三甲散對(duì)HSC-T6細(xì)胞α-SMA、TIMP-1和ROCK-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響*

鄭旭銳，惠 毅，閆曙光，宋 逍，曹 寧，王禮鳳，晁 旭

（陜西中醫(yī)學(xué)院，咸陽(yáng) 712046）

三甲散對(duì)HSC-T6細(xì)胞α-SMA、TIMP-1和ROCK-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響*

鄭旭銳，惠 毅，閆曙光，宋 逍，曹 寧，王禮鳳，晁 旭

（陜西中醫(yī)學(xué)院，咸陽(yáng) 712046）

[目的]檢測(cè)三甲散含藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制-1（TIMP-1）和蛋白激酶（ROCK-Ⅰ）的表達(dá)，從而研究三甲散對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖作用的影響。[方法]以三甲散含藥血清干預(yù)HSC-T6細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和免疫印跡（Western blot）技術(shù)，檢測(cè)三甲散含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞中α-SMA、TIMP-1和ROCK-Ⅰ的蛋白表達(dá)。[結(jié)果]三甲散和Y-27632顯著地降低了HSC-T6細(xì)胞α-SMA、ROCK-Ⅰ和TIMP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。[結(jié)論]三甲散可降低HSC-T6細(xì)胞ROCK-Ⅰ蛋白、TIMP-1和α-SMA的表達(dá),從而抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖。

三甲散；α-SMA；TIMP-1；ROCK-Ⅰ；蛋白表達(dá)

肝纖維化是指肝細(xì)胞發(fā)生炎癥刺激或壞死時(shí)，各種致病因子致肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）增生和降解之間失去應(yīng)有的平衡，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積、肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉淀的病理過(guò)程，其進(jìn)一步發(fā)展即可以導(dǎo)致肝硬化、肝癌。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，中國(guó)約有3 000萬(wàn)慢性肝炎患者，其中約有20%～40%可發(fā)展為肝硬化乃至肝細(xì)胞癌[1]。肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞來(lái)源，是肝纖維化形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）可作為HSC活化的標(biāo)志。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）是組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）家族中作用最強(qiáng)的成員，為促纖維化因子[2]。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK-Ⅰ）是由屬于小G蛋白超家族的Rho小G蛋白激活的，它可以調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，包括表型、運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)分裂、凋亡、基因表達(dá)等，從而激活肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。三甲散源自明代末年著名溫病學(xué)家吳又可的著作《溫疫論》，其具有融滋陰、活血、行氣、逐瘀的作用，對(duì)邪正交灼而成久病入絡(luò)的痼疾頗為適宜，近年來(lái)三甲散日益受到現(xiàn)代醫(yī)家的關(guān)注[3-7]，本研究擬從三甲散對(duì)HSC-T6細(xì)胞Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK-Ⅰ）、TIMPs和細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)。初步揭示三甲散抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

三甲散藥液：由鱉甲、龜甲、穿山甲、地鱉蟲(chóng)、生牡蠣、白僵蠶、白芍、當(dāng)歸、甘草組成，以上藥物均購(gòu)自陜西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房，藥物加水浸泡常規(guī)煎煮、過(guò)濾，水浴蒸發(fā)濃縮至每毫升含生藥3.5 g。三甲散按10 mL/kg藥液經(jīng)胃灌藥，1次/d，連續(xù)灌胃7 d，最后1次灌藥（灌藥前應(yīng)禁食不禁水12 h）1 h后，腹主動(dòng)脈采血，離心分離血清，56℃水浴中滅活30 min，0.44 μm微孔濾膜過(guò)濾，-20℃冷藏備用。Y-27632（美國(guó)ALEXIS公司），大鼠肝星狀細(xì)胞株HSCT6（購(gòu)自上海肯強(qiáng)儀器有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司），引物由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)合成，Trizol regeant（美國(guó)Invitrogen公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 HSC-T6細(xì)胞接種在100 mL的培養(yǎng)瓶中（按1×105個(gè)/cm2），之后用DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）培養(yǎng)，在飽和濕度為5%，溫度為37℃的二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖情況及時(shí)更換培養(yǎng)液（周期約為每2～3 d 1次）。

2.2 細(xì)胞傳代方法 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，細(xì)心吸去培養(yǎng)液，再加入0.25%的胰蛋白酶，37℃消化3 min，加入DMEM[含10%胎牛血清（FBS）]培養(yǎng)液，輕輕吹打培養(yǎng)瓶的瓶壁，收集細(xì)胞懸液后離心5 min（1 000 g），棄去上清液后加入DMEM培養(yǎng)液含10%FBS重懸，之后以5×104個(gè)/cm2接種。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)液＋HSC-T6細(xì)胞），三甲散組（DMEM培養(yǎng)液＋HSC-T6細(xì)胞＋6 mmol/L三甲散），Y-27632陽(yáng)性對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)液＋HSC-T6細(xì)胞＋10μmol/L Y-27632）。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法和免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)α-SMA、ROCK-Ⅰ、TIMP-1mRNA和蛋白的表達(dá) RT-PCR法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，Western blot檢測(cè)時(shí)先用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，在-70℃凍存后再按試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析及SNK檢驗(yàn)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，三甲散和Y-27632甙作用24 h后，HSC-T6細(xì)胞中α-SMA、ROCK-I及TIMP-1mRMA表達(dá)均降低（P＜0.01），見(jiàn)圖1。Westernblot結(jié)果亦顯示，與對(duì)照組相比，三甲散和Y-27632甙作用24 h后，HSC-T6細(xì)胞中α-SMA、ROCK-I及TIMP-1蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2、圖3。

4 討論

圖1 三甲散和Y-27632對(duì)HSC-T6細(xì)胞α-SMA、ROCK-I、TIMP-1mRMA相對(duì)表達(dá)水平

目前研究認(rèn)為，HSC的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[8]，α-SMA蛋白可以作為HSC活化的標(biāo)志。TIMP-1為促纖維化因子，是TIMPs家族中作用最強(qiáng)的成員[9]。ROCK-Ⅰ是由屬于小G蛋白超家族的Rho小G蛋白激活的，其與α-SMA、TIMP-1同為肝纖維化過(guò)程中HSC激活不可缺少的成員。近年來(lái)研究表明，Rho/ROCK信號(hào)通路參與了肝纖維化的形成過(guò)程，它可以調(diào)節(jié)HSC的多種生物學(xué)行為，從而激活HSC，形成肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，在HSC的活化中扮演了非常重要角色[10-15]。

圖2 三甲散和Y-27632對(duì)HSC-T6細(xì)胞α-SMA、ROCK-I及TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

圖3 三甲散和Y-27632對(duì)HSC-T6細(xì)胞α-SMA、ROCK-I、TIMP-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平

三甲散方來(lái)源于明代著名的溫病學(xué)家吳又可的著作《溫疫論》。在《溫疫論·主客交》中這樣寫道：“補(bǔ)之則邪火愈熾，泄之則損脾壞胃，滋之則膠邪愈固，散之則經(jīng)絡(luò)益虛，疏之則精氣愈耗，守之則日消近死……所謂客邪膠固于血脈，主客交渾，最難得解，且愈久愈固，治法當(dāng)乘其大肉未消，真元未敗，急用三甲散，多有得生者?！盵16]此處所說(shuō)的“主”是指正氣、氣血，“客”指外來(lái)的邪氣?！爸骺徒弧钡囊馑际侵杆伢w正氣已經(jīng)虛衰，陰精耗竭非常嚴(yán)重，客邪留戀不去，正氣虛弱不能逐邪外出，客邪不得從外解，與虛竭之營(yíng)血相互膠結(jié)留滯于血脈而成的一種頑固變證。與虛、瘀、毒互結(jié)，痹阻絡(luò)脈的絡(luò)病實(shí)質(zhì)基本相同，因此，“主客交”的核心在于絡(luò)病陰傷，其中氣滯血瘀痰凝又是絡(luò)病的基本病理變化[17-18]。吳又可所說(shuō)的三甲散是治療“主客交”的主要方劑，方中的藥物主要有鱉甲、龜甲、地鱉蟲(chóng)、生牡蠣、穿山甲、白僵蠶、白芍、當(dāng)歸、甘草。其中的鱉甲、龜甲中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其是屬于血肉有情之品，它們既可以驅(qū)逐陰分之邪，又可以滋養(yǎng)身體的精血；牡蠣、白僵蠶、穿山甲、地鱉蟲(chóng)以入絡(luò)搜邪散結(jié)；方中的當(dāng)歸、白芍、甘草主要起益氣養(yǎng)血的作用，這些藥物合用共奏軟堅(jiān)散結(jié)、養(yǎng)肝通絡(luò)之功。綜觀全方具有融滋陰、行氣、活血、逐瘀的作用，對(duì)久病入絡(luò)，邪正交渾而成的痼疾非常適宜。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三甲散可以降低α-SMA mRMA與蛋白表達(dá)，ROCK-I、TIMP-1的mRMA與蛋白表達(dá)也均降低。其抗纖維化的作用機(jī)制很可能是通過(guò)抑制HSC-T6細(xì)胞增殖活化、降低α-SMA mRMA與蛋白表達(dá)，ROCK-I、TIMP-1的mRMA與蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，值得進(jìn)一步的研究探討。

[1]王寶恩.肝纖維化的診斷與嚴(yán)重度評(píng)估[J].中華肝臟病雜志，1998，6（4）：193.

[2] 孫華麗.組織金屬蛋白酶及其抑制因子與肝纖維化[J].西南軍醫(yī)，2010，12（1）：81-83.

[3]閆 穎.從“主客交”論治肝纖維化的思考[J].湖南中醫(yī)雜志，2008，24(5):84-86.

[4]鄭秀麗.從“主客交”論治慢性乙肝纖維化的理論探討[J].江蘇中醫(yī)藥，2008，40(9):20-21.

[5]蒲曉東.三甲散治療慢性肝炎肝纖維化62例臨床觀察[J].江蘇中醫(yī)藥，2008，40(11):67-68.

[6]張志銀.加味三甲散治療慢性肝炎高γ-球蛋白血癥48例[J].上海中醫(yī)藥雜志，2001，35(9):18-19.

[7]何保軍，邵淑靜，朱士君，等.復(fù)方三甲散等治療肝硬化86例[J].遼寧中醫(yī)雜志，1999，26(9):407.

[8]董培紅，何生松，蘇 剛，等.內(nèi)毒素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞活化和瘦素表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006， 15（2）：156-158.

[9]蘇 明，萬(wàn) 鈞，黃志強(qiáng)，等.肝星狀細(xì)胞的激活和Rho/ ROCK信號(hào)通路在纖維化大鼠小肝移植中的作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2005，22（12）：1452-1454.

[10]吳進(jìn)峰，沈 薇，曾貴利，等.紅景天甙對(duì)HSC-T6細(xì)胞株Rho/ROCK信號(hào)通路影響的研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34（3）：285-289.

[11]王寶珍，姜慧卿，扈彩霞，等.法舒地爾通過(guò)Rho-ROCK信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞黏附、遷移和增殖[J].中華肝臟病雜志，2006,14（11）：821-823.

[12]徐勝南.阿魏酸通過(guò)RhoA信號(hào)通路降低肝纖維化大鼠門靜脈壓力的初步研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2012:5.

[13]洪金妮，王標(biāo)輝，安海燕.Rho-ROCK信號(hào)通路參與肝纖維化過(guò)程的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2013,23（2）：123-125.

[14]沈妍華.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的激活對(duì)肝星狀細(xì)胞凋亡和Rho表達(dá)的調(diào)控[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2013:5.

[15]韋柳萍.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌HGF并下調(diào)Rho通路促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2013:5.

[16]浙江中醫(yī)學(xué)院研究所.《溫疫論》評(píng)注[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1977:308-310.

[17]黃雁霞，潘贊紅，畢麗萍，等.軟肝化纖丸對(duì)大鼠瀉下作用的影響[J].天津中醫(yī)藥，2011，28(6):513-515.

[18]蘇金玲，畢業(yè)東，姜希娟，等.ILK、TNFα在酒精性肝纖維化大鼠肝組織中的表達(dá)[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012, 31(1):20-23.

Effect of Sanjia powder on expression of protein of α-SMA,TIMP-1,ROCK-Ⅰin hepatic stellate cell

ZHENG Xu-rui,HUI Yi,YAN Shu-guang,SONG Xiao,CAO Ning,WANG Li-feng,CHAO Xu
（Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712046,China）

[Objective]The expression of α-SMA,TIMP-1 and ROCKⅠin the hepatic（HSC-T6）stellate cell were measured to study the proliferating effect of Sanjia powder.[Methods]HSC-T6 cells interfered by Sanjia powder-containing serum,RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of α-SMA,TIMP-1,ROCKⅠin the hepatic stellate cell.[Results]Real-time PCR and Western blot assay showed that Sanjia powder and Y-27632 could reduce the expression of ROCK-Ⅰprotein,TIMP-1 and a-SMA mRNA in HSC-T6 cells.[Conclusion] Sanjia powder can decrease the expression of ROCK-Ⅰprotein,TIMP-1 and a-SMA in HSC-T6 cells.

Sanjia powder；α-SMA；TIMP-1；ROCK-Ⅰ；protein expression

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0359-03

2014-08-16）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.11

陜西省科技廳資助項(xiàng)目（2013JQ4007）。

鄭旭銳（1976-），女，博士，主要從事中醫(yī)藥防治感染性疾病工作。