柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

王艷歌，董 輝，韓紅玉，趙其平，朱順海，李榴佳，吳有陵，黃 兵

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

王艷歌，董 輝，韓紅玉，趙其平，朱順海，李榴佳，吳有陵，黃 兵

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

為構(gòu)建柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶（Eimeria tenellaLactate dehydrogenase，EtLDH）的真核表達(dá)質(zhì)粒，分別以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子和雞脾臟cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出EtLDH和雞IFN-γ基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切回收目的片段后與相應(yīng)酶切的真核表達(dá)載體pCAGGS連接，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ。所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定為正確后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，分別用Western blot和間接免疫熒光鑒定EtLDH基因的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果可見(jiàn)大小約為37 kDa的目的蛋白條帶，間接免疫熒光可以檢測(cè)到特異性紅色熒光。結(jié)果表明成功構(gòu)建了EtLDH的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ，并能在真核細(xì)胞中表達(dá)，為深入研究EtLDH的生物學(xué)功能和球蟲(chóng)DNA疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)；乳酸脫氫酶；IFN-γ基因；293T細(xì)胞；真核表達(dá)

球蟲(chóng)病是雞場(chǎng)中最普遍、損失最嚴(yán)重的疾病之一，每年給全世界養(yǎng)殖業(yè)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)5億英鎊[1]。我國(guó)雞球蟲(chóng)病的發(fā)病率較高，尤其是15～50日齡的雛雞，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)80%[2]。目前，雞球蟲(chóng)病的防治主要以抗球蟲(chóng)藥物為主，但隨著藥物的不斷使用，球蟲(chóng)抗藥性日益嚴(yán)重[3]，獸藥殘留等引起的食品安全問(wèn)題也日益受到人們的重視，所以迫切需要更為理想的防治球蟲(chóng)病方法。實(shí)踐表明，免疫預(yù)防雞球蟲(chóng)病可獲得良好的效果，成為雞球蟲(chóng)病防治的趨勢(shì)[4,5]，其中，基因工程疫苗相比傳統(tǒng)疫苗具有很多優(yōu)勢(shì)，逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)[6]。

研制雞球蟲(chóng)基因工程疫苗的前提是尋找免疫抗原。目前，球蟲(chóng)抗原主要集中在與入侵相關(guān)的細(xì)胞器抗原（如微線蛋白MIC2、折光體蛋白SO7）、侵入宿主細(xì)胞階段（子孢子和裂殖子）的表面抗原（如TA4、3-1E、cSZ-1）和配子體抗原（如GAM230、GAM82、GAM56），其保護(hù)效果也已經(jīng)被大量的研究所證實(shí)，但更多的抗原仍有待發(fā)現(xiàn)和研究[7]。球蟲(chóng)乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）被認(rèn)為是一種很有潛力的疫苗候選抗原[8]，以pVAX為真核表達(dá)載體構(gòu)建的堆形艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶（Eimeria acervulinaLDH，EaLDH）DNA疫苗，對(duì)感染球蟲(chóng)的雞只具有一定的保護(hù)效果[9]。本研究旨在構(gòu)建柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶（E. tenellaLDH，EtLDH）的pCAGGS真核表達(dá)重組質(zhì)粒，通過(guò)Western blot和間接免疫熒光鑒定真核重組質(zhì)粒是否在293T細(xì)胞中成功表達(dá)，為進(jìn)一步的動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenella）第二代裂殖子cDNA、雞脾臟cDNA、兔源性抗rEtLDH多抗由本課題組制備保存；改造的真核表達(dá)載體pCAGGS和真核細(xì)胞293T由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所禽病研究室李澤君老師饋贈(zèng)；2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker DL2000、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；pGEM-T-easy vector、T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI和NheI購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清、DMEM、Opti-MEM購(gòu)自Gibco公司；Western和IP細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；近紅外熒光羊抗兔二抗購(gòu)自LI-COR公司；紅色熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗，購(gòu)自Jackson Immuno Research公司。

1.2 PCR反應(yīng)

1.2.1 EtLDH基因的克隆 根據(jù)GenBank登錄的EtLDH基因（登錄號(hào)：AY143389.1）序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增該基因完整的ORF序列，長(zhǎng)度為996 bp。引物由上海賽百盛生物技術(shù)有限公司合成，其中上游引物序列：5'-GCGAATTCATGGCGGTTTTCGAGAAGGT CCGGC-3'，下游引物序列：5'-GCCTCGAGTCAC TCTGCAGCAGCGTCGGCAGCA-3'，上下游引物分別引入EcoR I和XhoI酶切位點(diǎn)（下劃線）。以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子cDNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性3 min，95℃45 s、62.6℃ 45 s、72℃ 2 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸15 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切膠回收目的片段。

1.2.2 IFN-γ基因的克隆 根據(jù)GenBank所登錄的雞IFN-γ基因（登錄號(hào)：NM_205149）序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增該基因的部分序列，長(zhǎng)度為496 bp。引物由上海賽百盛生物技術(shù)有限公司合成，其中上游引物序列為：5'-GTGCTAGCATGACTTGCCAGACT TAC-3'，下游引物序列為：5'-GTGCTAGCATTAG CAATTGCATCTCCT-3'。上下游引物均包含NheI酶切位點(diǎn)（下劃線），以雞脾臟cDNA為模板，PCR擴(kuò)增IFN-γ基因，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃ 60 s、58℃ 60 s、72℃ 1 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切膠回收目的片段。

1.3 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1 構(gòu)建pCAGGS-EtLDH重組質(zhì)粒EtLDH的PCR產(chǎn)物和pCAGGS表達(dá)載體質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切后，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收目的片段，16℃連接過(guò)夜，連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落于4 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒用EcoR I和XhoI內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送至上海桑尼公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2 構(gòu)建pCAGGS-EtLDH-IFN-γ重組質(zhì)粒 測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆pCAGGS-EtLDH重組質(zhì)粒，經(jīng)NheI內(nèi)切酶酶切后回收目的片段，與相同處理過(guò)的IFN-γ基因16℃連接過(guò)夜，連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液經(jīng)PCR鑒定，陽(yáng)性克隆送至上海桑尼公司測(cè)序。

1.4 293T細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)凍存的293T細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，傳代2代，至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。轉(zhuǎn)染前，收集293T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔6×105個(gè)細(xì)胞鋪被6孔板2塊，37℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟分別將重組質(zhì)粒pCAGGSEtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞，并設(shè)pCAGGS空載體和正常293T細(xì)胞對(duì)照組，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h，更換為含有2%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后，取一塊6孔板進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，收集另一塊6孔板的293T細(xì)胞用于Western blot檢測(cè)。

1.5 Western blot鑒定真核表達(dá)重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中表達(dá)情況收集步驟1.4中培養(yǎng)72 h的293T細(xì)胞，加入Western及IP細(xì)胞裂解液100 μL，12 000 ×g離心5 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜；PBST洗滌3次，加入1∶200稀釋的抗rEtLDH蛋白兔血清，37℃孵育2 h；PBST洗滌3次，加入1∶10 000稀釋的近紅外熒光羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，再經(jīng)PBS洗滌3次，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.6 間接免疫熒光（indirect immunofluorescence, IFA）鑒定真核表達(dá)重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中表達(dá)情況取步驟1.4中培養(yǎng)72 h的293T細(xì)胞，用2%多聚甲醛1 mL固定20 min，PBST洗滌3次，加入1% Triton X-100 1 mL，室溫下作用15 min，PBST洗3次，加入2% BSA-PBS 2 mL，4℃封閉過(guò)夜，PBST洗滌3次，加入抗rEtLDH蛋白兔血清（1∶100倍稀釋），37℃作用1 h；PBST洗滌3次，加入1∶500稀釋的紅色熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃作用1 h，PBST洗滌3次，PBS浸泡30 min，加入DAPI染核10 min，PBS洗滌3次，在蓋玻片上滴適量熒光猝滅劑，在正置熒光顯微鏡下觀察，拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 EtLDH基因的克隆以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)合成的特異性引物擴(kuò)增出1條大約1000 bp的目的條帶，其大小與預(yù)期目的條帶996 bp一致（圖1）。

圖1 EtLDH的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 The result of PCR amplif cation of EtLDH gene

2.2 IFN-γ基因的克隆以雞脾臟cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增出一條大約為500 bp目的條帶，其大小與預(yù)期目的條帶496 bp相符（圖2）。

圖2 雞IFN-γ基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The result of PCR amplif cation of chicken IFN-γ gene

2.3 真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.3.1 pCAGGS-EtLDH重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xhol對(duì)EtLDH的PCR產(chǎn)物和空載體pCAGGS進(jìn)行雙酶切，純化后進(jìn)行連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCAGGS-EtLDH。對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果均為陽(yáng)性（圖3），測(cè)序結(jié)果顯示（圖略）該基因正向插入，無(wú)移碼突變，表明pCAGGS-EtLDH重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。IFN-γ重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞并被成功表達(dá)。

圖3 重組質(zhì)粒pCAGGS-EtLDH的PCR與雙酶切鑒定結(jié)果Fig. 3 Identif cation of recombinant plasmid pCAGGSEtLDH by PCR and enzyme digestion analysis

圖4 重組質(zhì)粒pCAGGS-EtLDH-IFN-γ的PCR鑒定Fig. 4 Result of PCR detection of recombinant plasmid pCAGGS- EtLDH-IFN-γ

2.3.2 pCAGGS-EtLDH- IFN-γ重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 pCAGGS-EtLDH-IFN-γ重組質(zhì)粒構(gòu)建后，PCR鑒定能擴(kuò)增出約496 bp的目的條帶（圖4）；測(cè)序結(jié)果顯示（圖略），IFN-γ基因正向插入pCAGGS-LDH重組質(zhì)粒，無(wú)移碼突變，說(shuō)明pCAGGS-EtLDH-IFN-γ重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3.3 Western blot分析pCAGGS-EtLDH和pCAGGSEtLDH-IFN-γ在293T細(xì)胞中的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pCAGGS-EtLDH和pCAGGSEtLDH-IFN-γ重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞中均可檢測(cè)到大小約37 kDa的目的條帶，而轉(zhuǎn)染空載體的293T細(xì)胞和正常的293T細(xì)胞中卻沒(méi)有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)（圖5），表明pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-

2.3.4 間接免疫熒光檢測(cè)pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ在293T細(xì)胞中的表達(dá) 利用抗rEtLDH蛋白的兔血清，分別對(duì)pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后的293T細(xì)胞進(jìn)行了免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示，在分別轉(zhuǎn)染了pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDHIFN-γ重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞中，紅色熒光通道可以看到特異的紅色熒光，藍(lán)色熒光通道可看到細(xì)胞核的藍(lán)色熒光，綠色熒光通道可看到載體本身的綠色熒光；而在轉(zhuǎn)染了pCAGGS空載體的293T細(xì)胞中，有細(xì)胞核的藍(lán)色熒光和載體本身的綠色熒光，但無(wú)紅色熒光（圖6）。結(jié)果表明，pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ重組質(zhì)粒能在293T細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染和表達(dá)。

3 討論

作為一種新型疫苗，核酸疫苗是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的疫苗相比，核酸疫苗具有免疫效果好、安全性高、免疫應(yīng)答持久、易于研制生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[10]。影響核酸疫苗效果的因素包括適宜抗原、載體類(lèi)型及免疫佐劑等[11]。

圖5 真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后Western blot鑒定結(jié)果Fig. 5 Identif cation of EtLDH protein in 293T cells transfected with eukaryotic recombinant plasmid by Western blot

圖6 真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后IFA檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Detection of EtLDH protein in 293T cells transfected with eukaryotic recombinant plasmid by IFA

本文所選用的抗原分子為L(zhǎng)DH，LDH是一種廣泛分布于微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的重要功能酶，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一。大多數(shù)體內(nèi)寄生蟲(chóng)的能量來(lái)源于無(wú)氧糖酵解，LDH是該途徑的終端酶，所以，LDH對(duì)于寄生蟲(chóng)生命活動(dòng)的正常進(jìn)行至關(guān)重要。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于寄生蟲(chóng)LDH的研究主要集中在瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)等[12,13]。Brown等[14]對(duì)人體4種瘧原蟲(chóng)LDH（PlasmodiumLDH，PLDH）基因進(jìn)行了序列分析，證實(shí)pLDH具有種、屬特異性。Winter等[15]在4種PLDH底物特異性環(huán)上發(fā)現(xiàn)含有相同的5個(gè)氨基酸插入序列（SDKEW），是一個(gè)重要的藥物靶標(biāo)。LDH是弓形蟲(chóng)分化所必需的酶，LDH的上調(diào)表達(dá)，可增加弓形蟲(chóng)的分化，而LDH的缺失，可使弓形蟲(chóng)的致病性減弱[12,16]。研究LDH對(duì)于促進(jìn)寄生蟲(chóng)病診斷抗原和疫苗研究以及新抗蟲(chóng)藥物的研發(fā)有重要的意義。已有研究表明，每種雞球蟲(chóng)僅有一種LDH，堆型艾美耳球蟲(chóng)、巨型艾美耳球蟲(chóng)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)LDH氨基酸序列的同源性為66%～80%，其蛋白在卵囊、子孢子、裂殖體和裂殖子階段的表達(dá)水平相當(dāng)，被認(rèn)為是一種很有潛力的疫苗候選抗原[8]。宋鴻雁[9]構(gòu)建了堆型艾美耳球蟲(chóng)LDH的DNA疫苗，動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)和免疫機(jī)理研究證實(shí)，該DNA疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，共同參與抵抗球蟲(chóng)感染，為機(jī)體提供一定保護(hù)力，且雞IL-2或IFN-γ基因的共表達(dá)可增加疫苗的免疫效力。

質(zhì)粒載體是核酸疫苗的主體，表達(dá)抗原蛋白的能力越強(qiáng)，有效激發(fā)免疫應(yīng)答就越強(qiáng)。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，真核表達(dá)載體系統(tǒng)所表達(dá)的蛋白更接近于天然蛋白，有利于將來(lái)對(duì)該蛋白的功能進(jìn)行研究。本文采用的載體是經(jīng)張樹(shù)梅等[17]改造后的pCAGGS真核表達(dá)載體。pCAGGS載體含有雞的β-actin啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子，其重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)能力顯著高于其他真核表達(dá)載體[18,19]，被廣泛應(yīng)用于基因疫苗的研制及RNA病毒反向遺傳操作等諸多領(lǐng)域。姜永萍等[20]研究表明，雞β-actin啟動(dòng)子表達(dá)載體pCAGGS可顯著提高HA基因體外表達(dá)水平和H5亞型禽流感DNA疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性抗體免疫反應(yīng)水平，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。白志坤等[21]應(yīng)用pCAGGS載體構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒，評(píng)估新城疫病毒DNA疫苗免疫保護(hù)力水平，表明構(gòu)建的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。楊馥如等[22]對(duì)H1亞型豬流感病毒HA基因密碼子優(yōu)化的DNA疫苗免疫保護(hù)效力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，pCAGGS構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)?？娠@著提高體液免疫和細(xì)胞免疫的應(yīng)答水平。徐大偉等[23]將鴨坦布蘇病毒E基因插入pCAGGS載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCAGGS-E，結(jié)果顯示編碼E基因的重組質(zhì)粒DNA免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。張樹(shù)梅等[17]對(duì)pCAGGS載體進(jìn)行了改造，引入SV40啟動(dòng)子及單皰疹病毒（HSV）TK基因的polyA 序列，并且在β-actin啟動(dòng)子下游插入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（IRES），構(gòu)建了能夠同時(shí)表達(dá)3個(gè)外源基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-IRES，為了便于檢測(cè)，其中一個(gè)多克隆位點(diǎn)已經(jīng)克隆進(jìn)綠色熒光蛋白基因并可正確表達(dá)。由于該載體可以表達(dá)綠色熒光蛋白，故本研究選用紅色熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗來(lái)檢測(cè)EtLDH的表達(dá)情況。采用該載體，本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)棒狀體頸部蛋白2（rhoptry neck protein 2，RON2）、鈣依賴蛋白激酶 3（calcium-dependent protein kinases 3，CDPK3）、頂體膜蛋白1（apical membrane antigen，EtAMA1）等基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，動(dòng)物免疫保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，所構(gòu)建的核酸疫苗對(duì)免疫雞只產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)性[11]。

大量研究表明，細(xì)胞因子與抗原聯(lián)合應(yīng)用可以提高球蟲(chóng)抗原的免疫反應(yīng)能力。Xu等[24]、Song等[25]用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)TA4抗原和雞IL-2串聯(lián)構(gòu)建的DNA疫苗可以提高DNA疫苗的保護(hù)力；Ding等[26]報(bào)道用雞IL-2、IL-15、IL-17、IL-18或IFN-γ基因與3-1E蛋白一起免疫雞，可以提供球蟲(chóng)比單獨(dú)免疫3-IE蛋白更好的保護(hù)力。本研究所選的細(xì)胞因子為IFN-γ，是最具特征的雞細(xì)胞因子之一，具有佐劑和促進(jìn)生長(zhǎng)的特性[27,28]。Lowenthal等[29]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)重組雞IFN-γ與抗原一起免疫雞時(shí)，可延長(zhǎng)SPF雞再次免疫應(yīng)答反應(yīng)，比單獨(dú)免疫抗原產(chǎn)生更高的抗體水平和更久的持續(xù)期。

綜上，本研究構(gòu)建了重組EtLDH蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDHIFN-γ，并轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，通過(guò)免疫印跡和間接免疫熒光的方法證實(shí)EtLDH基因在真核細(xì)胞中成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究該蛋白的生物學(xué)功能和研制球蟲(chóng)DNA疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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CONSTRUCTION AND DETECTION OF EUKARYOTIC RECOMBINANT EXPRESSION PLASMIDS OF EIMERIA TENELLA LACTATE DEHYDROGENASE

WANG Yan-ge, DONG Hui, HAN Hong-yu, ZHAO Qi-ping, ZHU Shun-hai, LI Liu-jia, WU You-ling, HUANG Bing
(Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

To construct eukaryotic recombinant expression plasmids of lactate dehydrogenase (LDH) ofEimeria tenella, the full-length cDNA of LDH and partial fragment of IFN-γ gene were amplif ed in PCR from the cDNAs of the second-generation merozoites ofE. tenellaand chicken spleen, respectively. The PCR products and pCAGGS vectors were digested with the same restriction enzymes for construction of recombinant eukaryotic expression plasmids pCAGGS-EtLDH and pCAGGS-EtLDH- IFN-γ. Subsequently , recombinant plasmids were transfected into 293T cells. The expression of recombinant LDH protein was conf rmed in indirect immunof uorescene(IFA) and Western blot. In Western blot, recombinant LDH antiserum recognized a protein about 37 kDa derived from transfected 293T cells, which was in accordance with molecular mass of target protein. Red f uorescence was observed in IFA. These results indicated that the recombinant plasmids of pCAGGS-EtLDH and pCAGGS-EtLDH-IFN-γ were successfully constructed and expressed in eukaryotic cells, which laid a foundation for future research on biological functions and DNA vaccine.

Eimeria tenella; lactate dehydrogenase; IFN-γ gene; 293T cell; eukaryotic expression

S852.723

A

1674-6422（2014）02-0065-07

2014-02-25

國(guó)家自然科學(xué)基金（31272557）

王艷歌，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)；董輝，男，博士，副研究員，主要從事球蟲(chóng)生物學(xué)研究

黃兵，E-mail∶ hb@shvri.ac.cn