雞滑液支原體乳酸脫氫酶的克隆表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物活性研究

任 峰，譚 磊，包世俊，張凡慶，陸 鳳，仇旭升，宋翠萍，孫英杰，陳書明，丁 鏟

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

雞滑液支原體乳酸脫氫酶的克隆表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物活性研究

任 峰1,2，譚 磊2，包世俊2，張凡慶2，陸 鳳2，仇旭升2，宋翠萍2，孫英杰2，陳書明1，丁 鏟2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

根據(jù)GenBank中雞滑液支原體（Mycoplasma synoviae, MS）MS53株的乳酸脫氫酶序列設(shè)計一對特異性上下游引物，通過PCR擴(kuò)增獲得MSWVU1853菌株的乳酸脫氫酶基因并將其克隆至pGEM-T Easy載體，測序正確并成功完成點突變后連接表達(dá)菌pET-28a（+），將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ldh轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21（DE3）。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)蛋白rMSLDH并測定其酶促活性。結(jié)果顯示，重組表達(dá)的rMSLDH具有較強(qiáng)酶活性；最適反應(yīng)溫度40℃，最適pH7.5；Al2+和Ba2+可增加酶活性；Cr3+作為該酶的輔因子，在一定濃度內(nèi)能有效的促進(jìn)酶促反應(yīng)進(jìn)行；Cu2+作用下酶幾乎失活，F(xiàn)e3+、Mn2+、Ni2+、Zn2+對酶產(chǎn)生不同程度的抑制作用；其米氏常數(shù)（Km）為0.365 mmol/L ，最大反應(yīng)速率（Vm）為0.98 μmol(L*min)。本研究結(jié)果為更好地研究雞滑液支原體乳酸脫氫酶的生物學(xué)功能提供了參考。

滑液支原體；乳酸脫氫酶；原核表達(dá)；酶活性

滑液支原體（Mycoplasma synoviae，MS）又叫雞滑液囊支原體，該支原體可以侵害幼齡雞和火雞的關(guān)節(jié)滑液、腱鞘膜和氣囊[1]，可造成關(guān)節(jié)、腱鞘和腳掌腫脹，氣囊有干酷物[2-4]。調(diào)查表明，在我國各地雞滑液囊支原體的感染率達(dá)到20.7%[2]。雖然MS不能直接造成禽類死亡，但在雞群中可長期蔓延，導(dǎo)致飼料利用率低、生長發(fā)育遲緩、淘汰率增高、產(chǎn)蛋量下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-7]。

支原體是一種具有很小基因組和蛋白質(zhì)組的最小的自我復(fù)制的微生物。支原體與宿主的相互作用主要通過膜蛋白中的可溶性脂蛋白及血凝素蛋白（variable lipoprotein haemagglutinin，VlhA）[8]。由于簡化的基因組和有限的生物合成能力，需要從宿主細(xì)胞中獲得核酸、氨基酸、脂肪酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，引起宿主細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷[9]。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是一種在糖代謝中催化乳酸和丙酮酸之間可逆反應(yīng)的一組同工酶，廣泛存在于微生物、動植物細(xì)胞內(nèi)，參與糖代謝。在哺乳動物中有兩種不同的LDH亞基，一種是M型（或稱為A型），一種是H型（或稱B型），可構(gòu)成5種同工酶，而在原核生物中，LDH由兩種亞基構(gòu)成iLDH和FDP激活的兩種同工酶[10]。

LDH在厭氧條件下能夠催化丙酮酸接受NADH上的氫，生成乳酸；當(dāng)動物體內(nèi)缺少葡萄糖時，LDH還可以催化乳酸生成丙酮酸并經(jīng)糖異生途徑生成葡萄糖。其催化丙酮酸的化學(xué)式：

自1959年由Markert和Moller[14]發(fā)現(xiàn)LDH后，已有大量關(guān)于LDH分離純化的文獻(xiàn)報道，然而關(guān)于雞滑液支原體中的LDH相關(guān)功能的研究尚未報道。因此，本研究通過對MSLDH基因的擴(kuò)增、原核表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物酶促活性的研究，為進(jìn)一步研究MSLDH的生物學(xué)功能以及對MS引起疾病的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及其來源普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、E.coliDH5α、BL21（DE3）均購自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ大連寶生物工程有限公司；表達(dá)菌pET-28a（+）為本實驗室提供；pGEM-T Easy 載體和T4 DNA連接酶購自Promega公司；蛋白質(zhì)純化試劑盒和Ni-NTA His-Bind Resin：Novagen公司；胰蛋白胨、酵母提取物：OXOID公司；IPTG、青霉素、卡那霉素、氨芐霉素、丙酮酸(pyruvic acid PA)、NADH、兔肌肉乳酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)均購自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物有限公司；NAD購自Roche公司；Horse serum購自Gibco公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 菌種、培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法菌種MSWVU1853購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。按照培養(yǎng)基基礎(chǔ)說明書配制液體培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻后加入100 mL/L的滅活馬血清和終濃度0.1 g/L的NAD。取適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基接種MSWVU1853后置50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。

1.3 LDH基因提取克隆表達(dá)及其產(chǎn)物的純化

1.3.1 LDH基因的提取 取生長至對數(shù)期的MSWVU1853菌液100 mL，10 000×g低溫離心5 min后棄上清，用PBS洗3遍后，200 μL PBS懸起沉淀，沸水浴10 min，冰浴5～10 min后，12 000×g常溫離心10 min，取上清即為MS基因組DNA，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 目的基因的PCR擴(kuò)增 試驗所用引物均是參考GenBank中MS53乳酸脫氫酶序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

用上述提取的DNA為模板，并以LDHF和LDHR為引物對MS的LDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物回收后與pGEM-T Easy 載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α，挑陽性菌轉(zhuǎn)液體培養(yǎng)12 h后提質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果，通過Overlapping PCR將影響大腸桿菌表達(dá)的TGA密碼子突變?yōu)門GG，將回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy 載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α，挑陽性菌轉(zhuǎn)液體培養(yǎng)12 h后提質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測序。

1.3.3 乳酸脫氫酶原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化 將測序正確的LDH質(zhì)粒用BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切并與用同樣酶雙酶切過的pET-28a（+）空載體質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ldh并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21（DE3），挑取5～6個單菌落分別接種到3 mL含卡那霉素100 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床中220 r/min震蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液按10 mL/L轉(zhuǎn)接種到2YT培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃搖床中220 r/min震蕩培養(yǎng)，待OD600達(dá)到0.6～0.8時，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，18℃、180 r/min誘導(dǎo)12 h。菌體離心（10 000 ×g、10 min）后用PBS（pH7.5）洗滌3次，重懸后超聲裂解離心分離上清和沉淀，超聲條件為功率300 w，工作4 s，間歇15 s，共超聲30 min。BCA蛋白定量后SDS-PAGE檢測蛋白的可溶性。確定上清表達(dá)后用200 mL 2YT進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，用His*Bind蛋白純化試劑盒純化蛋白。用純化后的His-LDH免疫兔子，三免后采血，5000×g、10 min獲得上清作為多抗。對His-LDH進(jìn)行Western blot分析，上述血清作為一抗，二抗用HRP標(biāo)記羊抗兔血清。

表1 本研究所使用的PCR引物及其序列Table 1 Sequences of primers used in this study

1.4 His-LDH活性及其影響因素的測定

1.4.1 His-LDH比活性的測定 該實驗原理是LDH催化丙酮酸還原產(chǎn)生乳酸，設(shè)定反應(yīng)體系為220 μL,含有20 mmol/L的NADH，粗酶液10 μL含蛋白1.25 μg，向體系中加入終濃度為50 mmol/L的丙酮酸200 μL開始反應(yīng)[12]。該反應(yīng)在分光光度計340 nm波長下測量[13]。每隔1 min測1次，至30 min結(jié)束，記錄各

時間點的光吸收值。同時以兔肌肉的LDH做陽性對照。配制不同濃度的粗酶液（0.125、0.25、0.5、1.0 μg/μL）分別測定酶促活性。

1.4.2 不同溫度對His-LDH活性的影響 設(shè)定反應(yīng)pH7.5，分別測定10℃、20℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、60℃時His-LDH的酶促活性。0～20 min每隔1 min測定1次該反應(yīng)的OD340值，每個溫度點重復(fù)測定3次。

1.4.3 不同pH值對His-LDH活性的影響 設(shè)定反應(yīng)溫度37℃，分別測定pH為2.0、6.4、7.5、8.0、12.0的緩沖液中His-LDH的酶促反應(yīng)值。每個pH點重復(fù)測定3次，了解不同pH值對His-LDH活性的影響。

1.4.4 不同金屬離子對His-LDH活性的影響 用終濃度1 mmol/L的NiSO4、BaCl2、CuSO4、AlCl3、ZnCl2、MnCl2、CaCl2、MgSO4的緩沖液配制反應(yīng)物，調(diào)pH7.5，37℃下測定His-LDH活性。同樣測定該反應(yīng)0～20 min每隔1 min的OD340值，每種金屬離子重復(fù)測定3次。

1.4.5 不同濃度底物對酶活的影響 在上述最適pH反應(yīng)緩沖液中加入不同濃度的丙酮酸（10、25、50、100 mmol/L）。0～20 min每隔1 min測定1次OD340值，每個濃度重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果

2.1 乳酸脫氫酶基因克隆經(jīng)過Overlap PCR擴(kuò)增過的LDH基因大小與預(yù)算的大小相同（圖1）。膠回收產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后與pGEM-T Easy 載體連接，挑陽性菌轉(zhuǎn)液體LB氨芐抗性培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，質(zhì)粒提取后送測序，結(jié)果正確。將正確測序的LDH基因與pET-28a（+）連接，構(gòu)建pET-28a-ldh雙酶切鑒定結(jié)果。

圖1 乳酸脫氫酶基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Overlap PCR amplif cation of LDH gene

2.2 乳酸脫氫酶基因表達(dá)及產(chǎn)物純化將pET-28aldh轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21（DE3），2YT培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8時，加入終濃度1.0 mmoL/L的IPTG過夜表達(dá)，結(jié)果鑒定見圖2，大小約為34 kDa。將蛋白純化后免疫兔子獲得多抗對該蛋白進(jìn)行Western blot分析結(jié)果見圖3。

2.3 乳酸脫氫酶比活力兔肌肉LDH作為標(biāo)準(zhǔn)品，LDH純化蛋白作為粗酶液，兩種樣品比對酶活結(jié)果，粗酶液活性略高（圖4A）。丙酮酸濃度不變時，LDH活性隨粗酶液量的增加而升高（圖4B）。當(dāng)丙酮酸濃度不同時LDH的酶活也有差異（圖4C）。

2.4 溫度和pH對酶活影響當(dāng)溫度在0℃～50℃區(qū)間都有酶活，50℃時酶活明顯降低，超過50℃酶失活（圖5A）。pH對酶活也有很明顯的影響，pH7.0～pH8.0酶活比較強(qiáng)，低于2.0或超過12.0時酶活明顯降低甚至失活（圖5B）。利用圖4C數(shù)據(jù)通過雙倒數(shù)法作圖（圖5C）求得LDH的米氏常數(shù)（km）為0.365 mmol/L，最大反應(yīng)速率（Vm）為0.98μmol(L*min)。

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

圖3 重組蛋白Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of the recombinant protein

圖4 重組蛋白酶活性分析Fig. 4 Analysis of His-LPH activity

圖5 溫度和pH對酶活的影響Fig. 5 Effect of temperature and pH on His-LDH activity in vitro

2.5 金屬離子對酶活的影響不同金屬離子對酶活性影響很明顯，Al3+和Ba2+對LDH活性明顯加強(qiáng)，Mn2+對酶活性有較小抑制，Ni2+、Zn2+對酶活性有明顯的抑制，Cu2+作用下酶幾乎失活（表2）。

3 討論

乳酸脫氫酶是微生物體內(nèi)進(jìn)行糖酵解途徑中重要的酶類[2]，在無氧條件下加入電子載體它可以催化丙酮酸生成乳酸，有的生物體產(chǎn)生L-LDH，有的生物體產(chǎn)生D-LDH，使生物體糖代謝能夠順利進(jìn)行，從而保證生物體正常的生命活動[14]。支原體屬于柔摸體綱，在極端的生物還原進(jìn)化過程中失去很多基因，形成了具有最小基因組進(jìn)行自我復(fù)制的特征[15]，其能量來源主要靠糖酵解途徑。乳酸脫氫酶又是糖酵解和糖異生中重要的酶之一，參與滑液支原體產(chǎn)能，從而影響其生命活動。因此，研究MS乳酸脫氫酶的酶促動力學(xué)將為進(jìn)一步了解和研究滑液支原體的代謝奠定基礎(chǔ)。

表2 金屬離子對酶活的影響Table2 Effect of metaliron on His-LDH activity in vitro

本研究成功獲得了雞滑液支原體中乳酸脫氫酶蛋白，經(jīng)過純化達(dá)到酶活較高的粗酶液，有利于進(jìn)行后續(xù)的酶活試驗。

MS中乳酸脫氫酶基因表達(dá)的產(chǎn)物與兔肌肉乳酸脫氫酶酶活性相比較，前者有較高活性。根據(jù)雙倒數(shù)法得到的乳酸脫氫酶米氏常數(shù)（Km=0.365 mmol/L）和最大反應(yīng)速率（Vm=0.98μmol(L*min)），更充分證明該酶有較高的酶活性，正因為如此在MS糖代謝過程中該酶才能滿足自身能量需求，有利于支原體生長。

經(jīng)過試驗證明pH在6.4～7.5，乳酸脫氫酶都有較高的酶活性，當(dāng)pH小于2.0或者大于12.0時酶活性很低，在pH7.5時最高，以上數(shù)據(jù)證明MS中乳酸脫氫酶可在弱堿性條件下發(fā)揮正常的催化功能維持MS正常生理。經(jīng)過試驗證明當(dāng)溫度在0℃～50℃之間乳酸脫氫酶都有活性，當(dāng)高于50℃時酶活喪失，乳酸脫氫酶可分L-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶，其中D-乳酸脫氫酶熱穩(wěn)定性較弱，與Garvie結(jié)論一致[16]，D-乳酸脫氫酶與本實驗中乳酸脫氫酶很相符。

[1] Buim M R, Buzinhani M, Yamaguti M,et al. Mycoplasma synoviae cell invasion∶ elucidation of the Mycoplasma pathogenesis in chicken[J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2011, 34(1)∶ 41-47.

[2] 吳移謀, 葉元康. 支原體學(xué)[M]. 2版. 北京∶ 人民衛(wèi)生出版社, 2008∶ 49-56.

[3] Chin R P, Meteyer C U, Yamamoto R,et al. Isolation of Mycoplasma synoviae from the brains of commercial meat turkeys with meningeal vasculitis[J]. Avian Dis, 1991, 35(3)∶ 631-637.

[4] Kleven S H, Fletcher O J, Davis R B. Influence of strain of Mycoplasma synoviae and route of infection on development of synovitis or airsacculitis in broilers[J]. Avian Dis, 1975, 19(1)∶ 126-135.

[5] Stipkovits L, Kempf I. Mycoplasmoses in poultry[J]. Rev Sci Tech, 1996, 15(4)∶ 1495-1525.

[6] Kleven S H, Rowland G N, Kumar M C. Poor serologic response to upper respiratory infection with Mycoplasma synoviae in turkeys[J]. Avian Dis, 2001, 45(3)∶ 719-723.

[7] Branton S L, Lott B D, May J D,et al. The effects of F strain Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, and the dual infection in commercial layer hens over a 44-week laying cycle when challenged before beginning of lay. II. Egg size distribution[J]. Avian Dis, 1999, 43(2)∶326-330.

[8] Noormohammadi A H. Role of phenotypic diversity in pathogenesis of avian mycoplasmosis[J]. Avian Pathol, 2007, 36(6)∶ 439-444.

[9] 曹中贊, 欒新紅, 劉勝旺, 等. 禽滑液囊支原體研究進(jìn)展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 34(11)∶ 113-117.

[10] Ismailov A D, Danilov V S, Egorov N S. Lactate dehydrogenase activity and its isoenzyme in a system coupled with bacterial luciferase[J]. Vopr Med Khim, 1984, 30(6)∶ 45-50.

[11] 周靜. 乳酸脫氫酶的分離純化及其性質(zhì)的研究[J]. 赤峰學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2009, 25 (9)∶ 111-113.

[12] Contag P R, Williams M G, Rogers P. Cloning of a lactate dehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum B643 and expression in Escherichia coli[J]. Appl Environ Microbiol, 1990, 56(12) ∶ 3760-3765.

[13] Ozkan M, Yilmaz E I, Lynd LR,et al. Cloning and expression of the Clostridium thermocellum L-lactate dehydrogenase gene in Escherichia coli and enzyme characterization[J].Can J Microbiol, 2004, 50(10)∶ 845-851.

[14] Savijoki K, Palva A. Molecular genetic characterization of the L-lactate dehydrogenase gene (ldhL) of Lactobacillus helveticus and biochemical characterization of the enzyme[J]. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(7)∶ 2850-2856.

[15] Dusanic D, Bencina D, Oven I,et al. Mycoplasma synoviae induces upregulation of apoptotic genes, secretion of nitric oxide and appearance of an apoptotic phenotype in infected chicken chondrocytes[J]. Vet Res, 2012, 43(1)∶ 7-9.

[16] Garvie E I. Bacterial lactate dehydrogenases[J]. Microbiol Rev, 1980, 44(1)∶ 106-139.

CLONING AND EXPRESSION OF LACTATE DEHYDROGENASE GENE OF MYCOPLASMA SYNOVIAE AND DETERMINATION OF ENZYMATIC ACTIVITY OF THE RECOMBINANT PROTEIN

REN Feng1,2, TAN Lei2, BAO Shi-jun2, ZHANG Fan-qing2, LU Feng2, QIU Xu-sheng2, SONG Cui-ping2, SUN Ying-jie2, CHEN Shu-ming1, DING Chan2
(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

In the present study, a pair of specific primers of lactate dehydrogenase (LDH) were designed according to the sequence ofMycoplasma synoviaeMS53 strain in GenBank. Then, the LDH gene ofMSWVU1853 strain was amplif ed in PCR and cloned into pGEM-T Easy. After sequencing and spot mutation, the LDH gene was cloned into prokaryotic expression plasmid pET-28a (+). The recombinant plasmid pET-28a-LDH was transformed into BL21 (DE3). The expression of rLDH was induced with IPTG and its enzymatic activity was detected. The results showed that rLDH possessed high activity. The optimal reaction conditions were determined to be 40℃ and pH 7.5. Its enzymatic activity was stimulated with addition of Ba2+, Al3+and Cr3+but inhabited with Fe3+, Mn2+, Ni2+and Zn2+. The michaelis constant (Km) of LDH was 0.365 mmol/L and the maximum reaction velocity (Vm) was 0.98 μmol(L*min).

Mycoplasma synoviae; lactate dehydrogenase; prokaryotic expression; enzymatic activity

S852.62

A

1674-6422（2014）02-0052-06

2013-12-20

公益性行業(yè)科研專項（201303044）

任峰，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

陳書明，E-mail：chensm2001@yahoo.com.cn；丁鏟，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn