半蒴苣苔的葉片組織培養(yǎng)及植株再生

阮慧澤，李珍，任燕燕，鄔梟楠，邵于豪，潘飛翔，夏國(guó)華

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江省臨安市森林資源保護(hù)管理總站，浙江 臨安 311300）

半蒴苣苔的葉片組織培養(yǎng)及植株再生

阮慧澤1，李珍2，任燕燕1，鄔梟楠1，邵于豪1，潘飛翔1，夏國(guó)華1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江省臨安市森林資源保護(hù)管理總站，浙江 臨安 311300）

為了建立半蒴苣苔Hemiboea subcapitata的組培快繁技術(shù)體系，保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用半蒴苣苔這一民間植物藥資源，以MS（Murashige and Skoog）為基本培養(yǎng)基，研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-芐基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）組合對(duì)葉片愈合組織誘導(dǎo)、不定芽分化，增殖和壯苗生根的影響，篩選出適合半蒴苣苔快繁的最適培養(yǎng)基。結(jié)果表明：葉片誘導(dǎo)愈合組織困難，但在葉片基部或切口處可直接誘導(dǎo)分化出不定芽，且隨著6-BA和NAA質(zhì)量濃度的升高，芽的分化率先上升后降低，以MS+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA+1.5 g·L-1活性炭（AC）分化率最高，達(dá)到67.8%；但平均每外植體誘導(dǎo)芽數(shù)以MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+1.5 g·L-1AC最多，達(dá)到6.69個(gè)；不定芽增殖以MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA處理增殖倍數(shù)最高，達(dá)到23.43；在添加不同質(zhì)量濃度吲哚丁酸（IBA）的培養(yǎng)基中生根率均超過(guò)90%。圖1表3參15

植物學(xué)；半蒴苣苔；葉片；快繁體系；組織培養(yǎng)；植株再生

半蒴苣苔Hemiboea subcapitata是苦苣苔科Gesneriaceae半蒴苣苔屬Hemiboea多年生宿根草本［1］，全草入藥，味甘，性寒。具有清暑利濕、止咳、生津、解毒的功效，主治咽喉腫痛、外感暑濕、癰腫瘡癤、蛇咬傷等癥［2］，對(duì)燒燙傷有一定的療效［3］。環(huán)境的破壞和對(duì)野生藥材資源的大量采集，造成了資源的日益匱乏，亟待進(jìn)行半蒴苣苔的人工栽培以滿足市場(chǎng)的需求，但半蒴苣苔人工繁育和栽培的研究尚處于初始階段，成果不多。在自然狀態(tài)下，半蒴苣苔通常生長(zhǎng)在石灰?guī)r巖縫中，籍匍匐枝行營(yíng)養(yǎng)繁殖，增殖速度較慢。組織培養(yǎng)技術(shù)是苦苣苔科植物引種馴化及繁殖工作中的一種重要手段，以克服植物在遷地保育、繁衍、傳播、雜交育種及工廠化生產(chǎn)中的障礙，達(dá)到種質(zhì)資源保護(hù)和利用的目的［4］。本研究擬通過(guò)組織培養(yǎng)的方法，建立其組培快繁技術(shù)體系，為半蒴苣苔種苗規(guī)模化繁育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

半蒴苣苔植株采自浙江天目山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)李根有教授鑒定為半蒴苣苔。用消過(guò)毒的剪刀剪下半蒴苣苔葉片，放入滴有洗潔精的水中浸泡15 min，并用柔軟的牙刷輕輕刷去表面污垢，接著用自來(lái)水沖洗1 h。而后放置在超凈工作臺(tái)上，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡15 s，用鑷子取出葉片后用無(wú)菌水沖洗3次，接著放入體積分?jǐn)?shù)為0.1%升汞中消毒6 min，用無(wú)菌水沖洗3次，再用無(wú)菌濾紙吸干其表面水分。葉片切割成約1 cm×1 cm，接入Murashige and Skoog（MS）+1.0 mg·L-16-芐基腺嘌呤（6-BA）+0.5 mg·L-1萘乙酸（NAA）初代培養(yǎng)基中。培養(yǎng)15 d后葉片切口基部直接分化出芽，待芽長(zhǎng)至4～5 cm，具有5～6對(duì)葉片時(shí)用于后續(xù)試驗(yàn)。本研究中，所用的培養(yǎng)基均添加30.0 g·L-1的蔗糖和7.0 g·L-1的瓊脂，pH 5.8。培養(yǎng)室光照強(qiáng)度為30～40 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間14 h·d-1，溫度（25±1）℃。

1.2 方法

1.2.1 葉片愈合組織誘導(dǎo)及不定芽的分化 以MS為基本培養(yǎng)基，采用2因素4水平隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA和NAA對(duì)葉片愈合組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響。6-BA設(shè)置4個(gè)水平（0.1，0.5，1.0，2.0 mg·L-1），NAA設(shè)置4個(gè)水平（0.1，0.5，1.0，1.5 mg·L-1），以上培養(yǎng)基均添加活性炭1.5 g·L-1。將半蒴苣苔無(wú)菌苗葉片切成約1.0 cm×1.0 cm大小接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，接種5瓶·處理-1，接種葉片6片·瓶-1，培養(yǎng)50 d后觀測(cè)愈合組織誘導(dǎo)和芽分化情況，統(tǒng)計(jì)愈合組織誘導(dǎo)率［愈合組織誘導(dǎo)率=（出愈苗數(shù)/接種數(shù)）×100%］和不定芽分化率［不定芽分化率=（分化苗數(shù)/接種數(shù)）×100%］，平均每個(gè)外植體不定芽分化數(shù)（平均每個(gè)外植體不定芽分化數(shù)=不定芽總數(shù)/產(chǎn)生不定芽外植體數(shù)），重復(fù)3次·處理-1。

1.2.2 不定芽增殖培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基，采用2因素3水平隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA和NAA對(duì)不定芽增殖的影響。6-BA設(shè)置3個(gè)水平（0.1，0.5，1.0 mg·L-1），NAA設(shè)置3個(gè)水平（0，0.5，1.0 mg·L-1）。將生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)1.5～2.0 cm，具有2～3對(duì)葉的不定芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接種6瓶·處理-1，接種不定芽5個(gè)·瓶-1，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)不定芽增殖倍數(shù)（增殖倍數(shù)=增殖后不定芽數(shù)量/增殖前接入不定芽數(shù)量），重復(fù)3次·處理-1。

1.2.3 生根培養(yǎng)與移栽 以MS為基本培養(yǎng)基，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究生長(zhǎng)素吲哚丁酸IBA對(duì)不定芽生根的影響，IBA設(shè)置5個(gè)水平（0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L-1）。將長(zhǎng)約3 cm的不定芽接入生根培養(yǎng)基，接種6瓶·處理-1，接種不定芽5個(gè)·瓶-1，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)生根率［生根率=（生根植株/接入植株×）100%］，隨機(jī)抽取10株測(cè)量平均生根數(shù)和平均根長(zhǎng)，重復(fù)3次·處理-1。

取生長(zhǎng)健壯、根系良好的組培苗進(jìn)行開(kāi)瓶練苗，放到全天自然光照，溫度25℃的通風(fēng)條件下練苗7～10 d。練苗結(jié)束后，取出組培苗用水清洗干凈根部的培養(yǎng)基，移栽于泥炭和蛭石按1∶1均勻混合的栽培基質(zhì)中，澆透水后在遮光度為70%的大棚中馴化，定期澆水保持苗床濕度，40 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用PASW Statistics 18進(jìn)行Duncan多重比較，百分率經(jīng)反正弦平方根轉(zhuǎn)換DEGREES［ASIN（SQRT（NO.））］后進(jìn)行多重比較和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽的分化

葉片培養(yǎng)8～10 d開(kāi)始略微出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象，之后均未見(jiàn)明顯的愈合組織形成，但在基部切口處可直接分化出白色的芽（圖1-a），在培養(yǎng)約30 d后，芽大量發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，半蒴苣苔愈合組織誘導(dǎo)困難，6-BA和NAA不同質(zhì)量濃度處理均未誘導(dǎo)出愈合組織。在半蒴苣苔葉片基部切口處可以直接分化出不定芽，不定芽分化率隨著6-BA和NAA質(zhì)量濃度上升呈現(xiàn)先升高后下降的現(xiàn)象。同時(shí)，在高質(zhì)量濃度（2.0 mg·L-1）的6-BA處理中，葉片外植體大量褐化。在不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合下不定芽分化率存在顯著性差異（P＜0.05），以MS+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA不定芽分化率最高，達(dá)到67.78%，平均每個(gè)外植體分化出不定芽3.90個(gè)。而MS+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA不定芽的誘導(dǎo)率雖僅為14.45%，但平均每個(gè)外植體分化出不定芽數(shù)量最多，達(dá)到6.69個(gè)（表1）。

表1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配比對(duì)半蒴苣苔葉片愈合組織和不定芽分化的影響Table 1 Effect of plant growth regulators on callus induction and adventitious buds differentiation of Hemiboea subcapitata

2.2 半蒴苣苔不定芽增殖培養(yǎng)

不定芽接入增殖培養(yǎng)基，10 d左右腋芽開(kāi)始萌發(fā)，15～20 d不定芽大量發(fā)生（圖1-b）。不定芽接入增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)不定芽增殖倍數(shù)及生長(zhǎng)情況（表2）。研究表明，半蒴苣苔在應(yīng)試的9個(gè)處理中均有較好的增殖率，附加6-BA和NAA的處理平均增殖倍數(shù)較高，處理間不定芽增殖倍數(shù)存在顯著性差異（P＜0.05）。不定芽增殖率隨著6-BA和NAA質(zhì)量濃度上升呈現(xiàn)先升高后下降的現(xiàn)象。不定芽增殖以MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA增殖倍數(shù)最高，達(dá)到23.43。

表2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配比對(duì)半蒴苣苔不定芽增殖的影響Table 2 Effect of plant growth regulators on adventitious buds proliferation of Hemiboea subcapitata

2.3 不定芽生根與移栽

不定芽接入生根培養(yǎng)基，5～8 d不定芽基本開(kāi)始生根，10～15 d不定根大量發(fā)生（圖1-d）。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽生根情況（表3）。結(jié)果表明：半蒴苣苔生根容易，所有處理的生根率均超過(guò)90%，其中IBA質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1的培養(yǎng)基中，生根率均達(dá)到100%。30 d后觀察統(tǒng)計(jì)，MS+1.5 mg·L-1IBA培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基，再生植株平均每株具根9.23條，平均根長(zhǎng)2.78 cm（圖1-e）。

生根植株經(jīng)煉苗后移栽于溫室大棚中，以泥炭和蛭石1∶1均勻混合為移栽基質(zhì)，移栽30 d后，以抽生新芽生長(zhǎng)為移栽成活的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)成活率，發(fā)現(xiàn)移栽成活率達(dá)到90%以上（圖1-f）。

表3 不同質(zhì)量濃度的IBA對(duì)半蒴苣苔生根的影響Table 3 Effects of different concentration of IBA on rooting of Hemiboea subcapitata

圖1 半蒴苣苔組培再生體系Figure 1 Regeneraton of Hemiboea subcapitata

3 討論

苦苣苔科植物組織培養(yǎng)已有大量的報(bào)道［5-10］。湯正輝等［11］以半蒴苣苔葉片為外植體，在誘導(dǎo)芽分化的培養(yǎng)基MS+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)15 d后，葉片切口處開(kāi)始腫脹，并出現(xiàn)較為致密的翠綠色愈合組織，約30 d后，部分切口處出現(xiàn)不定芽。本研究以葉片為外植體，均未誘導(dǎo)出愈合組織，且外植體容易褐化，在未褐化葉片切口基部能直接分化出不定芽。較低濃質(zhì)量度的6-BA（0.5～1.0 mg·L-1）和NAA（0.5～1.0 mg·L-1）對(duì)不定芽分化有利，以MS+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA不定芽分化率最高，達(dá)到67.78%，平均每個(gè)外植體分化出不定芽3.90個(gè)。以半蒴苣苔葉片為外植體進(jìn)行愈合組織的誘導(dǎo)仍有待進(jìn)一步研究。

植物組織培養(yǎng)中，一定質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素利于誘導(dǎo)外植體脫分化和促進(jìn)愈合組織生長(zhǎng)，生長(zhǎng)素質(zhì)量濃度過(guò)低或過(guò)高，均不利于外植體的脫分化和再分化［12］。較低的生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素比率有利于不定芽增殖，但過(guò)高水平的細(xì)胞分裂素促進(jìn)不定芽的誘導(dǎo)和增殖，往往形成大量細(xì)密的無(wú)效的不定芽；而較高的生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素比率有利于不定芽壯苗和生根［13-14］，細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)叢生芽的增殖［15］。半蒴苣苔不定芽增殖過(guò)程中單一使用細(xì)胞分裂素，不定芽增殖倍數(shù)普遍較低，在與低質(zhì)量濃度的NAA（0.5 mg· L-1）配合使用時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，增殖倍數(shù)也隨之增加，而與較高質(zhì)量濃度的NAA（1.0 mg·L-1），不定芽增殖倍數(shù)隨6-BA的質(zhì)量濃度的升高而降低。因此，在半蒴苣苔不定芽增殖中，6-BA與NAA存在交互作用。

現(xiàn)階段，半蒴苣苔野生資源日益枯竭，必須依靠人工栽培種植，而人工栽培主要靠異地引種。本研究成功地建立了半蒴苣苔組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)體系，為半蒴苣苔種苗生產(chǎn)提供了技術(shù)保障，對(duì)半蒴苣苔種質(zhì)資源的保護(hù)和離體保存具有重要意義。

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Plantlet regeneration of Hemiboea subcapitata with subculturing

RUAN Huize1，LI Zhen2，REN Yanyan1，WU Xiaonan1，SHAO Yuhao1，PAN Feixiang1，XIA Guohua1
（1.School of Forestry and Biotechnology，Zhejiang A&F University,Lin’an 311300，Zhejiang，China；2.Forest Resource Administration Station of Lin’an City，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

For protection and exploitation of the medicinal plantHemiboea subcapitata，a rapid propagation system was established through tissue culture for large-scale seedling.Murashige and Skoog（MS）media with different combinations of plant growth regulator［6-benzylaminopurine（6-BA），α-naphthalene acetic acid（NAA）and indole-3-butyric acid（IBA）］ratios was used to optimize the tissue culture ofH.subcapitata，including callus induction,shoot proliferation,and rooting.Results showed that callus induction was difficult，but adventitious shoots could be differentiated directly from leaf explants subcultured in different combinations of growth regulators.The best medium for adventitious bud differentiation was MS+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA+1.5 g·L-1AC with the bud induction frequency of 67.78%,the average number for each leaf explant was 3.90 buds,and the highest was 6.69 buds.The best medium for subculture proliferation was MS+ 0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA with a proliferation of 23.43 times.For all treatments and with different concentrations of IBA,the rooting ratio was more than 90%.This tissue culture technique and rapid propagation system ofH.subcapitatacould be used for large-scale seedling propagation in a short time and for technical guidance in large-scale production.［Ch，1 fig.3 tab.15 ref.］

botany；Hemiboea subcapitata；leaf explants；rapid propagation；tissue culture；plantlet regeneration

Q945.5；S718.3

A

2095-0756（2014）01-0162-05

10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.025

2013-03-22；

2013-06-21

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201210341023）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（2011R412005）；浙江農(nóng)林大學(xué)高等教育研究基金資助項(xiàng)目（GJYB201329）

阮慧澤，從事中藥植物資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：ruanhuize@sina.com。通信作者：夏國(guó)華，實(shí)驗(yàn)師，從事植物資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：zjfc_ghxia@126.com