高效液相色譜法測定養(yǎng)血生發(fā)膠囊中羌活醇和異歐前胡素的含量*

劉慶煥，傅 予，王文彤

（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020）

高效液相色譜法測定養(yǎng)血生發(fā)膠囊中羌活醇和異歐前胡素的含量*

劉慶煥，傅 予，王文彤

（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020）

[目的]建立高效液相色譜法（HPLC）測定養(yǎng)血生發(fā)膠囊中羌活醇和異歐前胡素的含量測定方法。[方法]色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55），流速：1 mL/min，檢測波長：310 nm，柱溫：25℃。[結(jié)果]羌活醇和異歐前胡素分別在0.204～1.224 μg（r=0.999 7）和0.103～0.616 μg（r= 0．999 8）線性關(guān)系良好，平均回收率分別為99.24%（RSD=0.74%）和99.86%（RSD=1.36%）。[結(jié)論]該方法簡便易行、重復(fù)性好，可用于養(yǎng)血生發(fā)膠囊中羌活醇和異歐前胡素的質(zhì)量控制。

養(yǎng)血生發(fā)膠囊；羌活醇；異歐前胡素；高效液相色譜法

養(yǎng)血生發(fā)膠囊收載于《中國藥典》2010年版一部，由制何首烏、熟地黃、羌活、當(dāng)歸等9味中藥組成，具有養(yǎng)血補(bǔ)腎、祛風(fēng)生發(fā)的功效[1]。藥理研究表明，養(yǎng)血生發(fā)膠囊對(duì)碳酸鉈引起的脫毛與體質(zhì)量減輕具有明顯的保護(hù)作用[2]，并能增加C57BL/6脫發(fā)模型小鼠毛囊組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)、毛囊血管數(shù)及毛囊數(shù)，促進(jìn)毛發(fā)生長[3]。目前《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)君藥何首烏2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖進(jìn)行了含量測定。為了更加全面地評(píng)價(jià)養(yǎng)血生發(fā)膠囊的質(zhì)量，本研究建立了養(yǎng)血生發(fā)膠囊中羌活醇和異歐前胡素的含量測定方法，為全面控制其質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器與色譜柱：島津LC-10ATvp高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器。

試劑：甲醇（分析純，天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司），磷酸（分析純，天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司），乙腈（色譜純，迪馬科技有限公司），水為娃哈哈純凈水。

對(duì)照品：羌活醇（中國藥品生物制品檢定所購置，批號(hào)：111820-201001），異歐前胡素（中國藥品生物制品檢定所購置，批號(hào)：110827-200407）。

試驗(yàn)藥品：養(yǎng)血生發(fā)膠囊（藥廠中試樣品，批號(hào)：J01094，J01095，J01096）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55），流速：1 mL/min，檢測波長：310 nm，柱溫：25℃。理論塔板數(shù)以羌活醇計(jì)應(yīng)不低于4 500，以異歐前胡素計(jì)應(yīng)不低于7 000。對(duì)照品、供試品及陰性溶液色譜見圖1～3。

圖1 對(duì)照品溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard substance

圖2 供試品溶液色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample

圖3 陰性溶液色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of negative control

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取羌活醇與異歐前胡素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含羌活醇60 μg、異歐前胡素30 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品約10 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方配比，取除羌活外其他藥材，按2010版《中國藥典》[制法]項(xiàng)下的工藝制成膠囊劑[1]，再按“2.2.2”供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 取羌活醇和異歐前胡素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含羌活醇10.2、20.4、30.6、40.8、51.0、61.2 μg的系列溶液。加甲醇制成每 1 mL含異歐前胡素為 5.13、10.26、15.39、20.52、24.65、30.78 μg的系列溶液，分別精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件分析，分別測定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得羌活醇和異歐前胡素回歸方程分別為Y^=3×106X－53 562（r=0．999 7），Y^=4×106X－61 058（r=0．999 8）。結(jié)果表明，羌活醇和異歐前胡素分別在0.204～1.224μg、0.103～0.616 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，按“2.1”色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)照品中羌活醇峰面積值的RSD為0.86%，異歐前胡素峰面積值的RSD為0.82%。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)J01094），研細(xì)，取6份，按照“2.2.2”供試品溶液制備操作，按“2.1”色譜條件分析，測定，計(jì)算含量。樣品中羌活醇和異歐前胡素含量的RSD分別為0.41%和0.96%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)J01094），研細(xì)，取1份，按照“2.2.2”供試品溶液制備操作，按“2.1”色譜條件分析，精密吸取供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、6、9、24 h進(jìn)樣，測定羌活醇的RSD為1.22%，異歐前胡素的RSD為1.90%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)J01094），研細(xì)，取9份，每份約5 g，精密稱定，分別按照5 g樣品中所含被測成分的50%、100%、150%精密加入羌活醇與異歐前胡素對(duì)照品溶液50 mL，每一個(gè)水平平行3份，按照“2.2.2”供試品溶液制備操作，制得供試品溶液，按“2.1”色譜條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率分別為99.24%和99.86%，RSD分別為0.74%和1.36%，見表1和表2。

表1 羌活醇回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests of notopterol

表2 異歐前胡素回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests of isoimperatorin

2.8 樣品測定 取3份不同批號(hào)制劑，按照“2.2.2”供試品溶液制備操作，按“2.1”色譜條件分析，測定，計(jì)算樣品中羌活醇與異歐前胡素含量，結(jié)果見表3。

表3 養(yǎng)血生發(fā)膠囊中羌活醇與異歐前胡素的含量測定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of content determination of notopterol and isoimperatorin(n=3)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 參照《中國藥典》2010年版一部羌活項(xiàng)下含量測定方法，考察了不同組成的流動(dòng)相（乙腈-水、乙腈-磷酸水和乙腈-甲酸水）系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種酸水系統(tǒng)均能改善峰型，而乙腈-磷酸水系統(tǒng)較乙腈-醋酸水系統(tǒng)分離效果更好。

3.2 提取方法的優(yōu)化 為使被測化合物提取效果最佳，考察了不同提取方法（超聲、回流）、不同提取溶劑（甲醇、乙醇）和不同提取時(shí)間（15、30、45、60 min）等因素對(duì)提取效率的影響，最終確定甲醇超聲30min提取效果最好。

羌活含有揮發(fā)油、香豆素、有機(jī)酸等活性成分[4]。目前多為針對(duì)羌活藥材活性成分檢測的研究[5-11]，而對(duì)其制劑的報(bào)導(dǎo)較少[12-13]，本實(shí)驗(yàn)建立了養(yǎng)血生發(fā)膠囊中羌活醇和異歐前胡素的含量測定方法，為全面控制其質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:946.

[2]劉世明,邊天羽.養(yǎng)血生發(fā)膠囊的藥理實(shí)驗(yàn)研究[J].天津中醫(yī)藥, 1987,4(4):12-15.

[3] 陳芙蓉,岳 南,只德廣,等.養(yǎng)血生發(fā)膠囊對(duì)C57BL/6小鼠毛發(fā)生長的影響及機(jī)制[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2010,25(2):137-140. [4]金盼盼.藥用植物羌活的研究進(jìn)展 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39 (2):815-816,903.

[5]高建邦,宋平順,郁 霞.HPLC法同時(shí)測定羌活中異歐前胡素和阿魏酸含量[J].中藥材,2010,33(2):231-233.

[6]周 毅,蔣舜媛,孫 輝,等.羌活中揮發(fā)油和異歐前胡素的含量測定[J].中國中藥雜志,2007,32(7):566-569.

[7]古麗娜·沙比爾,郭洪祝,郭 慧,等.HPLC法測定羌活中阿魏酸、羌活醇、苯乙基阿魏酸醋和異歐前胡素[J].中草藥,2006,37 (6):937-940.

[8]楊安東,馬 艷,王 笳,等.人工栽培羌活中異歐前胡素的含量測定[J].中國藥房,2006,17(15):1172-1173.

[9]朱美曉,陳 燕,易進(jìn)海,等.羌活藥材薄層色譜鑒別與含量測定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2011,22(1):116-117.

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[13]何 丹,楊 林,張景勍.超高效液相色譜法測定九味羌活顆粒中歐前胡素和異歐前胡素的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,33 (24):2053-2055.

Determination of notopterol and isoimperatorin in Yangxue Shengfa capsules by HPLC

LIU Qing-huan,FU Yu,WANG Wen-tong
（Tianjin Institute of Medical Science，Tianjin 300020,China）

[Objective]To establish the method for determining notopterol and isoimperatorin in Yangxue Shengfa capsules.[Methods] Chromatography column:Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18was used;the mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid(45∶55);the flow rate was 1.0 mL/min;the detection wavelength was 310 nm;the column temperature was set at 25℃.[Results]The calibration curve showed a good linear correlation in the range of 0.204～1.224 μg(r=0.999 7)for notopterol and 0.103～0.616 μg(r=0.999 8) for isoimperatorin.The average recoveries of notopterol and isoimperatorin were 99.24%(RSD=0.74%)and 99.86%(RSD=1.36%). [Conclusion]The method is simple,accurate and specific for the quality control of Yangxue Shengfa capsules.

Yangxue Shengfa capsule;notopterol;isoimperatorin;HPLC

R284

A

1672-1519（2014）11-0693-03

2014-06-16）

（本文編輯：高 杉，馬曉輝）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.11.15

天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合科研課題資助項(xiàng)目（11083）。

劉慶煥（1984-），女，研究實(shí)習(xí)員，主要從事中藥化學(xué)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。