HeLa細胞中泛素蛋白酶體系統(tǒng)對新城疫病毒復(fù)制的影響

曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，譚 磊，孫英杰，宋翠萍，丁 鏟

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

HeLa細胞中泛素蛋白酶體系統(tǒng)對新城疫病毒復(fù)制的影響

曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，譚 磊，孫英杰，宋翠萍，丁 鏟

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

本文主要對細胞的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是否參與新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的復(fù)制過程進行了研究。用NDV感染HeLa細胞，對細胞樣品進行Western blot實驗，并檢測細胞26S蛋白酶體的三種蛋白水解活性變化。同時使用多種泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)的抑制劑處理細胞并做NDV感染，測定細胞上清中病毒TCID50值，比較藥物處理與DMSO處理對病毒增殖的影響。結(jié)果表明，HeLa細胞在感染NDV后，細胞內(nèi)泛素化蛋白水平降低，而26S蛋白酶體的三種蛋白水解活性都顯著升高；使用泛素-蛋白酶體系統(tǒng)抑制劑后NDV的增殖受到了明顯的抑制，證明NDV在HeLa細胞內(nèi)的增殖與細胞自身的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)關(guān)系密切。

新城疫病毒；泛素-蛋白酶體系統(tǒng)；蛋白酶體抑制劑；復(fù)制

新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的禽類急性高度接觸性傳染病，發(fā)病率高死亡率高。在OIE陸生動物衛(wèi)生法典中，本病屬于必須報告的A類病，世界各國對本病的發(fā)生和流行均高度重視[1]。新城疫病毒屬于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒屬，為單股負鏈，不分節(jié)段的RNA病毒。RNA基因組包含6個主要基因，它們以3'-NP-P-M-F-HN-L-5'的順序編碼結(jié)構(gòu)性蛋白和兩個非結(jié)構(gòu)性蛋白（W蛋白和V蛋白[2]）。該病毒能在細胞質(zhì)中復(fù)制。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)包含泛素分子、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）、泛素蛋白連接酶（ubiquitin-protein ligase，E3）、26S蛋白酶體和去泛素化酶。蛋白質(zhì)降解過程由兩部分組成，第一步通過三個連續(xù)的酶促反應(yīng)將靶蛋白連接上多泛素鏈，即靶蛋白的泛素化，第二步即是泛素化的靶蛋白被26S蛋白酶體識別并降解[3,4]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)多種病毒以各種方式利用宿主細胞的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)為病毒自身的入侵、復(fù)制、出芽等服務(wù)。例如：單純皰疹病毒、流感病毒在入侵宿主細胞的過程中需要利用泛素蛋白酶體系統(tǒng)[5,6]。尼帕病毒的出芽過程需要依靠泛素調(diào)節(jié)的M蛋白的核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)運[7]。但是關(guān)于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是否參與了NDV的感染過程目前尚無報道。研究發(fā)現(xiàn)NDV感染的細胞中泛素化蛋白水平發(fā)生變化和26S蛋白酶體三種蛋白水解活性有顯著變化，鑒于此，本試驗使用針對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的多種抑制劑研究泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在NDV感染HeLa細胞過程中所起的作用，從而加深對病毒與宿主細胞互作過程的認識，從新的角度解釋NDV的致病機理。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞本試驗所用病毒毒株為 NDV標準強毒 Herts/33，由揚州大學劉秀梵院士惠贈；HeLa細胞系由本研究室保存，細胞采用含 10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，常規(guī)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 化學試劑蛋白酶體抑制劑MG-132購自碧云天生物公司；Bortezomib購自Selleckchem公司；Lactacystin和泛素活化酶E1抑制劑PYR-41購自Sigma公司；蛋白酶體活性檢測試劑盒Proteasome-Glo購自Promega公司；泛素抗體購自Cell signaling公司。其他生化試劑均為分析純，購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 新城疫病毒感染后泛素化蛋白水平檢測將HeLa細胞接種至60 mm培養(yǎng)皿中，使用含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基在37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至80%～90%時，接種 5 MOI的Herts/33病毒，并在感染后的8、12、16、24 h收取細胞樣品，進行Western blot，檢測新城疫病毒感染后HeLa細胞中泛素化蛋白水平的變化。

1.4 新城疫病毒感染后蛋白酶體活性檢測根據(jù)蛋白酶體檢測試劑盒說明書將96孔細胞培養(yǎng)板分為4個組：①空白組、②細胞組、③Herts/33、④MG-132組。HeLa細胞以1.8×104個/孔接種至96孔細胞培養(yǎng)板中特定位置，細胞生長到80%左右時，棄上清，①②④組每孔加入100 μL培養(yǎng)基，第③組中接種5 MOI Herts/33，37℃孵育1 h后換液；在①②③組中每孔加入100 μL維持培養(yǎng)基，第④組中每孔加入100 μL MG-132（0.4 μmol/L），37℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h后加入檢測試劑，用酶標儀檢測發(fā)光值并計算水解活性位點活性。

1.5 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)抑制劑最適工作濃度篩選根據(jù)參考文獻[8～11]選擇三種蛋白酶體抑制劑MG-132、Bortezomib、Lactacystin 和泛素活化酶E1抑制劑PYR-41。WST-1可以被細胞中線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的有色甲臜產(chǎn)物，細胞增殖越多顏色越深，通過比色法可以檢測細胞活性，所以可以用WST-1法檢測不同抑制劑濃度下的細胞活性[12]。用DMEM培養(yǎng)基將以上4種抑制劑分別稀釋成6個稀釋度。每孔HeLa細胞中加入100 μL抑制劑，每種抑制劑稀釋度做3個重復(fù)。37℃培養(yǎng)50 h后每孔加入WST-1試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h。用酶標儀檢測OD450結(jié)果，通過計算判斷不同的抑制劑濃度時細胞活性情況，選擇細胞活性不低于80%的抑制劑濃度為最適工作濃度。

1.6 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)抑制劑對病毒增殖情況的影響

1.6.1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)抑制劑對病毒滴度的影響 根據(jù)相關(guān)文獻報道[13]，將HeLa細 胞接種至35 mm培養(yǎng)皿，使用含10% FBS 的 DMEM培養(yǎng)基在 37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至80%～90%時，將每種抑制劑都分為3種處理組：①抑制劑+Herts/33處理組；②相同稀釋度的DMSO+Herts/33處理組；③Herts/33處理組。根據(jù)試驗1.5中確定的4種抑制劑最適工作濃度，確定分組。首先在第①、②組中加入抑制劑或DMSO，第③組中加入培養(yǎng)基，都置于37℃預(yù)處理2 h后棄上清，再根據(jù)細胞計數(shù)將5 MOI Herts/33接種至培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)1 h后洗去，最后在第①、②組中加入由維持培養(yǎng)基配置的抑制劑或DMSO，第③組中加入維持培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至第12 h和第24 h，分別收集細胞上清測定TCID50值。

1.6.2 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)抑制劑對病毒生長狀況的影響 將HeLa細胞接種至 35 mm培養(yǎng)皿， 使用含10% FBS 的 DMEM培養(yǎng)基在 37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至80%～90%時，根據(jù)細胞計數(shù)將1 MOI Herts/33接種至培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)1 h后洗去。使用0.4 μmol/L的MG-132處理細胞，同時設(shè)置無抑制劑處理的空白組，分別在病毒感染后第2、4、6、8、12、24、32、48 h收集細胞上清，檢測上清中病毒TCID50值，分別繪制使用蛋白酶體抑制劑MG-132和未使用抑制劑時的Herts/33病毒在HeLa細胞上的生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 新城疫病毒感染后泛素化蛋白水平檢測本試驗所用Herts/33毒株的病毒滴度為107.8TCID50/0.1mL, 5 MOI的Herts/33病毒感染HeLa后，在感染后8、12、16、24 h分別收取細胞樣品，同時在每個時間點設(shè)置未感染病毒的處理組。將細胞樣品裂解后與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合后，100℃水浴加熱10 min，進行Western blot檢測，使用針對泛素化蛋白的抗體。結(jié)果在病毒感染早期細胞內(nèi)泛素化蛋白基本沒有變化，感染12～16 h，細胞中的泛素化蛋白水平開始降低，而隨著病毒感染加劇，在感染后24 h細胞基本完全崩解，細胞內(nèi)泛素化蛋白水平也急劇下降（圖1）。

2.2 新城疫病毒感染后蛋白酶體活性檢測通過計算可知，在Herts/33病毒感染后HeLa細胞的蛋白酶體胰凝乳蛋白酶樣（chymotrypsin-like）蛋白水解活性位點活性升高158.17%，胰蛋白酶樣（Trypsinlike）蛋白水解活性位點活性升高56.59% ，半胱天冬酶樣（Caspase-like）蛋白水解活性位點活性升高158.59%。三種蛋白酶體水解位點活性值在抑制劑MG-132處理后都明顯下降，說明該試劑盒可以靈敏檢測到細胞內(nèi)蛋白酶體活性的變化，該試劑盒檢測結(jié)果可信（圖2）。

2.3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)抑制劑最適工作濃度確定采用WST-1方法檢測使用不同濃度的抑制劑MG-132、 Bortezomib、 Lactacystin 、PYR-41時，HeLa細胞的細胞活性，結(jié)果見圖3。當細胞活性不低于80%時的抑制劑濃度即為最適工作濃度，所以最后選擇MG-132的最適工作濃度為0.4 μmol/L，Bortezomib的最適工作濃度為20 nmol/L ，Lactacystin的最適工作濃度為20 μmol/L，PYR-41的最適工作濃度為25 μmol/L。

圖1 新城疫病毒感染對Hela細胞中泛素化蛋白的影響Fig.1 The inf uence of NDV on the ubiquitinated proteins in HeLa cells

2.4 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)抑制劑對病毒增殖情況的影響

2.4.1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)抑制劑對病毒滴度的影響 在用抑制劑預(yù)處理2 h后，使用5 MOI Herts/33感染細胞1 h后洗去，換上含有抑制劑的維持培養(yǎng)基，在病毒感染后第12 h和第24 h收取細胞上清，同時設(shè)置相同稀釋度DMSO處理的對照組，以及只感染病毒的對照組，各上清的TCID50值結(jié)果見表1。在感染后第12 h，MG-132處理組的病毒滴度比其DMSO對照組的滴度降低了100.78，Bortezomib處理組的滴度比其DMSO對照組低100.18, Lactacystin處理組的滴度比其DMSO對照組低100.18，PYR-41處理組的滴度比其DMSO對照組低101.7。在感染后第24 h時，MG-132處理組的病毒滴度比其DMSO對照組低100.37，Bortezomib處理組的滴度比其DMSO對照組低100.08，Lactacystin處理組的滴度比其DMSO對照組低100.09，PYR-41處理組的滴度比其DMSO對照組低101.69。可以看出這四種泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)抑制劑都可以不同程度的抑制HeLa細胞上清中病毒的滴度。

圖2 新城疫病毒對HeLa細胞26 S蛋白酶體三個蛋白水解位點活性的影響

圖3 三種蛋白酶體抑制劑MG-132、Bortezomib、Lactacystin和泛素活化酶E1 抑制劑PYR-41的工作濃度Fig.3 The working concentration of the three kinds of proteasome inhibitor MG - 132, Bortezomib, Lactacystin and E1 ubiquitin activating enzyme inhibitors PYR – 41

表1 四種抑制劑處理后的細胞上清TCID50值Table 1 The TCID value of the cell culture medium with the four kinds of inhibitors

2.4.2 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)抑制劑對病毒生長狀況的影響 細胞接種1 MOI Herts/33，在病毒感染后2、4、6、8、12、24、32、48 h分別收集細胞上清，用TCID50方法測定病毒的滴度。根據(jù)2.4.1的結(jié)果，四種抑制劑都可以抑制HeLa細胞上清中病毒的滴度，所以選取了其中代表性的一種抑制劑MG-132進行生長曲線的測定。0.4 μmol/L MG-132處理組的病毒滴度在早期就比未處理組要低，在12 h以后MG-132處理組的病毒滴度比未處理組明顯降低。以時間的Log2為橫軸，上清中TCID50的對數(shù)為縱軸，繪制出細胞上清中的病毒生長曲線（圖4）。

圖4 MG-132處理細胞后上清中病毒在不同時間的滴度Fig.4 The growth curve of Herts/33 virus in HeLa cells which were treated by MG-132

3 討論

我們已知細胞自身的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是除溶酶體途徑以外的一種重要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，該系統(tǒng)在細胞調(diào)控中發(fā)揮重要作用，包括對各種細胞蛋白進行泛素化修飾（功能性泛素化）和泛素化降解，調(diào)節(jié)細胞中各種功能性蛋白、信號通路的抑制因子和（或）激活因子，使細胞進行有序的生物學活動[14]。病毒作為一類嚴格的細胞內(nèi)寄生的生物，它如何利用宿主細胞的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)為自身的入侵、復(fù)制以及釋放等方面的研究逐漸受到大家的關(guān)注[15,16]。已知信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT可以調(diào)控細胞因子等基因表達，其中STAT1和STAT2蛋白是Ⅰ型和Ⅲ干擾素信號通路中重要的分子，同時也是細胞抗病毒免疫中重要的組成[17]。有研究表明當細胞感染腮腺炎病毒屬中副粘病毒或僅僅轉(zhuǎn)染副粘病毒V蛋白時，STAT1、STAT2和STAT3蛋白可以被快速降解[18]。V蛋白與細胞中成分DDB1和Cul4組成泛素-蛋白連接酶E3，特異性識別STAT蛋白，使其通過蛋白酶體被降解，從而抑制干擾素下游抗病毒蛋白的表達，進而有利于病毒復(fù)制。這些結(jié)果在副流感病毒、腮腺炎病毒和猿猴病毒5等中均有報道[19-21]。NDV屬于副粘病毒屬，其V蛋白是否也可以與細胞成分構(gòu)成復(fù)合物起到E3的作用還未有相關(guān)報道，所以本研究根據(jù)其他副粘病毒的研究推測新城疫病毒在細胞上的增殖也需要泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的參與。

本研究通過使用泛素單抗發(fā)現(xiàn)當感染新城疫病毒后HeLa細胞內(nèi)的泛素化蛋白在感染后期逐漸減少。我們已知26S蛋白酶體由20S核心復(fù)合物和19S調(diào)節(jié)復(fù)合物組成。20S核心復(fù)合物為桶狀結(jié)構(gòu)由兩個α外環(huán)和兩個β內(nèi)環(huán)構(gòu)成，兩個β內(nèi)環(huán)組成降解催化腔，含有三種蛋白酶底物降解催化位點：胰凝乳蛋白酶樣活性位點、胰蛋白酶樣活性位點和半胱天冬酶樣活性位點[22]。所以同時我們又使用試劑盒檢測病毒感染之后的細胞中26S蛋白酶體三個蛋白水解位點的活性變化。結(jié)果顯示感染NDV之后三個蛋白水解位點的活性都顯著升高，可以說明宿主細胞內(nèi)的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)比感染病毒之前更為活躍。綜合上述實驗我們確定細胞自身的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與了新城疫病毒的感染過程。

為了進一步確定試驗結(jié)果，我們使用三種蛋白酶體抑制劑MG-132、Lactacystin、Bortezomib以及泛素活化酶E1抑制劑PYR-41。蛋白酶體抑制劑通過抑制26S蛋白酶體的活性來阻斷泛素化的靶蛋白被降解；而PYR-41則是從源頭上抑制靶蛋白被泛素化進而抑制其K63與K48型泛素化。除了抑制劑Bortezomib毒性較大不適宜在HeLa細胞上進行實驗外，其他三種抑制劑都不同程度的抑制了NDV在HeLa細胞上的增殖。因為泛素活化酶E1抑制劑PYR-41可從源頭上切斷泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的功能，所以對病毒的復(fù)制抑制作用較其他抑制劑更明顯。這表明NDV感染后不僅需要對諸如天然免疫系統(tǒng)中的信號分子進行降解以利于病毒復(fù)制，可能也需要其他一些細胞蛋白的功能性泛素化參與病毒復(fù)制。說明NDV在HeLa細胞內(nèi)的復(fù)制與細胞自身的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)關(guān)系密切。

本文確定NDV感染HeLa后，細胞中的泛素化蛋白量減少，而26S蛋白酶體活性大大增加，進而通過加入抑制劑實驗確定NDV在HeLa細胞中增殖過程與細胞的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)關(guān)系密切。這一研究結(jié)果將加深對病毒與宿主細胞互作過程的認識，從新的角度解釋NDV的致病機理，將對發(fā)現(xiàn)新型抗NDV病毒藥物起一定作用。

[1] 蔡寶祥. 家畜傳染病學[M]. 4版. 北京∶ 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001∶ 304-309.

[2] Usoff K Y, An W S T. Newcastle disease virus∶macromolecules and opportunities [J]. Avian Pathol, 2001, 30(5)∶ 439-455.

[3] Glickman M H, Ciechanover A. The Ubiquitinproteasome proteolytic pathway∶ destruction for the sake of construction[J]. Physiol Rev, 2002, 82(2)∶ 373-428.

[4] 吳慧娟, 張志剛. 泛素-蛋白酶體途徑及意義[J]. 國際病理科學與臨床雜志, 2006, 26(1)∶ 7-10.

[5] Delboy M G, Roller D G, Nicola A V. Cellular proteasome activity facilitates herpes Simplex virus entry at a postpenetration step [J]. J Virol, 2008, 82(7)∶ 3381-3390.

[6] Khor R, McElroy L J, Whittaker G R. The ubiquitinvacuolar protein sorting system is selectively required during entry of influenza virus into host cells [J]. Traffic, 2003, 4(12)∶ 857-868.

[7] Wang Y E, Park A, Pentecost M L,et al. Ubiquitinregulated nuclear-cytoplasmic trafficking of the Nipah virus matrix protein is important for viral budding[J]. PLoS Pathog, 2010, 6(11)∶ 1-17.

[8] Yu G, Lai M M C. The Ubiquitin-Proteasome system facilitates the transfer of murine Cornavirus from endosome to cytoplasm during virus entry [J]. J Virol, 2005, 79(1)∶ 644-648.

[9] Neznanov N, Dragunsky E M, Chumakov K M,et al. Different effect of proteasome inhibition on vesicular stomatitis virusand poliovirus replication [J]. PLoS ONE, 2008, 3(4)∶ 1-12.

[10] Schubert U, Ott D E, Chertova E N,et al. Proteasome inhibition interferes with Gag polyprotein processing, release, and maturation of HIV-1 and HIV-2[J]. Proc Natl Acad Sci U S, 2000, 97(24)∶ 13057-13062.

[11] Fernandez-Garcia M, Meertens L, Bonazzi M,et al. Appraising the roles of CBLL1 and the ubiquitin/proteasome system for flavivirus entry and replication [J]. J Virol, 2011, 85(6)∶ 2980-2989.

[12] Ngamwongsatit P, Banada P P, Panbangred W,et al.WST-1-based cell cytotoxicity assay as a substitute for MTT-based assay for rapid detection of toxigenic Bacillus species using CHO cell line[J]. J Microbiol Methods, 2008, 73(3)∶ 211-215.

[13] Widjaja I, Vries E D, Tscherne D M,et al. Inhibition of the Ubiquitin-Proteasome system affects Influenza A virus infection at a postfusion step [J]. J Virol, 2010, 84(18)∶ 9625-9631.

[14] 趙天鎖, 任賀, 郝繼輝. 泛素-蛋白酶體通路的研究進展[J]. 山東醫(yī)藥, 2009, 49(32)∶ 113-114.

[15] Gao G, Luo H. The Ubiquitin-proteasome pathway in viral infections [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2006, 84(1)∶5-14.

[16] Harrison M S, Schmitt P T, Pei Z,et al. Role of ubiquitin in Parainfluenza virus 5 particle formation [J]. J Virol, 2012, 86(7)∶ 3474-3485.

[17] AuYeung N, Mandhana R, Horvath C M. Transcriptional regulation by STAT1 and STAT2 in the interferon JAKSTAT pathway[J]. JAK-STAT, 2013, 2(3)∶ 1-8.

[18] Ulane C M, Kentsis A, Cruz C D,et al. Composition and assembly of STAT-Targeting ubiquitin ligase complexes∶ Paramyxovirus V protein carboxyl terminus is an oligomerization domain [J]. J J Virol, 2005, 79(16)∶10180-10189.

[19] Andrejeva J, Poole E, Young D F,et al. The p127 Subunit (DDB1) of the UV-DNA damage repair binding protein is essential for the targeted degradation of stat1 by the v protein of the Paramyxovirus simian virus 5 [J]. J Virol, 2002, 76(22)∶ 11379-11386.

[20] Ulane C M, Horvath C M. Paramyxoviruses SV5 and HPIV2 assemble STAT Protein ubiquitin ligase complexes from cellular components [J]. Virology, 2002, 304(2)∶ 160-166.

[21] Ulane C M, Rodriguez J J, Parisien J,et al. STAT3 ubiquitylation and degradation by Mumps virus suppress cytokine and oncogene signaling [J]. J Virol, 2003, 77(11)∶ 6385-6393.

[22] 邱小波, 王琛, 王琳芳. 泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解[M]. 北京∶ 中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社, 2008∶ 315-318.

EFFECT OF UBIQUITIN-PROTEASOME SYSTEM ON NEWCASTLE DISEASE VIRUS REPLICATION IN HELA CELLS

QU Yu-rong, ZHAN Yuan, QIU Xu-sheng, TAN Lei, SUN Ying-jie, SONG Cui-ping, DING Chan
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The objective of the present study was to examine the effect of cellular ubiquitin-proteasome system on Newcastle disease virus (NDV) replication in Hela cells. To determine whether ubiquitin-proteasome system was activated in NDV infected HeLa cells, cellular samples were taken at indicated times for Western blot and for measurement of chymotrypsin-, trypsin- and caspase-like activities. Additionally, NDV infected HeLa cells were treated with different inhibitors of ubiquitin-proteasome system and virus titers (TCID50) in culture supernatants were determined. A significant increase in 26S proteasome activity was observed after NDV infection while ubiquitinated proteins decreased. The application of inhibitors signif cantly reduced NDV production and delayed viral propagation. In conclusion, ubiquitin-proteasome system plays a critical role in NDV replication in HeLa cells.

Newcastle disease virus; ubiquitin-proteasome system; proteasome inhibitor; replication

S852.659.5

A

1674-6422（2014）02-0013-07

2014-01-28

863計劃項目（2011AA10A209）；國家自然科學基金項目（31101822）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費（201303033）

曲昱蓉，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學專業(yè)

丁鏟，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn