高效液相色譜法測定菟絲子中綠原酸、對-香豆酸和金絲桃苷的含量*

田雨霏，劉 姣，李 晉，馬 琳，何 俊，劉二偉，常艷旭

（天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193）

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高效液相色譜法測定菟絲子中綠原酸、對-香豆酸和金絲桃苷的含量*

田雨霏，劉 姣，李 晉，馬 琳，何 俊，劉二偉，常艷旭

（天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193）

[目的]建立同時測定菟絲子中綠原酸、對-香豆素和金絲桃苷的含量的高效液相色譜法，為菟絲子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供依據(jù)。[方法]色譜柱為依利特ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.05%甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為360 nm。[結(jié)果]在此色譜條件下，3種成分可完全分離。綠原酸、對-香豆素和金絲桃苷的線性分別為2.00～100 μg/mL（r=0.999 3），6.25～100 μg/mL（r=0.999 1），0.50～50 μg/mL（r=0.999 1）。平均回收率分別為100%（RSD=3.2%）、102%（RSD=1.7%）和102%（RSD=3.1%）。[結(jié)論]該方法簡便可行，重復(fù)性好，可用于菟絲子的質(zhì)量評價。

菟絲子；高效液相色譜法；綠原酸；對-香豆素；金絲桃苷

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子（Cuscuta australis R.Br.）或菟絲子（Cuscuta chinensis Lam.）的干燥成熟種子[1]。它除作為臨床常用中藥外[2]，還是制藥和保健品生產(chǎn)的重要原料藥材之一。近年來國內(nèi)外學(xué)者對菟絲子藥理活性進(jìn)行系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，不僅具有補陽益陰、固精縮尿、明目止瀉的傳統(tǒng)功效，同時，具有生殖保護(hù)、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、改善心腦血管、保肝、降血糖、骨損傷修復(fù)，治療白癜風(fēng)等作用[3-5]。

菟絲子的化學(xué)成分種類較多，有黃酮類、多糖、香豆精、膽甾醇、有機酸等，其中綠原酸具有顯著的清熱抗菌、抗病毒的作用[6]，對-香豆素具有抗菌抗癌的功效[7]，金絲桃苷具有鎮(zhèn)痛，保護(hù)心肌和肝臟等作用[8]。目前，菟絲子中黃酮類或其他少數(shù)成分的含量測定均有報道[9-15]，但是綠原酸、對-香豆素和金絲桃苷同時測定方法未見報道。本研究建立了同時測定菟絲子中綠原酸、對-香豆素和金絲桃苷3種成分的含量的高效液相色譜法（HPLC），為有效地控制菟絲子的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 樣品來源 本實驗收集了9個不同地區(qū)（天津、內(nèi)蒙古、陜西、新疆、河南、山西、重慶、云南和上海）的藥房的正品菟絲子樣品，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為菟絲子（Cuscuta chinensis Lam.）。

1.2 儀器和試劑 美國Agilent 1100 Series液相色譜儀（Agilent二元泵，Agilent紫外檢測器，G1312A自動進(jìn)樣器，Agilent1100色譜工作站）；BP121S萬分之一天平（德國賽托利斯公司）；XW-80A微型渦旋混合儀（上海滬西儀器廠有限公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-5-B型臺式低速離心機（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；電熱真空干燥箱（天津市天宇實驗儀器有限公司）；MODEL2-16高速離心機（TOMOS）；202-O型臺式干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。甲醇為色譜純(康科德)，水為超純水（Milli-Q），甲酸（Tedia）。綠原酸購自中國藥品生物制品檢定所，金絲桃苷購自天津市藥品生物制品檢定所，對-香豆酸購自成都曼斯特生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：依利特ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A：甲醇；B：0.05%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～15 min，5%～30%A，15～45 min，30%～60%A，平衡5 MIN；流速：1 mL/min；檢測波長：360 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25℃。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥的菟絲子藥材粉末（過80目篩）0.10 g，精密稱定，置磨口三角瓶中，加10 mL 50%甲醇，密塞，稱質(zhì)量，超聲處理30 min，冷卻，靜置，稱質(zhì)量，補足減失的質(zhì)量，作為供試品溶液。

1.3.3 對照品溶液的制備 分別取綠原酸、對-香豆酸和金絲桃苷對照品適量于容量瓶，精密稱定，用50%甲醇配成不同濃度的對照品母液，渦旋，并于4℃保存。

2 結(jié)果及討論

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化 本研究考察了不同的提取方法（超聲、加熱回流），結(jié)果表明，50%甲醇超聲提取的3種成分含量較高，因此，選擇50%甲醇超聲30 min為樣品提取條件。

2.2 色譜條件的優(yōu)化 在流動相系統(tǒng)的選擇中，分別以甲醇-水、甲醇-0.05%甲酸等不同體積分?jǐn)?shù)、不同比例的流動相系統(tǒng)進(jìn)行等度和梯度洗脫實驗。結(jié)果表明，用甲醇-0.05%甲酸進(jìn)行梯度洗脫為佳，加入一定比例的甲酸，能夠改善各峰間的分離狀況和峰形；使用梯度洗脫，可縮短樣品分析時間，保證基線平穩(wěn)，有利于被檢測物的分析。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察 分別準(zhǔn)確稱取對照品儲備液適量，用甲醇稀釋，制得綠原酸，對-香豆酸和金絲桃苷的混合對照品溶液，并逐級稀釋成一系列不同濃度的對照品溶液，按上述色譜條件測定，以對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計算。結(jié)果表明，綠原酸，對－香豆酸和金絲桃苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y＝2 000.9X＋11 850（r＝0.999 3）、Y＝1 929.9X＋1 418.3（r＝0.999 1）、Y＝5 016.1X＋29 812（r＝0.999 1），線性范圍分別為2.00～100、0.50～50和6.25～100 μg/mL。

2.3.2 精密度實驗 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其濃度，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，綠原酸、對-香豆酸和金絲桃苷的RSD分別為2.4%、3.0%和1.0%，表明進(jìn)樣和儀器的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測定其濃度，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，綠原酸，對-香豆酸和金絲桃苷峰面積的RSD分別為2.4%、2.9%和2.3%，均小于3%，表明供試品溶液室溫放置12 h比較穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性實驗 取同一批樣品，平行制備6份供試品溶液，測定其濃度，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，綠原酸，金絲桃苷和對-香豆酸的RSD分別為2.2%、3.0%和3.0%，表明方法重復(fù)性好。

2.3.5 加樣回收率實驗 取已知含量的藥材粉末6份，分別加入適量綠原酸、金絲桃苷和對-香豆酸對照品，供試品溶液制備方法制備，并依法測定，計算回收率。結(jié)果表明，綠原酸，對-香豆酸和金絲桃苷的平均回收率分別為100%、102%、102%，其RSD分別為3.2%、1.7%和3.1%，結(jié)果表明綠原酸，對-香豆酸和金絲桃苷的提取方法可行。

3 樣品測定

分別吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，對照品和菟絲子樣品的色譜圖見圖1，可知在該色譜條件下，被測化合物分離度良好，無雜質(zhì)峰干擾，可用于不同產(chǎn)地樣品分析。不同購買地的菟絲子樣品中綠原酸、金絲桃苷和對-香豆酸含量測定結(jié)果見表1，從表中可知不同地區(qū)藥店菟子絲質(zhì)量存在較大差異，綠原酸含量在0.06%～0.43%之間，對-香豆酸在0.02%～0.56%之間，金絲桃苷在0.10%～1.07%之間。

圖1 菟絲子樣品HPLC色譜圖及對照品的HPLC色譜圖

4 結(jié)論

本文建立了一種簡單、穩(wěn)定、重復(fù)性好、可靠的HPLC同時測定菟絲子中3種化學(xué)成分綠原酸、金絲桃苷和對-香豆酸含量的方法，能夠用于菟絲子質(zhì)量評價，為其質(zhì)量控制提供了新的研究方法。

表1 綠原酸、金絲桃苷和對-香豆酸含量%

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Determination of chlorogenic acid，p-coumarin and hyperin of Cuscuta chinensis Lam.by high performance liguid chromatography

TIAN Yu-fei,LIU Jiao,LI Jin,MA Lin,HE Jun,LIU Er-wei,CHANG Yan-xu
（Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

[Objective]To establish a sensitive method for simultaneous determination of chlorogenic acid,pcoumarin and hyperin in order to provide some evidences for the quality control of Cuscuta chinensis Lam..[Methods]Methanol and 0.05%formic acid were used as mobile phase.The sample was separated on an ODS C1825 column(4.6 mm×250 mm，5 μm)by gradient elution.The flow rate was 1.0 mL/min.The wavelength was set at 360 nm.[Results]Chlorogenic acid,p-coumarin and hyperin were well separated by HPLC.Linearity ranges were 2.00～100 μg/mL(r=0.999 3),6.25～100 μg/mL(r=0.999 1)and 0.50～5 0 μg/mL(r=0.999 1)for chlorogenic acid,pcoumarin and hyperin,respectively.[Conclusion]The simple and feasible HPLC method was established to evaluate the quality of Cuscuta chinensis Lam..

Cuscuta chinensis Lam.;HPLC;Chlorogenic acid;P-coumarin;Hyperin

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0372-03

2014-08-17）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.15

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（201012101 20007）；國家自然科學(xué)基金（81001632）；中國博士后基金（201 00480657）；教育部科學(xué)技術(shù)重點項目（210013）和天津市科技支撐計劃重大項目（10ZCZDSY12400）。

田雨霏（1990-），女，2009級本科生，從事中藥資源研究。

常艷旭，E-mail:tcmcyx@126.com。