水貂IgG Fc段基因及抗原性分析

蔣 磊，趙 翠，沈 強(qiáng)，郭 浩，王秋菊，常維山

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271000；2.萊蕪菁華藥業(yè)，萊蕪 271100）

·簡報(bào)·

水貂IgG Fc段基因及抗原性分析

蔣 磊1，趙 翠1，沈 強(qiáng)1，郭 浩1，王秋菊2，常維山1

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271000；2.萊蕪菁華藥業(yè)，萊蕪 271100）

根據(jù)GenBank上發(fā)布的水貂IgG中Fc段的序列（L07789.1），設(shè)計(jì)合成1對引物用于擴(kuò)增水貂Fc段基因。從水貂脾臟中提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增水貂Fc段基因，獲得大小約606 bp的片段，將其連接T載體并測序。然后進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，在此基礎(chǔ)上利用Western blot進(jìn)行抗體雜交試驗(yàn)。結(jié)果顯示水貂IgG Fc與Fc犬核苷酸序列同源性為85.0%，氨基酸序列同源性為80.5%。Western blot顯示水貂IgG重鏈可以和抗犬IgG有效結(jié)合，遺傳進(jìn)化分析得出哺乳動物中水貂與犬IgG Fc的親緣關(guān)系最近。通過以上分析和相關(guān)文獻(xiàn)得出用犬的診斷試劑可以檢測水貂疾病，或用犬的抗血清進(jìn)行水貂疾病治療。

水貂；IgG；Fc基因；遺傳進(jìn)化分析；Western blot

近年來我國特種動物的養(yǎng)殖規(guī)模在不斷地?cái)U(kuò)大，水貂的養(yǎng)殖量也達(dá)到了一定的規(guī)模，但是目前流行于水貂群體之間的疾病多為病毒性疾病，如犬瘟熱、犬細(xì)小病[1]。目前水貂專用的病毒檢測試劑盒和膠體金檢測試紙條還沒有普及，這樣就給水貂疾病的快速檢測帶來了不便。犬的幾種病毒性疾病同樣發(fā)生在水貂身上，而犬疾病的診斷試劑市場上已趨完善，能否利用犬病毒性疾病的檢測試劑來檢測水貂身上的相應(yīng)疾??？對此進(jìn)行研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

免疫球蛋白G（IgG）Fc段是抗體C區(qū)重要的結(jié)構(gòu)域[2,3]，與抗體的種屬特異性有關(guān)。它可以介導(dǎo)抗原抗體復(fù)合物通過Fc受體與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合[4]，并在受體的介導(dǎo)下促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞對外來抗原的吞噬，進(jìn)而激發(fā)機(jī)體對特定抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)[5,6]。本研究從水貂脾臟內(nèi)提取RNA，對水貂IgG Fc基因進(jìn)行了克隆，并進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，利用Western blot檢測了水貂、犬、小鼠和雞IgG的交叉反應(yīng)性，為指導(dǎo)臨床水貂疾病的免疫檢測以及血清學(xué)治療提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和載體E.coliDH5α感受態(tài)為本實(shí)驗(yàn)室保存；pEasy-T1載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自生工生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程有限公司；2 K、2 K Plus II DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×EsTaqMaster Mix試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；犬、水貂、雞、小鼠IgG和兔抗犬IgG購自北京索來寶生物科技有限公司；HRPDAB底物顯色試劑盒購自Tiangen生化科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的美洲水貂IgG基因序列（序列號∶ L07789.1），設(shè)計(jì)1對引物，F(xiàn)∶ 5'-CTCGAGCAGTCTTCATGTTCCCCC-3'，R∶ 5'-AAGCTTGATGGTCTTCTGCGTGTGGT-3'。

1.2.2 水貂脾臟總RNA的提取及RT-PCR 參照試劑盒說明提取水貂總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系參照試劑盒說明，進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)結(jié)束后取50 μL PCR產(chǎn)物于1 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察然后進(jìn)行膠回收（參照試劑盒說明）。將回收產(chǎn)物與pEasy-T1載體結(jié)合，構(gòu)建成pEasy-T1-Fc質(zhì)粒，連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑選陽性菌落，搖菌后提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定后，送金斯瑞生物工程有限公司測序。測序結(jié)果用NCBI網(wǎng)站上Blast軟件進(jìn)行比較分析。

1.2.3 多種軟件對水貂IgG Fc段序列進(jìn)行序列分析及比較 利用DNAMAN將測序獲得的Fc序列分別與GenBank中的其他幾種哺乳動物的Fc序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性比較分析。

1.2.4 SDS-PAGE和Western blot分析 將不同動物的IgG（Y）進(jìn)行定量稀釋，然后把樣品和Loading Buffer按1∶1加入沸水中，煮樣10 min。濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%，濕法轉(zhuǎn)印過夜；5%脫脂奶粉封閉過夜，TBST漂洗2次，每次5 min；兔抗犬IgG稀釋200倍，加入10 mL在搖床上慢慢搖動，室溫孵育3 h；TBST漂洗10 min共5次，暗室HRP-DAB顯色3 min后觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 水貂Fc基因的擴(kuò)增及測序結(jié)果用試劑盒提取水貂總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條606 bp的條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果相一致（圖1）。測序結(jié)果顯示目的片段大小為606 bp，編碼202個(gè)氨基酸。

圖1 水貂 Fc RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplif ed result of mink Fc gene

2.2 水貂IgG Fc段氨基酸序列同源性比較

圖2 水貂氨基酸序列比對Fig .2 Alignment of mink’s amino acid sequence

2.3 不同動物Fc片段基因及氨基酸的遺傳變異分析犬、水貂、小鼠、雞Fc片段基因及氨基酸的遺傳變異性見表1，測序結(jié)果與GenBank上收錄的美洲水貂（L07789.1）核苷酸同源性為99.0%，氨基酸同源性為97.5%。異源動物中測序水貂的IgG重鏈Fc段核苷酸序列同源性與犬的最高達(dá)到85.0%，氨基酸序列同源性與犬的最高達(dá)到80.5%，與其他動物則相對較低。

表1 不同動物Fc片段基因及氨基酸的遺傳變異分析Table 1 The genetic variation analysis of different animal’s Fc gene and amino acids

2.4 水貂IgG Fc段氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹本試驗(yàn)擴(kuò)增得到當(dāng)?shù)厮鮅gG Fc段基因，并對其進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，得到了其與多種動物的序列比較圖和進(jìn)化樹（圖3）?；蚝桶被岱治霰砻?，不同動物的IgG Fc段有一定的同源性，從進(jìn)化樹上看出哺乳動物和禽類分屬兩大枝，且水貂和犬親緣關(guān)系最近。

圖3 IgG Fc氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of IgG Fc fragment’s amino acid sequence

2.5 SDS-PAGE和Western blot結(jié)果由Western blot可以的看出抗犬IgG酶標(biāo)抗體可以與犬IgG重鏈和輕鏈反應(yīng)，抗犬IgG酶標(biāo)抗體與小鼠IgG重鏈有明顯的交叉免疫反應(yīng)、與水貂的IgG重鏈有一定程度的交叉免疫反應(yīng)，與雞的交叉免疫反應(yīng)很弱。

圖4 多種動物IgG（Y）的SDS-PAGE及Western blot檢測Fig.4 SDS-PAGE and Western blot result of different animal’s IgG(Y)

Western blot結(jié)果證明犬類疾病抗體的試劑盒用來檢測水貂疾病是可行的，臨床實(shí)踐中也證明用診斷犬犬瘟熱、細(xì)小病毒的金標(biāo)試紙可診斷水貂的相關(guān)疾病[7]。李景存等[8]也曾應(yīng)用患犬瘟熱康復(fù)犬的血清治療水貂的犬瘟熱。

抗體本身的抗原性，主要取決于抗體重鏈的Fc段。編碼一個(gè)物種IgG重鏈恒定區(qū)的基因相對保守，因此分析不同動物IgG重鏈基因的同源性，可反映不同動物抗體本身的抗原性有無交叉。本試驗(yàn)通過多種軟件分析和Western blot檢測證明了犬用檢測試劑盒是可以應(yīng)用到水貂相關(guān)疾病的檢測中。

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GENETIC AND ANTIGENIC ANALYSIS OF FC REGION OF MINK IGG

JIANG Lei1, ZHAO Cui1, SHEN Qiang1, GUO Hao1, WANG Qiu-ju2, CHANG Wei-shan1
(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271000, China; 2. Laiwu Essence Pharmaceutical Co., Ltd, Laiwu 271100, China)

Detection methods for distemper and canine parvovirus can be universal for dogs and minks according to cloning and phylogenetic analysis of Fc gene as well as reactivity of mink IgG in Western blot. In order to obtain a certain length of Fc segment gene, a pair of primers were designed based on Fc gene sequences of mink IgG (L07789) published in GenBank. Total RNA materials were extracted from spleens of minks and amplif ed in RT-PCR. The results showed that the Fc segment gene consisted of 606 bp. Amplif ed Fc fragment was then cloned into the vector PEasy-T1 and sequenced for phylogenetic analysis. Antibody hybridization test was performed in Western blot. The nucleotide sequence homology between mink and canine was 85.0% and amino acid sequence homology was 80.5%. The heavy chain of mink IgG reacted with anti-dog IgG in Western blot. It was concluded that the Fc gene of mink and dog IgGs had the closest relationship within mammalians based on genetic evolution. The results obtained from the preceding study and related literature conf rmed that dog and mink diseases could be mutually diagnosed and treated using the reagents of either dog or mink origin.

Mink; IgG; Fc gene; phylogenetic analysis; Western blot

S852.42

B

1674-6422（2014）02-0078-05

2013-08-01

山東省教育廳項(xiàng)目（J08LF60）

蔣磊，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

常維山，E-mail：wschang@sdau.edu.cn