濃度過高或者是由于所試品種和外植體的生長階段不同。100 g·L-1香蕉泥+50 mL·L-1椰汁對根狀莖的增殖分化效果優(yōu)于分別單獨使用香蕉泥、椰汁和土豆汁。組織培養(yǎng)中常用的有機添加物如椰乳、番茄汁、蘋果汁和馬鈴薯等一些含有氨基酸、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和酶等有機物且成分較為復(fù)雜的天然復(fù)合物，它們對細胞和組織的增殖和分化有明顯的促進作用。王豐妍等［9］研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加15 mL·L-1香蕉汁最有利于雜交蘭原球莖的增殖。由于有機添加物的不同品種、不同產(chǎn)地和有效成分含量存在較大差異。

［1］朱根發(fā)，陳明莉，羅智偉，等.墨蘭與大花蕙蘭種間雜種原球莖的誘導(dǎo)及增殖研究［J］.園藝學(xué)報，2004，31（5）：688-690.

ZHU Genfa，CHEN Mingli，LUO Zhiwei，et al.Induction and propagation of hybrid protocorm like-body of crosses betweenCymbidium sinenseandCymbidium hybridium［J］.Acta Hortic Sin，2004，31（5）：688-690.

［2］鄭立明.春蘭與大花蕙蘭種間雜交育種的試驗［J］.浙江教育學(xué)院學(xué)報，2010（3）：61-65.

ZHENG Liming.Crossbreeding experiments betweenCymbidium goeringiiandCymbidium hybridium［J］.J Zhejiang Educ Inst，2010（3）：61-65.

［3］朱根發(fā)，王碧青，陳明莉，等.大花蕙蘭與蘭屬植物種間雜交研究［J］.植物學(xué)通報，2005，22（4）：445-448.

ZHU Genfa，WANG Biqing，CHEN Mingli，et al.Study on hybridization amongCymbidiumspecies andCymbidium hybrid［J］.Chin Bull Bot，2005，22（4）：445-448.

［4］陳瑤瑤，張燕，張琛，等.雜交蘭‘韓國桃花’×蕙蘭種間雜交種子無菌萌發(fā)特征研究［J］.園藝學(xué)報，2009，36（3）：441-446.

CHEN Yaoyao，ZHANG Yan，ZHANG Chen，et al.A study on aseptic seed germination of interspecific hybrid betweenCymbidium hybrida×C.sinenseandC.faberi［J］.Acta Hortic Sin，2009，36（3）：441-446.

［5］周麗，胡春根.送春與多花蘭雜種的非共生萌發(fā)與快速繁殖［J］.北方園藝，2009（3）：181-183.

ZHOU Li，HU Chungen.Asymbiotic germination and rapid propagation of hybrid ofCymbidium cyperifolimvar.szechuanicumandC.floribundum［J］.Northern Hortic，2009（3）：181-183.

［6］丁長春，夏念和.蓮瓣蘭與大花蕙蘭‘黃金薄荷’種間雜種胚培養(yǎng)研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，24（4）：1609 -1611.

DING Changchun，XIA Nianhe.Embryo culture of interspecific hybrid betweenCymbidium tortisepalumandC.‘Skymint Patty’［J］.Southwest China J Agric Sci，2011，24（4）：1609-1611.

［7］褚怡，范義榮，張韶伊，等.大花蕙蘭與國蘭花粉活力及柱頭可授性分析［J］.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2013，30（6）：950-954.

CHU Yi，F(xiàn)AN Yirong，ZHANG Shaoyi，et al.Pollen vitality and stigma receptivity ofCymbdium hybridumandChinese orchid［J］.J Zhejiang A&F Univ，2013，30（6）：950-954.

［8］梁芳，崔波，馬杰，等.雜交蘭原球莖增殖及分化研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（13）：5309-5310，5353.

LIANG Fang，CUI Bo，MA Jie，et al.Study on propagation and differentiation of PLB ofCymbidium hybridum×faberi［J］.J Anhui Agri Sci，2008，36（13）：5309-5310，5353.

［9］王豐妍，李承秀，王長憲，等.大花蕙蘭與春劍雜交原球莖增殖及分化研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（23）：327-330.

WANG Fengyan，LI Chengxiu，WANG Changxian，et al.Study on propagation and differentiation of PLB ofCymbidium hybridum×Cymbidium longibracteatum［J］.Chin Agric Sci Bull，2009，25（23）：327-330.

［10］王利民，王四清.大花蕙蘭種子萌發(fā)的原球莖在不同培養(yǎng)基上的生長效應(yīng)研究［J］.種子，2006，25（12）：8-11.

WANG Limin，WANG Siqing.The growth effect of protocorm-like body（PLB）germinated from seeds ofCymbidium hybridumon different medium［J］.Seed，2006，25（12）：8-11.

［11］孫芳，李承秀，張林，等.春蘭名品雜交后代快繁與分化研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（10）：189-193.

SUN Fang，LI Chengxiu，ZHANG Lin，Study on rapid propagation and differentiation of filial generation ofCymbidiumgoeringii［J］.Chin Agric Sci Bull，2012，28（10）：189-193.

［12］陳瑤瑤.雜交蘭‘韓國桃花’蕙蘭種間雜交種子無菌萌發(fā)特征及相關(guān)生理生化研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

CHEN Yaoyao.Aseptic Germination of Interspecific Hybridization Seeds and Its Physiological and Biochemical Characteristics of Cymbidium hybrida×C.sinense and C.faberi［D］.Nanjing：Nanjing Agricultural University，2008.

［13］鄭君爽，范義榮，寧惠娟，等.細胞分裂素對雜交蘭原球莖生長的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（5）：234-235.

ZHENG Junshuang，F(xiàn)AN Yirong，NING Huijuan，et al.The effects of cytokinin on the growth of protocorm-like body ofCymbidium hybridum×faberi［J］.Jiangsu Agric Sci，2011，39（5）：234-235.

［14］楊玉珍，孫天洲，孫廷，等.大花蕙蘭組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，24（2）：86-88.

YANG Yuzhen，SUN Tianzhou，SUN Ting，et al.Tissue culture and rapid propagation techniques forCymbidium hybridum［J］.J Beijing For Univ，2002，24（2）：86-88.

［15］魯?shù)?春劍和大花蕙蘭種間雜交種子無菌萌發(fā)及雜交后代的RAPD分析［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

LU Di.In vitro Germination Using Hybrid Seeds and RAPD Analysis from Cymbidium longibracteatum and C.hybridium［D］.Ya’an：Sichuan Agricultural University，2010.

［16］徐大成，劉曉硯，曹偉，等.幾種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對大花蕙蘭組培原球莖增殖的影響［J］.植物研究，2004，24（1）：76-79.

XU Dacheng，LIU Xiaoyan，CAO Wei，et al.Influence of several plant growth substance on propagation of GGB ofCymbidium grandiflorum［J］.Bull Bot Res，2004，24（1）：76-79.

Proliferation and differentiation of rhizomes from a filial generation of Cymbidium goeringii×Cymbidium hybridum

SUN Yufen，NING Huijuan，ZHANG Shaoyi，CHU Yi，F(xiàn)AN Yirong
（School of Landscape Architecture，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

In order to sift out the optimum condition of proliferation and differentiation of rhizomes,using rhizomes from a filial generation ofCymbidium goeringii×C.hybridum，the effects of different basal medium［Murashige and Skoog（MS），1/2MS，Knudson C（KC），Vacin&Went（VW），B5］，plant growth regulators［2,4-D，kinetin（KT），6-Benzylaminopurine（BA），and 1-Naphthalene acetic acid（NAA）］and organic additives（coconut milk，banana mud,and potato juice）on the proliferation and differentiation of rhizomes were compared.Results showed that 1/2MS was the optimal medium for proliferation of rhizomes.For differentiation ofC.goeringii×C.hybridum‘Wanderland’，2,4-D and KT had little effect；whereas 1/2MS supplemented with 1.0 mg·L-16-BA and 1.0 mg·L-1NAA was the best combination for proliferation and differentiation.The organic additive coconut milk had the strongest influence on proliferation of rhizomes，followed by favorable proliferation and differentiation with 100 g·L-1banana mud and 50 mL·L-1potato juice.［Ch，1 fig，4 tab.16 ref.］

horticulture；orchid；filial generation；rhizomes；proliferation;differentiation

S682.31

A

2095-0756（2014）01-0156-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.024

2013-01-15；

2013-04-18

浙江省花卉新品種選育重大科技專項重點資助項目（2012C12909-11）；浙江省重大科技專項（2009C12087）；浙江省重點科技創(chuàng)新團隊子項目（2009R50034-10）

孫玉芬，從事園林植物良種繁育研究。E-mail：sunnay1122@126.com。通信作者：寧惠娟，講師，博士研究生，從事園林植物良種選育等研究。E-mail：ninghuijuan@21cn.com