中藥添加劑對(duì)吸煙大鼠呼吸功能及免疫功能的影響

盧國彥，張 玥，孟慶乃，鄭賽晶，周 昆，胡利民

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.上海煙草（集團(tuán)）公司技術(shù)中心，上海 200082）

·實(shí)驗(yàn)研究·

中藥添加劑對(duì)吸煙大鼠呼吸功能及免疫功能的影響

盧國彥1，張 玥1，孟慶乃2，鄭賽晶2，周 昆1，胡利民1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.上海煙草（集團(tuán)）公司技術(shù)中心，上海 200082）

[目的]評(píng)價(jià)中藥添加劑對(duì)大鼠吸煙所致的呼吸功能及免疫功能的改善效果。[方法]吸煙組大鼠在煙氣環(huán)境中每日暴露1 h，對(duì)照組大鼠在煙機(jī)無卷煙空吸環(huán)境中每日暴露1 h，持續(xù)3個(gè)月，測(cè)定肺功能，臟器系數(shù)，腹主動(dòng)脈取血測(cè)定血清中抗氧化、免疫因子指標(biāo)。[結(jié)果]各吸煙組大鼠用力肺活量（FVC）與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但FEV1/FVC%（一秒率）有所下降，其中3號(hào)煙組與0號(hào)煙組相比顯著升高（P<0.05）。2、3號(hào)煙組用力中期呼氣流速（FEF25%～75%）、最大呼氣中段流量（MMF）、最大呼氣流量（PEF）各項(xiàng)指標(biāo)與0號(hào)煙組相比明顯改善，且與對(duì)照組值接近；1、2、3號(hào)煙組大鼠肺臟、胸腺臟器系數(shù)較0號(hào)煙組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。1號(hào)煙組脾臟系數(shù)極顯著高于0號(hào)煙組（P<0.01），3號(hào)煙組脾臟系數(shù)顯著高于0號(hào)煙組（P<0.05）；與0號(hào)煙組相比，2、3號(hào)煙組超氧化物歧化酶（SOD）顯著升高（P<0.05），丙二醛（MDA）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1、2、3號(hào)煙組γ-干擾素（IFN-γ）均高于0號(hào)煙組，白介素-1β（IL-1β）均低于0號(hào)煙組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與0號(hào)煙組相比，1號(hào)煙組能極顯著降低IL-6（P<0.001），3號(hào)煙組能顯著降低IL-12（P<0.05）。[結(jié)論]2、3號(hào)添加劑可改善吸煙引起的大鼠肺功能降低，和對(duì)吸煙造成的抗氧化能力下降有保護(hù)作用。1、3號(hào)添加劑均可一定程度上改善因吸煙引起的大鼠免疫力下降，由此得出3號(hào)添加劑為卷煙的理想添加劑。

卷煙；大鼠；肺功能；免疫功能

吸煙被世界衛(wèi)生組織稱為繼戰(zhàn)爭、饑荒、瘟疫、污染之后的人類“第5種威脅”。據(jù)報(bào)道，中國有3億吸煙者，7.4億人受到二手煙危害，每年有120萬人死于煙草相關(guān)疾病[1-2]。吸煙有害健康，吸食香煙可誘發(fā)多種疾病，如肺癌、支氣管炎、肺氣腫、口腔癌、膀胱癌[3-4]等。明知吸煙有害健康，但很少有人能夠完全放棄吸煙。煙草與中藥同源，本研究運(yùn)用中藥理論，在卷煙中加入中藥添加劑，通過發(fā)揮中藥的減毒作用，減少乃至消除吸煙對(duì)人體的危害。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了中藥添加劑對(duì)吸煙3個(gè)月大鼠的肺功能和免疫功能的改善效果。

1 材料

1.1 受試樣品 0、1、2、3號(hào)4種卷煙，其中0號(hào)煙為無添加劑的普通卷煙，1、2、3號(hào)煙是在0號(hào)煙的基礎(chǔ)上添加3種不同的添加劑。1號(hào)煙加入太子參、杭白芍、枸杞子、丹參、浙貝母等。2號(hào)煙加入西洋參、杭白芍、杏紅、皂角刺、丹參等。3號(hào)煙加入沙參、麥門冬、杭白芍、黃芩、西洋參、杏紅、皂角刺、丹參等。本實(shí)驗(yàn)所用卷煙由上海煙草(集團(tuán))公司提供。中藥添加劑卷煙制法如下：將生藥材回流提取后減壓濃縮，至生藥材與浸膏之比為1∶1，加入浸膏3倍體積量的95%乙醇，24 h后抽濾，取上清液減壓濃縮至稠膏，最終稠膏濃度與生藥材之比為1∶2。所得稠膏以1%的體積比噴灑在煙絲上，烘干后制成卷煙。

1.2 動(dòng)物與分組 Wistar大鼠，雌雄各半，SPF級(jí)，由北京華阜康生物科技股份有限公司購進(jìn)，許可證號(hào)：SCXK（京）2005-0013。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。100只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組各20只。分別為對(duì)照組、0號(hào)煙組、1號(hào)煙組、2號(hào)煙組、3號(hào)煙組，大鼠吸煙組吸煙量均為20支/日。3個(gè)月后，對(duì)照組死亡3只，0號(hào)煙組無死亡，1號(hào)煙組死亡1只，2號(hào)煙組死亡3只，3號(hào)煙組死亡1號(hào)。取臟器時(shí)發(fā)現(xiàn)3號(hào)煙組臟器異常1只。取血時(shí)，0號(hào)煙組失敗3只，1號(hào)煙組失敗3只。

1.3 藥品及試劑 丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-12（IL-12）、γ-干擾素（IFN－γ）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 JJC-Ⅱ型自動(dòng)吸煙機(jī)（中國船舶科學(xué)研究中心制造，國家煙草專賣局科教司監(jiān)制），恒壓閥、恒流閥、流量計(jì)（德國FESTO），PUMA無油直接傳動(dòng)式空氣壓縮機(jī)（福建龍海力霸通用機(jī)械有限公司），JJ2000精密電子天平（常熟雙杰測(cè)試儀器廠），AE200S電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），多功能讀板儀FlexStation3型（美國Molecular Devices公司），離心機(jī)LDZ5-2型（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），AniRes 2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)（北京貝蘭博科技有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物煙氣暴露方式 將通過自動(dòng)吸煙機(jī)產(chǎn)生的卷煙主流煙氣和空氣以一定的比例稀釋混合，再以恒流方式到達(dá)僅鼻吸煙暴露（nose-only）裝置[5-6]，保證各吸煙孔的煙氣被大鼠吸入。吸煙機(jī)抽吸容量為每口35 mL，間隔每分鐘抽吸1口，每口抽吸時(shí)間為2 s。吸煙組大鼠在nose-only系統(tǒng)的煙氣環(huán)境中暴露1 h，對(duì)照組在煙機(jī)無卷煙空吸狀態(tài)下暴露1 h，持續(xù)3個(gè)月。吸煙組大鼠最初3 d按照7、14、20支煙逐步增加，使其有一定的適應(yīng)期。

2.2 肺功能檢測(cè) 每周稱動(dòng)物體質(zhì)量，吸煙3個(gè)月后腹腔注射戊巴比妥鈉，固定于鼠板上，分離、暴露氣管，在氣管軟骨環(huán)之間水平開口，插入金屬插管，與檢測(cè)儀相連，得到：用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼氣容積（FEV1）、第2秒用力呼氣容積（FEV2）、一秒率（FEV1/FVC%）、FEV2與FVC的比值百分?jǐn)?shù)（FEV2/FVC%）、用力中期呼氣流速（FEF25%～75%）、最大用力呼氣中期時(shí)間（FMFT）、最大呼氣中期流速（MMF）、最大用力呼氣流速（PEF）、用力呼氣時(shí)間（FET）。

2.3 臟器系數(shù) 肺功能檢測(cè)后，腹主動(dòng)脈取血5mL，放盡余血，取肺臟、脾臟和胸腺，稱質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器濕質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）× 100%。

2.4 抗氧化功能和免疫功能檢測(cè) 將血液3000r/min離心10 min，取上清液，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清中SOD，硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定血清中MDA，ELISA法檢測(cè)IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-1β。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時(shí)，若方差齊采用LSD法，若方差不齊用Dunnett’s T3法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)肺功能的改善 各吸煙組大鼠肺活量（FVC）與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但FEV1/ FVC%有所下降，說明吸煙組大鼠存在氣道阻塞性通氣障礙，其中3號(hào)煙組與0號(hào)煙組相比顯著升高（P<0.05），說明氣道阻塞得到改善。2、3號(hào)煙組FEF25%～75%、MMF、PEF各項(xiàng)指標(biāo)與0號(hào)煙組相比明顯改善，且與對(duì)照組接近，表明2、3號(hào)添加劑可明顯抑制吸煙導(dǎo)致的大鼠呼吸功能下降。見圖1。

圖1 對(duì)大鼠肺功能的改善Fig.1 The improvement of the lung function of rats

3.2 對(duì)臟器系數(shù)的影響 各吸煙組大鼠與對(duì)照組相比體質(zhì)量均降低，見圖2。1、2、3號(hào)煙組大鼠肺臟、胸腺臟器系數(shù)較0號(hào)煙組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1號(hào)煙組脾臟系數(shù)顯著高于0號(hào)煙組。（P<0.01），3號(hào)煙組脾臟系數(shù)高于0號(hào)煙組（P<0.05），見表1。

圖2 對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Fig.2 The effects on the body weight of rats

表1 對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響（±s）Tab.1 The effects on viscera coefficient of rats（±s）%

表1 對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響（±s）Tab.1 The effects on viscera coefficient of rats（±s）%

注：與0號(hào)煙組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別n 肺臟 胸腺 脾臟對(duì)照組 17 0.656 0±0.245 7 0.093 6±0.034 0 0.215 6±0.051 0 0號(hào)煙組 20 0.708 8±0.145 1 0.073 4±0.024 2 0.213 5±0.039 1 1號(hào)煙組 19 0.725 2±0.162 9 0.085 2±0.029 5 0.248 3±0.038 1** 2號(hào)煙組 17 0.820 8±0.353 0 0.070 2±0.024 0 0.246 9±0.085 8 3號(hào)煙組 18 0.714 1±0.147 0 0.075 0±0.031 7 0.236 6±0.043 2*

3.3 對(duì)SOD、MDA的影響 與0號(hào)煙組相比，2、3號(hào)煙組SOD顯著升高（P<0.05），MDA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 對(duì)大鼠抗氧化功能的影響Fig.3 The effects on the antioxidant function of rats

3.4 對(duì)IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-1β的影響 1、2、3號(hào)煙組IFN-γ均高于0號(hào)煙組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IL-1β均低于0號(hào)煙組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與0號(hào)煙組相比，1號(hào)煙組能極顯著降低IL-6（P< 0.001），3號(hào)煙組能顯著降低IL-12（P<0.05），見表2。

表2 對(duì)免疫因子的影響（±s）Tab.2 The effects on immune factors（±s）pg/mL

表2 對(duì)免疫因子的影響（±s）Tab.2 The effects on immune factors（±s）pg/mL

注：與0號(hào)煙組比較，*P<0.05，**P<0.001。

組別 n IFN-γ IL-6 IL-12 IL-1β對(duì)照組 17 390.78±141.01 1 201.51±158.17 192.04±87.35 19.59±8.18 0號(hào)煙組 17 227.83±79.34 1 409.04±219.96 497.35±172.56 31.82±5.75 1號(hào)煙組 16 309.86±185.03 1 224.97±193.03**419.86±128.72 24.49±9.21 2號(hào)煙組 17 277.96±37.17 1 412.11±280.63 465.49±160.03 26.90±10.56 3號(hào)煙組 19 311.76±123.48 1 449.75±114.50 394.38±197.44*27.20±10.34

4 討論

本實(shí)驗(yàn)主要評(píng)價(jià)中藥添加劑對(duì)吸煙導(dǎo)致大鼠肺功能降低的保護(hù)作用。吸煙3個(gè)月后，大鼠肺活量與對(duì)照組相比無變化，若延長吸煙時(shí)間，形成重度吸煙，肺活量將降低，肺功能降低[7]。但FEV1、FEV1/ FVC、PEF等呼吸功能指標(biāo)顯著下降，氣道阻力增加，表明普通煙組大鼠吸煙3個(gè)月后存在氣道通氣障礙，而2、3號(hào)煙組各項(xiàng)指標(biāo)與普通煙組相比明顯改善，表明2、3號(hào)煙所使用的中藥添加劑在抑制吸煙大鼠肺功能降低方面有一定的作用。

煙氣中的有害物質(zhì)[8-12]，包括多種氧化劑，大量的自由基等，破壞了細(xì)胞氧化抗氧化的平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞ROS升高，造成氧化應(yīng)激，氧化損傷DNA、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，細(xì)胞毒性物質(zhì)MDA[13-14]產(chǎn)生增多，最終誘發(fā)各種疾病。MDA可反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反應(yīng)出細(xì)胞損傷的程度。SOD是維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)平衡的重要抗氧化物質(zhì)，主要反映機(jī)體清除氧自由基的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0號(hào)煙組相比，2、3號(hào)煙組可顯著升高SOD，對(duì)吸煙造成的抗氧化能力下降有保護(hù)作用。

IFN-γ主要通過促進(jìn)T細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫。IL-1β是一個(gè)重要的促炎因子，能激活炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，引起肺部炎癥，能促進(jìn)慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的發(fā)展[15]。IL-6是一種促炎因子，可導(dǎo)致內(nèi)皮血管損傷，抑制內(nèi)皮修復(fù),加劇血管受損,導(dǎo)致肺損傷，加劇肺功能惡化[16]。IL-1β可觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致血清細(xì)胞因子明顯升高，促進(jìn)疾病發(fā)展。結(jié)果顯示，1、2、3號(hào)煙組均能升高IFN-γ，降低IL-1β。其中1號(hào)添加劑可顯著降低IL-6，3號(hào)添加劑可顯著降低IL-12，其余無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，2、3號(hào)添加劑可改善吸煙引起的大鼠肺功能降低，對(duì)吸煙造成的抗氧化能力下降有保護(hù)作用。1、3號(hào)添加劑均可一定程度上改善因吸煙引起的大鼠免疫力下降。前期研究證實(shí)了2、3號(hào)添加劑能顯著延長小鼠咳嗽潛伏期50%，降低咳嗽次數(shù)20%。由此可知3號(hào)添加劑為卷煙中的理想添加劑。

[1]李 穎.香煙“降焦”為何不能“減害”？[N].科技日?qǐng)?bào),2012-6-16 (4).

[2]李澤庚，王傳博，彭 波，等.慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺證大鼠模型的建立[J].天津中醫(yī)藥，2010,27（1）:43-45.

[3]趙保路.吸煙、自由基和心臟病[J].自然雜志,1989，12(8):610-611

[4]趙保路.吸煙、自由基和癌[J].自然雜志,1989,12(6):453-460.

[5]畢 波，周 昆，鄭賽晶，等.卷煙誘導(dǎo)小鼠咳嗽和痰液分泌模型的建立[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2010，27（2）:10-12.

[6]金永明，鄭賽晶.用于卷煙煙氣毒理研究的動(dòng)物熏煙系統(tǒng)[P].專利申請(qǐng)?zhí)?CN200920208605.4

[7] 李有倉.長期吸煙者的肺氣腫和肺功能損害特征[J].中國臨床康復(fù)，2004，8（33）:7393-7395.

[8] 魏民巍，鄭賽晶，孟慶乃，等.中藥添加劑降低煙氣懸凝物誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].河南中醫(yī)，2012，32（12）:1613-1615.

[9]高之清.香煙煙霧中的毒物及其危害[J].化學(xué)世界,2005,(4):255-256.

[10]趙保路.氧自由基和天然抗氧化劑[M].北京:科學(xué)出版社,1999.

[11]方允中,鄭榮梁.自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

[12]張國安,王 復(fù)，李桂貞，等.卷煙煙氣中多環(huán)芳烴的分析方法[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，27（2）：186-190.

[13]Fahn HJ,Wang LS,Kao SH,et al．Smoking-associated mitochondrial DNA mutations and lipid peroxidation in human Lung Tissues[J]．Am J ResPir Cell Mol Biol,1998,19(6):901－909.

[14]宋 雁，張曉鵬，賈旭東.吸煙引起人體氧化損傷的可能機(jī)制[J].癌變·畸變·突變，2009，21(1):50-531.

[15]張 葵，劉良麗，歐江琴，等.加減補(bǔ)肺湯對(duì)COPD肺氣虛證模型大鼠支氣管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8的影響[J].天津中醫(yī)藥，2008,25（6）:491-493.

[16]Joppa P,Petrasova D,Stancak B,et al.Systemic inflammation in patients with COPD and pulmonary hypertension[J].C hest,2006, 130（2）:326-333.

Effects of Chinese herbal medicine additives on respiratory and immune function of cigarette-smoking rats

LU Guo-yan1,ZHANG Yue1,MENG Qing-nai2,ZHENG Sai-jing2,ZHOU Kun1,HU Li-min1
（1.Tianjin Key Laboratory of Chinese medicine Pharmacology,Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.The Technical Center of Shanghai Tobacco(Group)Company, Shanghai 200082,China）

[Objective]To evaluate the improving effect of Chinese herbal medicine additives on the respiratory and immune function of cigarette-smoking rats.[Methods]The smoking group was exposed in the flue gas of nose-only system for 1 hour every day,while the control group was exposed in the system without cigarette for 1 hour.Three months later the pulmonary function and the organ coefficient were determined.Taking blood from the abdominal aorta the serum antioxidant and immune factors were measured.[Results]The forced vital capacity of smoking rats was the same with the control group.FEV1/FVC%,however,was declined.Among them,No.3 tobacco group were increased significantly compared with the 0 tobacco group(P<0.05).At the same time,the index of forced expiratory flow 25%～75% (FEF25%～75%),maximal mid-expiratory flow (MMF)and peak expiratory flow (PEF)in No.2 and No.3 tobacco group were improved significantly compared with 0 tobacco group.They were closed to control group.Spleen organ coefficient of 1,3 tobacco group was significantly higher than that of 0 smoke group(P<0.05).No.2,3 tobacco group were increased significantly compared with the 0 tobacco group on SOD(P<0.05)without significant difference on MDA.No.1,2,3 tobacco group were higher comparing with 0 tobacco group.The IFN-γ was increased and the IL-1β decreased.No.1 tobacco group could significantly reduce the IL-6(P<0.001)and No.3 tobacco group could significantly reduce the IL-12(P<0.05).[Conclusion]No.2,3 additives can effectively inhibit the declining of respiratory function in rats induced by smoking,and protect the oxidative damage.No.1,3 additive can partly improve the immunity of rats caused by smoking.No.3 additive is the ideal additive for cigarettes.

cigarettes;rats;lung function;immune function

R285.5

A

1672-1519（2014）11-0677-04

2014-05-27）

（本文編輯：馬 英，馬曉輝）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.11.11

盧國彥（1986－），女，碩士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

胡利民，E-mail:huliminth@126.com。