利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞高適應(yīng)性的H9N2流感病毒

任超超，滕巧泱，申偉霞，李雪松，李國(guó)新，楊健美，閆麗萍，李澤君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞高適應(yīng)性的H9N2流感病毒

任超超，滕巧泱，申偉霞，李雪松，李國(guó)新，楊健美，閆麗萍，李澤君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

H9N2亞型禽流感病毒通常在雞胚上增值性能高，但在細(xì)胞上增值能力差。為了獲得在細(xì)胞上高效表達(dá)H9N2亞型禽流感HA和NA抗原的疫苗株，通過反向遺傳操作技術(shù)將A/Chicken/Shanghai/441/2009（H9N2，SH441）的HA和NA基因與A/Puerto Rico/8/34（H1N1，PR8）的6個(gè)內(nèi)部基因進(jìn)行人工重組，拯救并獲得了1株禽流感重組病毒441-PR8，并對(duì)它的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，重組病毒441-PR8株在細(xì)胞上的增殖能力明顯高于野生毒株SH441，該重組病毒有望成為H9N2亞型禽流感疫苗研制的候選毒株。

禽流感病毒；H9N2亞型；H1N1亞型；反向遺傳操作；重組病毒

禽流感（avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒屬禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的家禽、野鳥和部分哺乳動(dòng)物發(fā)病的一種傳染病。根據(jù)禽流感病毒致病性的不同，可分為高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。目前，中國(guó)的低致病性禽流感疫情主要以H9亞型為主。H9N2亞型禽流感病毒最早于1966年從北美的火雞體內(nèi)分離得到[1]，我國(guó)自1994年由陳伯倫等[2]首次從雞群中分離到H9亞型 AIV以來，該亞型禽流感病毒廣泛存在于遼寧省、安徽省、山東省、廣東省、福建省、江蘇省、河南省、湖南省、湖北省、上海市、廣西壯族自治區(qū)、云南省、四川省、新疆維吾爾自治區(qū)等全國(guó)大部分地區(qū)[3]。H9N2 亞型禽流感病毒雖然不引起感染的禽類大量死亡，但是由于該病毒傳播能力極強(qiáng)，存在范圍極廣，導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降、免疫抑制病、與其他病原共感染時(shí)常導(dǎo)致高死亡率。1998年，中國(guó)和韓國(guó)分別從豬的體內(nèi)分離出H9N2亞型病毒[4,5]，提示病毒正在威脅包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。由于抗原變異十分活躍，H9N2亞型禽流感給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)和人類健康帶來了嚴(yán)重危害。

接種疫苗是預(yù)防禽流感發(fā)生與傳播最有效的手段，對(duì)提高我國(guó)的禽病防治水平、保障我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有十分重要的意義。H9N2 亞型禽流感疫苗在我國(guó)普遍使用，在強(qiáng)大免疫壓力下，H9N2亞型禽流感病毒變異加快，而作為禽流感疫苗應(yīng)同時(shí)具有較強(qiáng)的免疫原性和良好生長(zhǎng)特性，現(xiàn)有商品化滅活苗已無法完全保護(hù)雞群免受 H9N2 亞型禽流感病毒流行株的感染。目前，通過對(duì)2008～2009 兩年中不同地區(qū)分離到的 20 多株 H9N2 亞型禽流感病毒的序列分析和抗原交叉保護(hù)試驗(yàn)，篩選到1株具有良好抗原性的病毒株 A/Chicken/Shanghai/441/2009（H9N2），簡(jiǎn)稱SH441。據(jù)此，本研究旨在以PR8內(nèi)部基因?yàn)楣羌躘6]，通過“6+2”反向遺傳操作技術(shù)進(jìn)行人工重組，拯救并獲得1株具有良好免疫原性的重組病毒。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒病毒PR8反向遺傳操作系統(tǒng)（包括pBD-PB1、pBD-PB2、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M、pBD-NS E67S[6]）、pBD載體、293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供；SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞公司；H9N2亞型禽流感病毒SH441、A/Chicken/Shanghai/169/2009（169）、A/Chicken/Shanghai/340/2009（340）、A/Chicken/Shanghai/510/2009（510）、A/Chicken/Guangdong/1214/2009（1214）、A/Chicken/Hunan/2351/2009（235）、A/Chicken/Shangdong /2553/2009（2553）和A/Chicken/Shangdong/2567/2009（2567）保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑TRIZOL、Pfx DNA Polymerase、LipofectamineTM2000、OPTI-MEM購(gòu)自Invitrogen 公司；DNA Marker（DL2000）購(gòu)自寶生物公司；限制性內(nèi)切酶BspQI、T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司；DNA 純化回收試劑盒和小劑量質(zhì)粒抽提試劑盒分別購(gòu)自Axygen 公司；去內(nèi)毒素小量抽提質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自于OMEGA公司。

1.3 引物根據(jù)流感病毒保守序列設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄12 bp引物和HA、NA片段通用擴(kuò)增引物，見表1。

表1 12 bp引物及擴(kuò)增流感HA和NA引物Table 1 12 bp primer and primers of HA and NA

1.4 重組質(zhì)粒pBD-441-HA和pBD-441-NA的構(gòu)建與鑒定按QIAGEN說明書，提取流感病毒SH441株的總RNA。用12 bp引物將病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。以此cDNA為模板，分別用sapI-HA-up、sapI-HA-down 和sapI-NA-up、sapI-NA-down為上下游引物（見表1），Pfx DNA Polymerase進(jìn)行PCR, 擴(kuò)增 SH441 HA 和NA全片段，并用1%瓊脂糖電泳鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后，用BspQ I酶切，并連接于同樣酶切的pBD載體中。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定并測(cè)序。

1.5 轉(zhuǎn)染按照OMEGA去內(nèi)毒素小量抽提質(zhì)粒試劑盒的說明書進(jìn)行超純度抽提質(zhì)粒后，利用LipofectamineTM2000將所構(gòu)建含SH441的HA和NA基因的質(zhì)粒pBD-441-HA、pBD-441-NA與含有PR8病毒6個(gè)內(nèi)部基因的質(zhì)粒pBD-PB1、pBD-PB2、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M、pBD-NS E67S共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后6 h，棄去細(xì)胞上清，加入1 mL新鮮的OPTI-MEM培養(yǎng)液，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.6 獲救病毒的鑒定和病毒滴度的測(cè)定轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞上清，接種9～11 日齡SPF 雞胚，置于37℃孵化器內(nèi)培養(yǎng)72 h，然后4℃過夜，收獲雞胚尿囊液。通過血凝試驗(yàn)測(cè)定尿囊液凝集紅細(xì)胞能力，收集有血凝活性的尿囊液，分裝并凍存于-80℃，命名為441-PR8株重組病毒。同1.3方法，PCR擴(kuò)增重組病毒441-PR8株中的HA和NA片段，并用1%瓊脂糖電泳鑒定，之后測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列，比較與SH441序列是否一致。將尿囊液按10倍倍比稀釋，把不同稀釋度的重組病毒和SH441毒分別感染96孔板中密度長(zhǎng)到80%的MDCK細(xì)胞，每孔加入100 μL病毒，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)，吸附了病毒的細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞病變，然后利用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.7 病毒在細(xì)胞上生長(zhǎng)曲線的繪制將441-PR8和SH441稀釋為1000 TCID50/孔，按照這個(gè)稀釋度感染六孔板中長(zhǎng)至80%的MDCK細(xì)胞，每孔接毒量為100 μL。吸附1 h后，換入含有0.5 μg/mL的TPCKTrypsin的無血清培養(yǎng)液，在接毒6、12、24、36、48、60、72 h后，分別收集其細(xì)胞上清200 μL并補(bǔ)液200 μL，測(cè)定它們的血凝效價(jià)，每份樣品重復(fù)3次，比較重組病毒441-PR8和SH441在MDCK細(xì)胞上的生長(zhǎng)情況。

按上述方法同時(shí)進(jìn)行重組毒441-PR8與本實(shí)驗(yàn)室保存的其他7株H9N2亞型禽流感病毒分離株在MDCK細(xì)胞系上生長(zhǎng)特性比較，設(shè)PR8和PBS分別為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。在接毒后24、48、72 h取上清測(cè)定血凝效價(jià)，分析各病毒株在細(xì)胞上的生長(zhǎng)情況。

1.8 在MDCK細(xì)胞上病毒接毒量的比較為了將來在細(xì)胞上大批量擴(kuò)增病毒，本研究對(duì)在T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增的條件進(jìn)行了摸索。重組毒441-PR8的尿囊液分別按8×104、4×104、2×104、1×104、5×103TCID50/瓶接毒量接毒，吸附2 h后，加入含有0.5 μg/mL的TPCK-Trypsin的無血清培養(yǎng)液5 mL，接毒后24～108 h每12 h取1次培養(yǎng)上清，測(cè)定血凝效價(jià)，分析最佳接毒劑量和收毒時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 pBD-441-HA和pBD-441-NA重組質(zhì)粒的鑒定分別用sapI-HA-up、sapI-HA-down 和sapI-NA-up、sapI-NA-down 為上下游引物，PCR 擴(kuò)增SH441 HA和NA全片段，并用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。從圖1可以看出，分別擴(kuò)增出大小為1742 bp和1457 bp的特異目的條帶，與預(yù)期條帶大小一致。此外，測(cè)序結(jié)果表明序列完全與預(yù)期一致。

圖1 PCR鑒定重組pBD-441-HA和pBD-441-NA質(zhì)粒Fig.1 Identif cation of plasmids pBD-441-HA and pBD-441-NA by PCR

2.2 救獲重組病毒的鑒定經(jīng)血凝實(shí)驗(yàn)測(cè)定，救獲重組病毒441-PR8株的血凝效價(jià)為29。收獲尿囊液、分裝并保存于-80℃冰箱備用。此外，取尿囊液提取

RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，救獲的重組病毒HA和NA序列與母本序列完全一致。

2.3 救獲重組病毒441-PR8和SH441的病毒滴度利用Reed-Muench法計(jì)算獲得病毒滴度：重組病毒441-PR8株滴度為5×105.5TCID50/100 μL；SH441滴度為104.5TCID50/100 μL。

2.4 重組病毒441-PR8和野生病毒分離株在MDCK細(xì)胞上生長(zhǎng)特性的比較結(jié)果按1000 TCID50/孔的量感染細(xì)胞，重組病毒441-PR8感染后12 h血凝價(jià)迅速升高到24，36 h就已達(dá)到28，此后基本維持在該水平。而SH441的血凝效價(jià)上升緩慢，48 h達(dá)到峰值24（見圖2）。與其他7株H9N2亞型病毒株比較（圖3），重組病毒441-PR8在細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性雖然沒有達(dá)到PR8的最高滴度，但明顯優(yōu)于其他任何一個(gè)H9N2亞型的野生分離株。

2.5 病毒接毒量的測(cè)定將重組病毒441-PR8的雞胚尿囊液做一系列稀釋后接種到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，結(jié)果顯示當(dāng)接毒量為8×104TCID50/瓶，36 h的血凝價(jià)就已達(dá)到210，36～84 h血凝價(jià)趨于平穩(wěn)，所以T25瓶的最佳接毒量為每瓶8×104TCID50，收毒時(shí)間為接毒后36 h即可（圖4）。

圖2 重組病毒441-PR8及SH441感染MDCK細(xì)胞后不同時(shí)間的血凝效價(jià)Fig.2 Hemagglutination titer of the supernatant of MDCK cells infected with reassortant inf uenza virus (441-PR8) and wild-type SH441 inf uenza virus at different hours post-infection

圖3 重組病毒441-PR8及野生型H9N2禽流感病毒感染MDCK細(xì)胞后不同時(shí)間的血凝效價(jià)比較Fig.3 Hemagglutination titer of the supernatant of MDCK cells infected with reassortant inf uenza virus (441-PR8) and H9N2 avian inf uenza virus isolates at different hours post-infection

圖4 重組病毒441-PR8在MDCK細(xì)胞上不同接毒劑量和收毒時(shí)間的血凝效價(jià)的比較分析Fig.4 Comparison of hemagglutination titer of the supernatant of MDCK cells infected with different dose of reassortant inf uenza virus (441-PR8) at different hours post-infection

3 討論

H9N2亞型禽流感病毒在全球范圍的家禽和野生鳥類中流行傳播，且感染宿主譜已經(jīng)向哺乳動(dòng)物包括人類和豬拓伸[7]。近些年分離的毒株的致病性和毒力等生物學(xué)特性趨于轉(zhuǎn)強(qiáng)，有效疫苗的研發(fā)對(duì)于積極預(yù)防H9亞型流感病毒具有深遠(yuǎn)意義。目前我國(guó)使用的H9N2亞型禽流感疫苗均為雞胚尿囊液制備的滅活疫苗，而利用動(dòng)物傳代細(xì)胞來制備流感疫苗的研究已成為流感疫苗發(fā)展的重要方向。同傳統(tǒng)的基于雞胚的流感疫苗制備技術(shù)相比，該方法具有無外源因子污染，易于規(guī)?；a(chǎn)，能較好的維持病毒抗原穩(wěn)定，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率等優(yōu)點(diǎn)[8]，因而成為目前流感疫苗研制工作的主要方向之一。

A/Puerto Rico/8/34 （H1N1）（PR8）毒株是一株具有高繁殖能力的雞胚適應(yīng)株，在細(xì)胞上的增值能力也很強(qiáng)，疫苗研制中常常將PR8的內(nèi)部基因與流行毒株的HA和NA基因重組，將重組病毒作為疫苗株來提高病毒滴度[9]，這樣獲得的重組病毒既繼承了PR8內(nèi)部基因供體的生物學(xué)特性，同時(shí)還保留了流行毒株良好的免疫原性。如Shirakura等[10]采用7∶1、6∶2、和5∶3模式研制pdm09的流感疫苗候選株，Corinne等[11]將PR8∶H3N2按不同組合研制H3N2亞型流感疫苗種子，Pan等[12]利用PR8神經(jīng)氨酸酶包裝信號(hào)序列提高H5N1亞型候選疫苗生長(zhǎng)滴度。前期本研究室已經(jīng)構(gòu)建了犬流感H3N2-PR8的重組病毒，與野生型病毒相比在雞胚和細(xì)胞上的增值能力都很高，國(guó)內(nèi)外也有很多學(xué)者研制出內(nèi)部基因來源于 A/PR8/34 株的高繁殖力重組病毒。但是這些重組病毒疫苗候選株都是在雞胚上進(jìn)行大量擴(kuò)增，在細(xì)胞上進(jìn)行H9亞型重組病毒疫苗候選株的研究還沒有見到報(bào)道。

本研究室前期制備了一系列H9N2亞型分離毒株的高免血清，通過抗原交叉反應(yīng)證實(shí)了441分離株制備的血清與近些年分離的H9N2亞型病毒株有良好的交叉反應(yīng)性。為了獲得在細(xì)胞上高效表達(dá)H9N2亞型禽流感HA和NA抗原的疫苗株，本研究通過反向遺傳操作技術(shù)將441的HA和NA基因與PR8的6個(gè)內(nèi)部基因進(jìn)行人工重組，拯救并獲得了一株禽流感重組病毒441-PR8株。生長(zhǎng)特性研究發(fā)現(xiàn)，與野生毒株441和其他7株H9N2亞型流感病毒相比，重組病毒441-PR8株在MDCK細(xì)胞上增殖速度快，短時(shí)間內(nèi)就能產(chǎn)生較高血凝效價(jià)28，而野生毒株增殖速度較慢，SH441株當(dāng)感染60 h時(shí)血凝價(jià)僅達(dá)到最大為24，重組病毒在細(xì)胞上的生長(zhǎng)滴度是野生毒株的16倍，結(jié)果表明我們獲得了1株在細(xì)胞上能快速繁殖的病毒441-PR8株，這將為今后在細(xì)胞上大量繁殖病毒進(jìn)行細(xì)胞疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。另外，本研究也對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了初步探討，確定了最佳接毒劑量和最佳收毒時(shí)間，為今后細(xì)胞疫苗的生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

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DEVELOPMENT OF A HIGH-GROWTH H9N2 REASSORTANT INFLUENZA VIRUS BY REVERSE GENETIC MANIPULATION ON CELLS

REN Chao-chao, TENG Qiao-yang, SHEN Wei-xia, LI Xue-song, LI Guo-xin, YANG Jian-mei, YAN Li-ping, LI Ze-jun
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

H9N2 inf uenza viruses generally grow at high titers in chicken embryonated eggs but poorly in cell cultures. In order to obtain a H9N2 vaccine virus with high yield of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) in cell cultures, reverse genetics technique was used to develop “6+2” reassortant virus (441-PR8). The HA and NA genes of the reassortant virus 441-PR8 were derived from A/Chicken/Shanghai/441/2009 (H9N2, SH441) and the remaining six internal segments were derived from A/Puerto Rico/8/34 (H1N1, PR8). The biological properties of the reassortant virus 441-PR8 were characterized. The reassortant virus 441-PR8 replicated more vigorously in MDCK cells than its parent virus SH441, suggesting that the reassortant virus 441-PR8 may represent a promising vaccine candidate for H9N2 avian inf uenza.

Avian inf uenza virus; H9N2 subtype; H1N1 subtype; reverse genetics manipulation; reassortant virus

S852.659.5

A

1674-6422（2014）02-0007-06

2014-02-28

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201003012）；863計(jì)劃（2011AA10A200）；上海市科委“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”現(xiàn)代農(nóng)業(yè)領(lǐng)域重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（12391902000）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2013JB06）；國(guó)際交流與合作專項(xiàng)基金（2010DFB33920）

任超超，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

李澤君，E-mail：lizejun@shvri.ac.cn；閆麗萍，E-mail：ylp@shvri.ac.cn