LC-MS/MS法測定升麻中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸含量的研究*

王曉明，張 帆，劉 瑩，2，張 娜，2

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室－省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300193；2．天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457）

·中藥研究·

LC-MS/MS法測定升麻中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸含量的研究*

王曉明1，張 帆1，劉 瑩1，2，張 娜1，2

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室－省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300193；2．天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457）

[目的]建立LC－MS/MS測定升麻藥材中3種苯丙酸類成分含量的方法。[方法]采用ACQUITY UPLC? BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）色譜柱，乙腈－0．1%甲酸水為流動相，梯度洗脫，流速為：0．3 mL/min；質(zhì)譜檢測器：采用ESI電離源，負(fù)離子檢測，MRM監(jiān)測模式，對升麻藥材中苯丙酸類成分咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸進(jìn)行含量測定。[結(jié)果]咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸的線性范圍分別為5～100 ng/mL，10～200 ng/mL，50～1 000 ng/mL，線性關(guān)系良好，最低定量限分別為5、10和50 ng/mL，加樣回收率97．83%～98．40%。[結(jié)論]該方法簡便，快速，精密度高，重復(fù)性好，可用于同時(shí)測定升麻中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸的含量。

LC－MS/MS；升麻；咖啡酸；阿魏酸；異阿魏酸

升麻具有發(fā)表透疹、清熱解毒、升舉陽氣的功效，主要用于風(fēng)熱頭痛、齒痛、口瘡、咽喉腫痛、麻疹不透、陽毒發(fā)斑、脫肛、子宮脫垂[1－7]。升麻中主要含有機(jī)酸、三萜化合物和香豆素等化學(xué)成分，其中苯丙酸類成分主要有咖啡酸（caffeic acid）、阿魏酸（ferulic acid）和異阿魏酸（isoferulic acid）等?？Х人峋哂锌咕?、抗病毒、中樞興奮、解毒、凝血的作用；阿魏酸可抑制血小板聚集、抗血栓形成、解除血管平滑肌痙攣、改善心肌缺血、抗炎止痛、抗紫外線輻射、抗自由基以及調(diào)節(jié)人體免疫功能等；異阿魏酸具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎的作用[8－12]。

《中華人民共和國藥典》（2010年版）記載，升麻是以異阿魏酸的含量作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。雖然國內(nèi)已有利用高效液相色譜法－紫外檢測器（HPLC－UV）同時(shí)測定升麻中咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸含量的文獻(xiàn)報(bào)道[13－14]，但該方法耗時(shí)較長，檢測靈敏度較差。為此本研究建立液質(zhì)聯(lián)用/質(zhì)譜（LC－MS/MS）同時(shí)測定升麻藥材中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸含量的方法，可大大節(jié)省檢測時(shí)間，且具有較高的靈敏度，可為升麻藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)試藥與儀器

1.1 試藥 甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific公司），乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司），甲酸（色譜純，美國MREDA公司，≥96．0%），超純水（Milipore制備）。

咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品（均購自中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%），染料木素Genistein（由沈陽藥科大學(xué)提供，純度＞98%）。

升麻藥材于2013年購買于河北省安國藥材市場，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥副教授鑒定為興安升麻Cimicifuga．dahurica（Turcz．）Maxim．。

1.2 儀器 Waters Acquity UPLC－Quattro Premier XE液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，MassLynx 4．1工作站，序列號：VAB1217；超純水器（Millipore公司，Mill－QⅡ型）；萬分之一天平（德國Sartorius公司，BP121S）；旋渦混合器（SCILOGEX MX－S vortexer）；高速離心機(jī)（Hettich MIKRO 220R centrifuge）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ－250E）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）；流動相：乙腈－0．1%甲酸水溶液，梯度洗脫；流速：0．3 mL/min；柱溫：50℃；進(jìn)樣體積：10 μL。梯度洗脫程序見表1，各成分的色譜分離情況見圖1～2。

2.2 質(zhì)譜條件 采用ESI電離源，負(fù)離子掃描，MRM檢測模式。毛細(xì)管電壓：2.8 kV；離子源溫度：120℃；去溶劑化溫度：350℃；去溶劑化氣流強(qiáng)度：650 L/Hr；錐體氣流強(qiáng)度：50 L/Hr；碰撞電壓在16～27 V。

經(jīng)優(yōu)化后最終確定各化合物檢測離子對為：咖啡酸離子對178.61/134.61，阿魏酸離子對192.77/ 133.63，異阿魏酸離子對192.80/133.63，內(nèi)標(biāo)染料木素離子對268.73/132.53。見圖3～6。

表1 色譜梯度洗脫程序Tab.1 HPLC gradient elution program

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)色譜圖Fig.1 Standard and internal standard chromatogram

圖2 升麻藥材樣品色譜圖Fig.2 Sample chromatogram of Rhizoma Cimicifugae

圖3 咖啡酸二級質(zhì)譜圖Fig.3 Fragmentation of caffeic acid

圖4 阿魏酸二級質(zhì)譜圖Fig.4 Fragmentation of ferulic acid

圖5 異阿魏酸二級質(zhì)譜圖Fig.5 Fragmentation of isoferulic acid

圖6 染料木素二級質(zhì)譜圖Fig.6 Fragmentation of Genistein

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的配制 精密稱取咖啡酸2.0 mg、阿魏酸4.0 mg置100 mL容量瓶中，異阿魏酸5.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品置25 mL容量瓶中，加甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶2）定容至刻度，分別配制成濃度為20、40和200 μg/mL的2種標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

精密移取2種標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各10mL置100mL容量瓶中，加入甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶2）定容至刻度，得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取染料木素5.0 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，混勻后稀釋，最終制成濃度為100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

2.3.3 供試品溶液的配制 精密稱取升麻藥材粉末（過10目篩）0.50 g置25 mL容量瓶中，加入甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶2），超聲40 min，冷卻至室溫后定容。搖勻，取適量提取液，15 000 r/min離心10 min，精密移取上清液50 μL，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋20倍后進(jìn)樣，測定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察 取“2.3.1”中混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋，得系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密移取各系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL，準(zhǔn)確加入“2.3.2”中的內(nèi)標(biāo)溶液稀釋20倍，最終配制成咖啡酸濃度為5、10、25、37.5、50、75、100 ng/mL；阿魏酸濃度為10、20、50、75、100、150、200 ng/mL；異阿魏酸濃度為50、100、250、375、500、750、1 000 ng/mL的混標(biāo)溶液，渦旋，混勻，進(jìn)樣。

表2 3個(gè)化合物的回歸方程和線性關(guān)系Tab.2 The calibration curves and linearity range for the three components of the assay

2.4.2 精密度與準(zhǔn)確度 分別取低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照“2.4.1線性關(guān)系的考察”方法進(jìn)行操作，測定咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸與內(nèi)標(biāo)染料木素的峰面積比值，代入回歸方程，計(jì)算濃度。結(jié)果顯示：3個(gè)化合物的精密度RSD<15%，準(zhǔn)確度偏差小于15%。

2.4.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的升麻藥材適量，分別加入適量的咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸與內(nèi)標(biāo)染料木素，平行操作6份，按照“2.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理與測定，以(測得值-基礎(chǔ)值)/加標(biāo)值×100%計(jì)算回收率，結(jié)果顯示：3個(gè)化合物的回收率分別為咖啡酸98.40%、阿魏酸98.12%、異阿魏酸97.83%。

2.4.4 樣品穩(wěn)定性 取系列混標(biāo)溶液樣品，于4℃條件下分別放置0、2、4、8、10、12 h，以測定樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示RSD<5%，表明樣品溶液在4℃條件下穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性考察 精密稱取同一產(chǎn)地升麻藥材適量，按照“2.3.3”方法操作，平行制備6份樣品，進(jìn)樣，測得咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.62%，1.91%和1.38%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.6 樣品含量測定 分別精密稱取不同產(chǎn)地升麻藥材適量，按照“2.3.3”項(xiàng)下的方法，每產(chǎn)地的藥材平行操作6份，進(jìn)行樣品的含量測定。

表3 不同產(chǎn)地升麻藥材中3種化合物的含量(n=6)Tab.3 Contents of three compants of Rhizoma Cimicifugae from different places(n=6)mg/g

3 討論

3.1 定量指標(biāo)的選擇 升麻在2010版《藥典》采用的含量測定方法是LC-UV法，且僅對異阿魏酸的含量（不得少于0．1%）有要求。鑒于咖啡酸、阿魏酸同樣具有抗炎、抗氧化等功效，也是升麻的主要活性成分，因此本實(shí)驗(yàn)除了測定異阿魏酸，對咖啡酸、阿魏酸也進(jìn)行了含量測定。液質(zhì)聯(lián)用法雖在之前版本的《藥典》中已在附錄中收載，但直到2010年，《藥典》才正式引入正文用于川楝子、千里光等中藥中微量成分的含量測定，用以控制此類藥材的質(zhì)量。升麻中阿魏酸、異阿魏酸互為同分異構(gòu)體，含量相當(dāng)，本實(shí)驗(yàn)建立的LC-MS/MS法可有效進(jìn)行升麻藥材質(zhì)量的評價(jià)。

3.2 電離方式的選擇 質(zhì)譜條件的優(yōu)化是通過將1 μg/mL的咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)由蠕動泵10 μL/min連續(xù)進(jìn)樣，并對各質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行考察，以待測物響應(yīng)值為參考。由于測定的化合物均為酚酸，易產(chǎn)生[M-H]-離子，所以實(shí)驗(yàn)中選擇負(fù)離子方式進(jìn)行掃描。通過ESI源和APCI源的比較，發(fā)現(xiàn)采用ESI源具有更高的靈敏度和專屬性，故本實(shí)驗(yàn)選用ESI離子源。

3.3 流動相的選擇 由于阿魏酸和異阿魏酸互為同分異構(gòu)體，色譜行為相似，實(shí)驗(yàn)最初分析比較了乙腈－水與甲醇－水的分離效果，結(jié)果表明乙腈－水比甲醇－水分離效果更好。咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸均為酚酸，對pH值較敏感，故在流動相中加入適量HCOOH，以提高響應(yīng)、改善峰形。在色譜條件優(yōu)化過程中，分別對比了乙腈－0．05%甲酸、乙睛－0．1%甲酸的分離效果，結(jié)果流動相為乙睛－0．1%甲酸時(shí)，阿魏酸、異阿魏酸分離最好，因此確定其為流動相。3.4 色譜柱的選擇 實(shí)驗(yàn)初期選用C18（4．6 mm× 150 mm，3．5 μm）色譜柱，阿魏酸與異阿魏酸的分離效果較好，但是出峰時(shí)間過長，因而換用較短的ACQUITY UPLC?BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）色譜柱，調(diào)試液相條件，在保證分離效果的情況下，分析時(shí)間明顯縮短。

4 結(jié)論

本研究建立了LC－MS/MS測定升麻中3個(gè)苯丙酸類成分含量的方法，結(jié)果表明該方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于升麻藥材的質(zhì)量控制。

[1]國家藥典委員會．《中國藥典》2005年版一部[S]．北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:50．

[2]陳炳權(quán)．濟(jì)川煎加減治療老年習(xí)慣性便秘32例[J]．天津中醫(yī)藥, 2004,21(3):184．

[3]張滋明,李曉剛,蘇占輝,等．興安升麻地上部分及地下部分治療子宮脫垂的對比研究[J]．天津中醫(yī)藥,2013,30(9):529－530．

[4]鄭素心．補(bǔ)中益氣湯在內(nèi)科的臨床應(yīng)用[J]．天津中醫(yī)藥,2004, 21(6):520－521．

[5]杜志堅(jiān)．升麻鱉甲湯在皮膚病中的應(yīng)用[J]．天津中醫(yī)藥,1993, 10(6):7－11．

[6]金素安,郭 忻．升麻功用演變[J]．湖南中醫(yī)雜志,2011,27(1): 88－89．

[7]李今垣．論“升麻”[J]．天津中醫(yī)藥,1990,7(6):30－31．

[8]Shiyi Ou,Kin－Chor Kwork．Ferulic acid:Pharmaceutical functions, preparation and applications in foods[J]．ScienceofFoodandAgriculture, 2004,84(11):1261－1269．

[9]喬福斌,張建芳,李成田,等．燈盞花素、阿魏酸鈉聯(lián)合貝那普利治療早期糖尿病腎病的療效觀察[J]．天津中醫(yī)藥,2010,27(6): 458－459．

[10]王 靜,張密霞,莊朋偉,等．川芎嗪、阿魏酸對心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附的影響[J]．天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,26(3): 146－149．

[11]胡益勇,徐曉玉．阿魏酸的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展 [J]．中成藥,2006, 28(2):253－255．

[12]韓 斐,王 婷．阿魏酸鈉聯(lián)合貝那普利治療早期糖尿病腎病的療效研究[J]．新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(7):942－945．

[13]靳 波,劉友平,陳鴻平,等．RP－HPLC法同時(shí)測定升麻藥材阿魏酸、異阿魏酸和咖啡酸含量[J]．遼寧中醫(yī)雜志,2011,38(5): 950－952．

[14]司丹丹,李 清,陳曉輝,等．RP－HPLC法同時(shí)測定升麻中3種有機(jī)酸的含量[J]．沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,24(12):754－757．

LC-MS/MS determination of caffeic acid,ferulic acid acid,and isoferulic acid in Rhizoma Cimicifugae

WANG Xiao-ming1,ZHANG Fan1,LIU Ying1,2,ZHANG Na1,2
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Modern Chinese Medicine-Province and Ministry Coestablished State Key Laboratory Cultivation Base,Tianjin Key Laboratory Tianjin 300193,China;2.Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine,Tianjin,300457）

[Objective]To develop a LC－MS/MS method for simultaneous determination of caffeic acid,ferulic acid and isoferulic acid in the Rhizoma Cimicifugae．[Methods]Chromatographic separation was achieved with gradient elution by a ACQUITY UPLC?BEH C18coloum(2．1 mm×100 mm,1．7 μm)hyphenated to a mass spectrometer system was operated under the MRM mode with electrospray negative ionization．The mobile phase was acetonitrile－0．1%formic acid aqueous and the flow rate was 0．3 mL/min．[Results]Caffeic acid, ferulic acid and isoferulic acid showed good linearity in the range of 5～100 ng/mL,10～200 ng/mL,50～1 000 ng/mL．The lower limit of quantification of the 3 essential compounds was 5,10 and 50 ng/mL respectively．The average recoveries of the method were in the range of 97．83%～98．40%．[Conclusion]The method is fast,sensitive and reproducible．It can be used for the simultaneous determination of caffeic acid,ferulic acid and isoferulic acid in the Rhizoma Cimicifuga．

LC－MS/MS；Rhizoma Cimicifugae；caffeic acid；ferulic acid；isoferulic acid

R285．5

A

1672-1519（2014）11－0686－04

2014-09-09）

（本文編輯：高 杉，馬曉輝）

10．11656/j．issn．1672－1519．2014．11．13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81001633，81173523，81303182），國家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（2012ZX09101202），國家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB723504）。

王曉明（1982－），女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，從事體內(nèi)藥物分析研究。