山菊降壓片中生決明子代替炒決明子有效成分變化

張 杰， 張振秋， 米寶麗， 曲 園（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 遼寧 大連 116600）

［飲片炮制］

山菊降壓片中生決明子代替炒決明子有效成分變化

張 杰， 張振秋*， 米寶麗， 曲 園（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 遼寧 大連 116600）

目的 用高效液相色譜法研究山菊降壓片 (山楂、菊花、鹽澤瀉、夏枯草、小薊、炒決明子) 中生決明子代替炒決明子后綠原酸、木犀草苷、橙黃決明素、黃決明素、決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等8個成分含有量的變化。 方法 采用 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱 (4.6mm×250mm， 5 μm) ， 體積流量 1.0mL/min， 柱溫為30 ℃。流動相Ⅰ為乙腈-0.1%磷酸溶液， 梯度洗脫， 檢測波長為 348 nm， 測定綠原酸、 木犀草苷的量。 流動相Ⅱ為乙腈-0.1%磷酸溶液， 梯度洗脫， 檢測波長為 284 nm， 測定橙黃決明素、 黃決明素、 決明素、 大黃素、 大黃酚、 大黃素甲醚的量。結(jié)果 本方法所測定的8個成分的進樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，山菊降壓片中生決明子代替炒決明子后， 上述 8 個成分都有不同程度的降低， 其中大黃酚、 大黃素甲醚分別降低了 2 倍、 2.8 倍。 結(jié)論 山菊降壓片中使用炒決明子較為合理。

山菊降壓片；決明子；生熟互換；高效液相色譜法

山菊降壓片由山楂、菊花、鹽澤瀉、夏枯草、小薊、炒決明子六味藥組成，具有平肝潛陽的功能，用于陰虛陽亢所致的頭痛眩暈、耳鳴健忘、腰膝酸軟、五心煩熱、心悸失眠；高血壓病見上述證候者［1］。 《中國藥典》 2010 年版規(guī)定本方以炒決明子中大黃酚的量為質(zhì)控指標，不足以全面控制該藥的內(nèi)在質(zhì)量［1］。 另外， 文獻報道該藥多為測定酸水解后大黃酚的量［2-3］。 決明子是衛(wèi)生部頒 布的藥食同源的藥材， 《中國藥典》 2010 年版規(guī)定的決明子飲片有生決明和炒決明子，具有降血壓、降血脂、 保肝等藥 效［1，4-12］。 綠原 酸 是 山楂、 菊 花、 夏枯草、小薊共有的活性成分，具有明顯的降壓作用， 而 且 療 效 平 穩(wěn)、 無 毒、 無 副 作 用［13-14］； 木 犀草苷對高血壓及心腦血管疾病的治療均有一定的作用［15-16］； 橙 黃 決 明 素、 黃 決 明 素、 決 明 素、 大 黃素、大黃酚、大黃素甲醚是決明子降壓的主要活性成分［4］。 為了更好地控制本藥質(zhì)量， 本研究對該藥上述成分進行了測定。目前，決明子生炒品無論是單方還是在復(fù)方中都沒有得到合理應(yīng)用，在臨床應(yīng)用中存在混用的情況，缺乏明確的規(guī)范。本研究利用高效液相色譜法研究山菊降壓片中生熟決明子互換后上述8個指標性成分量的變化，為決明子在復(fù)方中合理利用以及山菊降壓片的質(zhì)控提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1100 型高效液相色譜儀， 配置四元梯度泵、 在線脫氣機、 VWD檢測器； sartorius CP225D十萬分之一電子天平 ( 德國)， AR2140 OHAVSAdventure分析天平。

1.2 試 劑 與 藥 品 綠 原 酸 (a，批 號 110752-200212)、 木犀草苷 (b， 批號 11720-201106)、 大黃素 (f， 批 號 110757-200206)、 大 黃 酚 (g， 批 號110796-201017)、 大 黃 素 甲 醚 (h，批 號 110758-201013) 均購買于中國食品藥品檢定研究院， 供含量測定用。 橙黃決明素 (c， 批號 20120514)、 黃決明素 (d， 批 號 20120419) 和 決 明 素 (e， 批 號20120419) 均購于上海永恒生物科技有限公司，純度均大于98%。 本研究所用的決明子產(chǎn)地為河北保定，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為豆科植物決明 Cassia obtusifolia L.或小決明 Cassia tora L.的干燥成熟種子。山菊降壓片 (炒決明子)、 新山菊降壓片 (生決明子) 和炒決明子均為本室依法［1］自制得到 (生、 炒決明子為同一來源)。 乙腈為 HPLC級(OCEANPAK ALEXATIVE CHEMICAL)， 甲醇為 色譜純 (西隴化工股份有限公司)， 磷酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、 木犀草苷、橙黃決明素、黃決明素、決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚適量，分別加甲醇制成綠原酸為 153.2 μg/mL、 木犀草苷為 140.4 μg/mL、 橙黃決 明 素 為 228.8 μg/mL、 黃 決 明 素 為 112.8 μg/mL、 決明素為 120.4 μg/mL、大黃素為 50.40 μg/m L、 大黃酚為 149.6 μg/m L、 大黃素甲醚為51.60 μg/m L的單一對照品貯備液， 備用。 精密量取綠原酸、木犀草苷、橙黃決明素、黃決明素、決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品貯備液適量，用甲醇稀釋，制成每 1 mL分別含綠原酸、木犀草苷為 76.60、 56.16 μg/mL的混合對照品溶液Ⅰ以及每1 mL分別含橙黃決明素、 黃決明素、決明素、 大黃素、 大黃酚、 大黃素甲醚為 6.656、14.19、 4.625、 4.766、 1.613、 10.47、 5.934 μg/mL的混合對照品溶液Ⅱ。

2.2 供試品溶液的制備 取山菊降壓片的干膏，約3 g， 精密稱定， 置圓底燒瓶中， 精密加入甲醇50 mL， 稱定質(zhì)量， 加熱回流 1 h， 放至室溫， 再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜 (0.45 μm) 濾過， 即得。

2.3 陰性液的制備 按工藝方法制備同時缺山楂、菊花、夏枯草、小薊的陰性樣品Ⅰ和缺決明子的陰性樣品Ⅱ， 按 “2.2” 項下方法操作， 分別制成陰性樣品溶液Ⅰ和陰性樣品溶液Ⅱ。

2.4 色譜條件

2.4.1 色譜條件Ⅰ (分析綠原酸， 木犀草苷)

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)； 流動相為乙腈 (A)-0.1% 磷酸水溶液(B)， 梯度洗脫 ［0 min，A-B(10 ∶90)； 11 min，A-B(18 ∶82)］； 檢測波長為 348 nm， 體積流量為1.0 mL/min， 柱溫為 30 ℃， 進樣量為20 μL。 對照品及樣品色譜圖見圖1。

2.4.2 色譜條件Ⅱ (分析橙黃決明素， 黃決明素，決明素， 大黃素， 大黃酚， 大黃素甲醚) Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)；流動相為乙腈 (A)-0.1%磷酸水溶液 (B)， 梯度洗脫 (0 min， 26%A； 17 min，42%A；32 min，53%A； 40 min， 63%A)； 檢測波長為 284 nm， 體積流量為 1.0 m L/min， 柱 溫為 30 ℃， 進樣量為20 μL。對照品與樣品的色譜圖見圖 1。

圖1 混合對照品、 樣品和陰性樣品 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of m ixed reference substances， sam p le and negative sam p le

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 專屬性考察 精密吸取混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ、 供試品溶液及陰性溶液Ⅰ和Ⅱ各 20μL， 分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由圖1可見，在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品具有相同保留時間的色譜峰，而相應(yīng)的陰性液在相應(yīng)保留時間處無干擾。

2.5.2 標準曲線與線性范圍 精密吸取混合對照品Ⅰ和Ⅱ各 2、 5、 10、 15、 20 μL， 分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ依次進樣，測定峰面積。以對照品進樣量(μg) 為橫坐標， 以峰面積為縱坐標， 繪制標準曲線，結(jié)果見表1。

表 1 8個成分的標準曲線方程、 相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab.1 Regression equations， correlation cofficients， and linear ranges of eight constituen ts

2.5.3 精密度試驗 精密吸取山菊降壓片 (批號為 20130113) 樣品的供試品溶液 20 μL， 分別在色譜條件Ⅰ和Ⅱ下連續(xù)進樣 6 次， 記錄峰面積。 a、b、 c、 d、 e、 f、 g、 h 的 RSD(n=6) 分 別 為0.26%、 0.19%、 0.59%、 0.56%、 0.88%、0.84%、 0.83%、 0.99%， 表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取山菊降壓片 (批號為 20130113) 樣品的供試品溶液 20 μL，室溫下分別于 0、 2、 4、 6、 12、 24 h 進樣測定， a、 b、 c、d、e、f、 g、h 峰 面 積的 RSD(n=6) 分 別 為0.32%、 0.31%、0.89%、 1.2%、 0.9%、 1.6%、1.1%、 1.3%， 表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗 取同一山菊降壓片 (批號為20130113) 的干膏粉末約 3 g， 共 6 份， 精密稱定，按 “2.2” 項下方法制備供試品溶液， 分別在色譜條件Ⅰ和Ⅱ下進樣20 μL， 記錄峰面積， 計算各成分量及 RSD。a、b、c、d、 e、f、 g、 h 的平均含有量 (n=6) 分 別 為 0.24、 0.14、 0.030、0.010、0.010、 0.003 7、 0.025、 0.012 mg/片， RSD分別為 0.24%、 0.11%、 1.9%、 0.44%、 0.78%、1.6%、 0.31%、 1.6%。

2.5.6 加樣回收率試驗 取 “2.5.5” 項下已測定的山菊降壓片 (批號為 20130113) 樣品 6 份，每份各取約 1.5 g干膏粉末， 精密稱定。 分別精密加入 a、 b、 c、 d、 e、 f、 g、 h 的對照 品 貯 備 液7.60、 4.8、 0.63、 0.45、 0.38、 0.35、 0.81、1.15 m L， 按 “2.2” 項下方法制備供試品溶液，分別在色譜條件Ⅰ和Ⅱ下進樣 20 μL， 計算回收率。 結(jié)果 a、 b、 c、d、e、 f、g、 h 的平均回收率(n=6) 分 別 為 100.2%、 100.9%、 98.6%、99.8%、 101.6%、 102.4%、 99.7%、 101.1%。RSD 分 別 為 1.0%、 1.0%、 2.0%、 1.9%、1.3%、 0.9%、 1.2%、 1.8%。 見表 2。

表2 8個成分回收率考察Tab.2 Results of recovery tests for eight constituents

2.5.7 樣品測定 取 3 批自制山菊降壓片 (批號為 20130113、 20130114、 20130115) 和新 山菊降壓片 ( 批 號 為 20130124、 20130125、 20130126) (0.3 g/片) 樣品溶液， 依法進樣測定，計算各成分的量， 結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 供試品溶液處理方法的考察 曾比較了超聲、回流2種提取方式及甲醇、乙醇2種提取溶劑，結(jié)果表明甲醇回流提取效率最高。比較用甲醇回流1、 2 h的提取效率， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流 1 h已提取完全，故選用甲醇回流1 h提取。本方法采用甲醇回流直接測定樣品中游離的橙黃決明素、黃決明素、決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚成分的量，較酸水解法操作簡單、經(jīng)濟、安全。由于綠原酸易分解，實驗操作中均采用避光操作。

3.2 測定方法的選擇 曾摸索過同時測定綠原酸、木犀草苷、橙黃決明素、黃決明素、決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚成分的量， 由于 《中國藥典》 2010 年版規(guī)定山菊降壓片為水提， 供試品溶液中大極性成分比較多，而且上述8個成分極性差距比較大，所以利用多指標成分測定的方法，測定所述8種成分。

3.3 成分分析 本實驗將 《中國藥典》2010 年版收載的山菊降壓片處方中規(guī)定的炒決明子互換成生決明子，依法自制得山菊降壓片 (炒決明子) 和新山菊降壓片 (決明子)， 比較生炒決明子互換后，處方中綠原酸、木犀草苷、橙黃決明素、黃決明素、決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含有量差異，其中橙黃決明素、黃決明素、決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為決明子中的成分，綠原酸、木犀草苷為處方中其他藥中含有的主要成分。比較測定結(jié)果可看出，生炒決明子互換后，山菊降壓片中橙黃決明素、黃決明素、決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的量均比新山菊降壓片中相應(yīng)的成分量高，其中大黃酚、大黃素甲醚差異最明顯 (山菊降壓片中大黃酚、 大黃素甲醚比新山菊降壓片分別高 2 倍、 2.8 倍左右)， 可能是決明子經(jīng)過炮制相應(yīng)的苷在高溫炮制時被破壞成游離形式釋放出來，此結(jié)果與文獻報道相符。另外山菊降壓片中綠原酸、木犀草苷的量均比新山菊降壓片中相應(yīng)成分量高，結(jié)合中藥理論知識，可能是炒決明子有助于方中其他藥的有效成分溶出，起到提高藥效的作用。綜上所述，山菊降壓片中使用炒決明子是合理的，但建議在臨床上進一步研究加以確證。本實驗為研究生、炒決明子在處方中的合理應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

表 3 山菊降壓片中 8 個成分測定結(jié)果 （mg·片-1， n=3）Tab.3 Contents of eight constituents in Shanju Jiangya Tablets（ mg·片-1， n=3）

3.4 小結(jié) 本實驗采用山菊降壓方中山楂、 菊花、夏枯草和小薊中含有的綠原酸、菊花中含有的木犀草苷，決明子中含有的橙黃決明素、黃決明素、決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為指標進行測定，結(jié)果顯示該法具有操作簡便、測定結(jié)果準確、重復(fù)性好、特征性強的特點，能有效控制該藥的質(zhì)量。

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Content changes of stir-frying Cassiae Semen rep lacement w ith raw one in Shanju Jiangya Tablets

ZHANG Jie， ZHANG Zhen-qiu*， MIBao-li， QU Yuan
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China)

AIM To study content changes of chlorogenic acid， luteoloside， aurantio-obtusin，chryso-obtusin， obtusin， emodin， physcion， and chrysophanol in Shanju Jiangya Tablets when fried Cassiae Semen was replaced by raw Cassiae Semen by HPLC.METHODS The sampleswere separated on an Agilent ZORBAX SB-C18column(4.6 mm×250 mm， 5 μm)column at a flow rate of 1.0 mL/min and the column temperature was at room temperature.Themobile phaseⅠwas acetonitrile-0.1%phosphoric acid aqueous for determination of chlorogenic acid and luteoloside with gradient elution， and detection wavelength was 348 nm.The mobile phaseⅡ was acetonitrile-0.1%phosphoric acid aqueous for determination of aurantio-obtusin， chryso-obtusin， obtusin， emodin， physcion， and chrysophanolwith gradient elution， and detection wavelength was 284 nm.RESULTS Eight determined constituents had a good linear relationship between content of each constituent and peak area.Eight constituents were degraded to some degrees when fried Cassiae Semen was replaced by raw Cassiae Semen.Chrysophanol and physcion were reduced by 2 fold， respectively.CONCLUSION Using fried Cassiae Semen in Shanju Jiangya Tablets ismore reasonable.

Shanju Jiangya Tablets； Cassiae Semen； swap for raw and processed product；HPLC

R284.1

:A

:1001-1528(2014)02-0348-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.029

2013-04-15

國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項 (20110700703)

張 杰 (1987—) ， 男， 碩士生， 研究方向: 藥物分析。 E-mail:13478536926@163.com

*通信作者: 張振秋 (1964—) ， 男， 教授， 博士生導(dǎo)師， 研究方向: 中藥質(zhì)量標準。 Tel:(0411)87586058， E-mail:zhangzhenqiu@ sina.com