綿羊肺炎支原體黏附因子的定點突變及原核表達

程 晨，黃海碧,王曉暉，王仁超，謝紅霞，郝永清

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.黑龍江省農(nóng)墾建三江管理局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，佳木斯 156300）

綿羊肺炎支原體黏附因子的定點突變及原核表達

程 晨1，黃海碧1,王曉暉1，王仁超1，謝紅霞2，郝永清1

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.黑龍江省農(nóng)墾建三江管理局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，佳木斯 156300）

本研究采用點突變PCR方法成功克隆并表達了綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoiae, M.O）內(nèi)蒙古分離株（SZWQ株）的黏附因子基因（SZWQ-860）。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，與預(yù)期目的蛋白的大小一致，將重組蛋白純化后經(jīng)Western blot檢測，結(jié)果表明重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。

綿羊肺炎支原體；黏附因子; 定點突變；重組蛋白

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoiae, M.O）于1963年在英格蘭由Mackya等[1]首次從綿羊體內(nèi)分離出，1972年被 Carmihceal等[2]證明了這種支原體的致病性，并建議命名為“綿羊肺炎支原體”。M.O能引起綿羊以咳嗽、喘氣、漸進性消瘦及慢性增生性間質(zhì)性肺炎為特征的慢性呼吸道傳染病[3]，不僅如此，羊感染綿羊肺炎支原體后，對其他病原（如多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌及流感病毒）的易感性明顯增加[4]。本病在我國內(nèi)蒙古自治區(qū)、云南省、四川省、寧夏回族自治區(qū)、甘肅省等地均有關(guān)于本病的報道，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。雖然國內(nèi)外均有對綿羊支原體肺炎減毒活疫苗和滅活疫苗研究和應(yīng)用的報道，但免疫防護的效果都不是很理想。支原體的生長對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的要求都很苛刻，培養(yǎng)難度大，故而菌產(chǎn)量低，極大地阻礙了支原體傳統(tǒng)疫苗的研制。因此，生物技術(shù)疫苗的研究將是未來支原體疫苗的發(fā)展方向。

本研究克隆表達了綿羊肺黏附因子的基因，并對表達出的融合蛋白的免疫學(xué)活性進行檢測，為綿羊肺炎支原體的生物技術(shù)疫苗的研制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種與質(zhì)粒M.O內(nèi)蒙古分離株（SZWQ株）、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET-32a為本實驗室保存；一抗由本實驗室制備保存。

1.2 工具酶與試劑PCR高保真酶（PrimeStar）、限制性內(nèi)切酶（NcoⅠ、XhoⅠ）、T4 DNA ligase購于TaKaRa公司；支原體基因組提取試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒、快速質(zhì)粒小量提取試劑盒購于Axgen公司；0.45 μm濾器為BIO-RAD產(chǎn)品；Ni+層析柱、醋酸纖維素膜、辣根過氧化物酶 (HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG購于上海生工生物有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或試劑純。

1.3 引物的設(shè)計與合成根據(jù)測序后SZWQ株的基因序列，采用Premier Primer 5.0軟件設(shè)計SZWQ株的黏附因子基因（SZWQ-860）的特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。F1：5'-CCG CCA TGG CTA TGA AAA AGT TCT TCA ATT TTA AGC-3' ；R1 5'-GCT CAT CAT TTA TCC AGG ATT TTA TTT CTG ATT C-3' ；F2 ：5'-CCT GGA TAA ATG ATG AGC TAA TTC CTG AAA TAA AA-3'； R2：5'-CCG CTC GAG TTA AGA ACA ATA TCT ATA TTT ACG-3'。特異性上游引物F1引入NcoⅠ酶切位點，特異性下游引物R2引入XhoⅠ酶切位點（下劃線標(biāo)注的為酶切位點）。

1.4 黏附因子基因的擴增、定點突變以SZWQ株基因組為模板?；蚪M的提取按照支原體基因組提取試劑盒說明書進行。按Simionatto等[5]介紹的定點PCR突變方法，將ORF內(nèi)的密碼子TGA突變成TGG。

1.4.1 分段擴增出黏附因子基因S1、S2 S1片段的擴增：上游引物F1 0.5 μL、下游引物R1 0.5 μL、模板1 μL、5×Buffer 5 μL、dNTPs 2 μL、DNA Ployesae 0.25 μL加水補體積至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性5 min；95℃變性 30 s，52℃退火45 s，72℃延伸 1.5 min，32個循環(huán)；72℃再延伸10 min，16℃結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物分別使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并回收目的片段；S2片段的擴增：上游引物F2 0.5 μL、下游引物R2 0.5 μL、模板1 μL、5×Buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、DNA Ployesae 0.25 μL加ddH2O補體積至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，32個循環(huán)；72℃再延伸10 min，16℃結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物分別使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并回收目的片段。

1.4.2 突變后黏附因子基因的擴增 上游引物F1 1 μL、下游引物R2 1 μL、模板1為S1片段1 μL、模板2為 S2片段1 μL、5×Buffer 10 μL、dNTPs 4 μL、DNA Ployesae 0.5 μL、加水補體積至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，48.8℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，32個循環(huán)；72℃再延伸10 min ，16℃結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，回收目的片段。

1.5 突變后黏附因子重組蛋白的表達、可溶性鑒定和純化將純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切、連接克隆至pET-32a中，重組質(zhì)粒pET32a-SZWQ-860進行雙酶切和序列測定，篩選陽性重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)宿主菌中，并接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)至OD值達到0.6時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG 30℃誘導(dǎo)4 h。離心收集100 mL菌體，懸于5 mL包涵體裂解液中，用反復(fù)凍融法及超聲碎菌法破碎細胞，離心后取上清和沉淀分別與5×蛋白Loading buffer等量混勻，煮沸10 min后用SDS-PAGE進行可溶性鑒定。

將確定為可溶的目的蛋白用0.45 μm孔徑的濾器過濾后，采用上海生工生物有限公司生產(chǎn)的Ni+層析柱對目的蛋白進行純化，純化后的蛋白進行SDSPAGE分析。

1.6 Western blot分析將純化后的目的蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后，用BIO-RAD系統(tǒng)將目的蛋白電轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，用 SZWQ株的高免兔血清（血清效價為1∶12 800）在4℃條件下進行一抗過夜孵育；洗膜，再用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG在37℃溫箱中進行二抗孵育2 h，辣根過氧化酶顯色液（DAB）顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離株黏附因子基因的定點突變及克隆以M.O內(nèi)蒙古分離株（SZWQ株）的基因組為模板，S1片段擴增以F1和R1為引物，S2片段擴增以F2和R2為引物，進行PCR第一輪擴增，擴增出258 bp的S1片段和901 bp的S2片段；膠回收第一輪擴增產(chǎn)物，并以S1和S2片段為模板，F(xiàn)1和R2為引物，進行PCR第二輪擴增，擴增出突變后分離株黏附因子基因片段（SZWQ-860）。兩輪擴增的結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，第一輪擴增結(jié)果分別在258、901 bp可見特異性條帶，第二輪擴增結(jié)果在1159 bp可見特異性條帶（圖1），大小與理論值一致。

圖1 SZWQ黏附因子基因 PCR產(chǎn)物Fig. 1 PCR product of SZWQ-860

經(jīng)基因測序分析，SZWQ株的黏附因子基因中有一個密碼子TGA，由于M.O和許多支原體都被證實用TGA編碼色氨酸，而在一般細菌和原核（真核）表達系統(tǒng)中則是以TGG編碼色氨酸，TGA作為終止密碼子[5,6]，因此黏附因子基因在原核表達系統(tǒng)中不能正確表達，要獲得正確的表達就需要通過體外突變才能實現(xiàn)。本研究將SZWQ株黏附因子基因中的TGA采用定點突變的方法將其突變?yōu)門GG，突變后測序結(jié)果表明，黏附因子的基因全長序列經(jīng)定點同義突變后，889bp～891bp位點的TGA成功突變?yōu)門GG。

2.2 重組蛋白的表達、可溶性鑒定和純化將重組質(zhì)粒pET32a-SZWQ-860轉(zhuǎn)化到 BL21（DE3）宿主菌中，對其進行誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間和IPTG濃度的摸索，最終確定在IPTG誘導(dǎo)濃度為0.4 mmol/L 、誘導(dǎo)時間為4 h、誘導(dǎo)溫度為30℃的時候蛋白表達量最高，在約60 kDa處可見一條單一的條帶（圖2）。

將SZWQ株黏附因子的測序結(jié)果翻譯為氨基酸序列，并與NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，顯示其蛋白功能與豬肺炎支原體P102蛋白的功能極為相似。經(jīng)預(yù)測，P102蛋白是豬肺炎支原體潛在的黏附因子，相關(guān)研究表明該蛋白具有一定的免疫活性[7]。微生物感染的第一步是黏附，故而對黏附因子的研究是研制綿羊支原體肺炎有效疫苗的途徑之一。

2.3 Western blot分析重組蛋白經(jīng)Western blot分析后，在約60 kDa處出現(xiàn)了反應(yīng)條帶，表明所表達的重組蛋白能夠與SZWQ株高免兔血清發(fā)生特異性反應(yīng)（圖3）。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析表明該融合基因在原核細胞中成功的表達，并具有良好的免疫學(xué)活性和抗體結(jié)合活性，與前人報道相一致。該重組蛋白有望作為生物技術(shù)疫苗的候選蛋白，但其免疫保護性還有待進行研究。

圖2 pET-SZWQ的IPTG誘導(dǎo)濃度Fig.2 pET-SZWQ induced with IPTG at different concentration

圖3 目的蛋白的Western blot檢測Fig. 3 Western blot analysis of target protein

[1] Mackya M K. Isolation of pleuropneumonia-like prganisma (Genus Mycoplasma ) from cases of sheep pulmonary adenomatosis (S.P.A) [J] . Vet Res, 1963, 75(21)∶ 550- 551.

[2] Carmicheal L E, George T D. Isolation , propagation for proliferative interstitial pneymonia [J]. Cornell Vet, 1972, 62 (4)∶ 654-679.

[3] Woubit S, Lorenzon S, Peyraud A,et al. A specific PCR for the indecencies of Mycoplasma capricious subsp.Caprineumiae the causative agent of contagious capricious pleuropneumonia (CCPP) [J].Vet Microbiol, 2004,1044(1-2)∶ 125-132.

[4] Dassanayake R P, Shanthalingam S, Herndon C N,et al. Mycoplasma ovipneumoniae can predispose bighorn sheep to fatal Mannheimia haemolytica pneumonia[J]. Vet Microbiol, 2010, 145(3-4)∶ 354-359.

[5] Simionatto S, Marchioro S B, Galli V,et al. Efficient site-directed mutagenesis using an overlap extension-PCR method for expressing Mycoplasma hyopneumoniae genes in Escherichia coli [J]. J Microbiol Meth, 2009, 79(1)∶ 101-105.

[6] 趙芝娜, 王桂珍. 肺炎支原體黏附因子及黏附相關(guān)蛋白的研究進展[J]. 中國人獸共患病雜志, 2004, 20(6)∶ 538-539.

[7] 郭丹, 陳紅漫, 李媛, 等. 豬肺炎支原體P102基因的突變[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2009, (3)∶ 39-41.

SITE-DIRECTED MUTATIONS AND PROKARYOTIC EXPRESSION OF ADHESION MOLECULE OF MYCOPLASMA OVIPNEUMOIAE

CHENG Chen1, HUANG Hai-bi1, WANG Xiao-hui1, WANG Ren-chao1, XIE Hong-xia2, HAO Yong-qing1
(1. College of Veterinary Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. Animal Health Supervision of Sub-Bureau of Agriculture of Jiansanjiang, General Bureau of Land Reclamation of Heilongjiang Province, Jiamusi 156300, China)

In the present study, site-directed mutation technique was used to clone and express adhesion molecule gene (SZWQ-860) from an Inner Mongolia isolate SZWQ. The purif ed recombinant protein was visualized to be expected size of the target protein and perform specif c antibody-binding activity in Western blot.

Mycoplasma ovipneumoiae; adhesion molecule; site-directed mutation; recombinant protein

S852.62

B

1674-6422（2014）02-0083-04

2014-02-11

國家科技支撐計劃（2011BAD18B01）

程晨，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

郝永清，E-mail：haoyq1960@163.com