金黃膏中小檗堿體外透皮吸收研究

劉俊紅， 王 紅， 曲鵬飛， 李棣華， 郭 林， 呂沅珊

（1.天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所， 天津 300100； 2.天津市中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 天津 300150）

金黃膏中小檗堿體外透皮吸收研究

劉俊紅1， 王 紅2*， 曲鵬飛2， 李棣華1， 郭 林2， 呂沅珊1

（1.天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所， 天津 300100； 2.天津市中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 天津 300150）

目的 篩選金黃膏中小檗堿體外透皮吸收試驗(yàn)的接受液并建立分析方法，探討金黃膏中其他藥味對(duì)小檗堿透皮效果的影響，進(jìn)一步探討其透皮系統(tǒng)。方法 采用體外經(jīng)皮滲透法，使用透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀，選擇大鼠腹部皮膚為滲透屏障， 以不同溶媒系統(tǒng)作為接受液， 用 HPLC測(cè)定接受液中小檗堿的量。 考察全方及某些藥味缺方中小檗堿的透皮特性。 結(jié)果 選用 30%乙醇/磷酸鹽緩沖溶液 （pH 6.8） 為接受液， 建立金黃膏透皮吸收試驗(yàn)中小檗堿的測(cè)定方法。 無論全方還是缺味方， 小檗堿透過率都較低。 缺味方 （Ⅴ） 和 （Ⅵ） 的穩(wěn)態(tài)透皮速率、 透皮時(shí)滯及32 h 內(nèi)小檗堿單位面積累積透過量都較全方高。 有天南星、 陳皮、 厚樸的缺味方 （Ⅴ） 的透皮時(shí)滯低于缺味方 （Ⅵ）。 結(jié)論 金黃膏中的小檗堿經(jīng)皮滲透緩慢，同時(shí)受復(fù)方中其他藥味的影響，其中天南星、陳皮、厚樸起一定的促進(jìn)作用，姜黃、白芷起一定的抑制作用。

金黃膏；小檗堿；高效液相色譜法；透皮吸收；透皮系統(tǒng)

如意金黃散出自明代陳實(shí)功［1］編著的 《 外科正宗》，由大黃、 黃柏、姜黃、白芷、 天花粉、 天南星等組成， 為 2010 年版 《中國(guó)藥典》 （一部）收錄的品種，具有活血散瘀、消腫止痛之功效，臨床用于治療瘡瘍腫痛、丹毒流注、跌打損傷等證［2］。 金黃膏是由如意金黃散經(jīng)改變劑型而制備的外用膏劑，作為醫(yī)院制劑應(yīng)用于臨床多年，療效確切。方中大黃、黃柏具有清熱解毒燥濕的作用，為君藥，本實(shí)驗(yàn)以黃柏中小檗堿為指標(biāo)成分，進(jìn)行了鹽酸小檗堿透皮吸收的方法學(xué)研究，考察了全方及缺味方膏劑中鹽酸小檗堿的體外經(jīng)皮滲透行為，并探討其它藥味對(duì)其透皮效果的影響。

1 材料

TK-12B型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀 （上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）， SSIPC2000 型高效液相色譜儀 （美國(guó)科學(xué)系統(tǒng)公司），EZChrom Elite Client/Server色譜工作站， AL104 電子天平 （梅特勒-托利多儀器有限公司）。 鹽酸小檗堿對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢 定 所， 批 號(hào) 110713—200911， 供 含 量 測(cè) 定用），金黃膏及缺味膏劑 （天津市中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供）。 甲醇、 乙腈為色譜純 （天津市康科德科技有限公司）， 磷酸、 磷酸二氫鈉、磷酸 氫 二 鈉 為 分 析 純。 雄性 wistar大 鼠 （200 ～250 g） （由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證SCXK-（軍） 2009-003）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Apollo C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相 A相為乙腈， B相為 0.1%磷酸水， 采用二元梯度洗脫程序 （見表 1），體積流量 1.0 m L/min， 進(jìn) 樣 量 為 20 μL， 檢測(cè) 波 長(zhǎng) 346 nm， 柱溫 30 ℃。 該色譜條件下， 理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算不低于150 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradien t elu tion mode

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定鹽酸小檗堿，加入量瓶， 用乙腈配制成質(zhì)量濃度為 0.290 mg/mL的溶液，作為貯備液。

2.3 篩選接收液最大溶解度［3］前期已經(jīng)做過鹽酸小檗堿的線性考察及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)，在此不贅述。將鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液2 m L置錐形瓶中減壓濃縮至干，加入不同的接收液1 mL超聲處理使其充分溶解，配制成過飽和溶液，稀釋一定倍數(shù)， 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過， 進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算結(jié)果見表 2。 確定選用接受液 30%乙醇/生理鹽水（Ⅰ）、 30%乙醇/水 （Ⅱ）、 30%乙醇/磷酸鹽緩沖溶液 （pH=6.8） （Ⅲ），再分別對(duì)其做體外透皮試驗(yàn)，選擇適宜的接受液。

表 2 鹽酸小檗堿在不同接收液中的最大溶解度 （mg/m L， n=3）Tab.2 Maxima solubility of berberine hydrochloride in different accePted solutions（ mg/m L， n=3）

2.4 供試膏劑中藥組成及供試液的制備 全方（Ⅳ） 組成為大黃、 黃柏、 姜黃、 白芷、 天花粉、天南星、陳皮、甘草、蒼術(shù)、厚樸；缺味方 （Ⅴ）為大黃、黃柏、天花粉、天南星、陳皮、甘草、蒼術(shù)、厚樸；缺味方 （Ⅵ） 為大黃、黃柏、天花粉、甘草、蒼術(shù)。3組分別制成供試膏劑。由體外透皮試驗(yàn)所得接受液， 加入梨形蒸餾瓶， 分別于70℃水浴減壓濃縮至干，精密吸取 1 mL乙腈溶解，0.45 μm微孔濾膜， 作為供試液。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取一定量鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液加入梨形蒸餾瓶，分別加入不同接受液 （Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ） 8 mL， 按 “2.4” 項(xiàng)下配制供試液，再分別吸取不同體積溶液注入色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定。以各體積溶液對(duì)照品峰面積積分值 （Y， mAu） 對(duì)進(jìn)樣量 （X， ng） 進(jìn)行線性回歸，各接受液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表3。結(jié)果顯示，不同接受液中，鹽酸小檗堿線性良好。

表3 3種接受液的回歸方程Tab.3 Regression equations of three kinds of accePted solu tions

2.6 透皮吸收試驗(yàn)

2.6.1 鼠皮的制備 取健康雄性大鼠， 將大鼠麻醉后固定四肢，剪去腹部正中線兩側(cè)的鼠毛，再用電動(dòng)剃須刀剃凈絨毛后迅速剝皮，小心剔除皮下脂肪及組織，用濾紙擦拭干凈，得離體鼠皮，放入冰箱 （ -20 ℃） 冷凍保存。

2.6.2 滲透擴(kuò)散裝置及試驗(yàn)方法 將鼠皮從冰箱取出，放至室溫，在接收池中放入磁力攪拌子，將鼠皮固定于擴(kuò)散池與接收池之間，真皮面向接收池。試驗(yàn)時(shí)，將精密稱量的膏劑涂于處理好的鼠皮角質(zhì)層，注滿接收液，液面恰與皮膚真皮層接觸，排除氣泡。開動(dòng)磁力攪拌器和恒溫水浴，磁力攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為 400 r/min， 水浴溫度 （ 37 ±0.5） ℃， 擴(kuò)散池容積6 mL， 擴(kuò)散面積為 2.92 cm2。 于32 h 內(nèi)分段取樣，補(bǔ)充相應(yīng)的空白接受液， 按 “2.4” 項(xiàng)下方法配制供試液，根據(jù)濃度吸取不同體積溶液注入色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定小檗堿量，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2.6.3 不同接受液對(duì)小檗堿體外經(jīng)皮滲透行為的影響 分別以 30%乙醇/生理鹽水 （Ⅰ）、 30%乙醇/水 （ Ⅱ ）、 30% 乙 醇/磷 酸 鹽 緩 沖 溶 液（pH6.8） （Ⅲ） 為接受液， 按 “2.6.2” 項(xiàng)下方法試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)得到不同接受液不同時(shí)間段小檗堿的單位面積平均累積透過量 Q。以時(shí)間 t為橫坐標(biāo)， Q為縱坐標(biāo)， 繪制經(jīng)皮滲透曲線， 見圖1。 計(jì)算不同接受液的透皮速率常數(shù) J（μg·cm-2·h-1） 和透皮時(shí)滯 （h）， 經(jīng)皮滲透曲線及參數(shù)見表 4。 結(jié)果30%乙醇/磷酸鹽緩沖溶液 （pH6.8） 的透皮速率常數(shù) J最大， 32 h 單位面積累積透過量 Q最多，透皮時(shí)滯 Tlag最短， 因此確定選做透皮實(shí)驗(yàn) 的接受液，進(jìn)行下一步方法學(xué)考察。

表 4 不同接受液中小檗堿經(jīng)皮滲透曲線及參數(shù) （n=3）Tab.4 Percutaneous Permeation curve and Parameters of berberine in different accePted solutions（ n=3）

圖 1 3 種接受液經(jīng)皮滲透-時(shí)間曲線Fig.1 Transdermal delivery-tim e cu rve of three kinds of accePted solutions

2.6.4 精密度考察 取 “2.5” 項(xiàng)下制備的含有對(duì)照品的 30%乙醇/磷酸鹽緩沖溶液 （ pH6.8），按高、中、低3種質(zhì)量濃度分別連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，將所得峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 分別為 1.46%、 1.86%、 2.47%。 表明精密度符合要求。

2.6.5 穩(wěn)定性考察 將 “2.5” 項(xiàng)下制備的含有對(duì)照品的 30%乙醇/磷酸鹽緩沖溶液 （ pH6.8），在48 h內(nèi)不同的時(shí)間間隔進(jìn)樣測(cè)定， 將所得峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)， RSD為 1.21%，表明鹽酸小檗堿溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 按金黃膏處方， 除去黃柏，其它藥味用基質(zhì)制備陰性對(duì)照藥膏。按“2.6.2” 項(xiàng)操作， 間隔取樣， 將接受液混合， 作為空白接受液備用。 將對(duì)照品貯備液10 μL加入空白接受液6份，同前方法制備樣品，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果平均回收率為 98.5%， RSD為 1.65%。

2.6.7 全方及缺味方膏劑中鹽酸小檗堿的體外經(jīng)皮滲透行為 將全方 （Ⅳ） 及缺味方 （Ⅴ）、（Ⅵ） 藥膏分別作透皮吸收試驗(yàn)， 所加藥膏量根據(jù)鹽酸小檗堿量確定，確保其基本一致。按“2.6.2” 項(xiàng)下方法試驗(yàn)，按下式計(jì)算不同膏劑不同時(shí)間段鹽酸小檗堿的單位面積平均累積透過量Q及32 h 內(nèi)小檗堿累積透過百分率 Q%。

式中 Q為 t時(shí)刻的累積透過量 （μg/cm2）； （Mn為第 n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物透過量 （μg）； ∑Mp為之 前 測(cè) 得 的 藥 物 透 過 量 之 和 （μg）； A（2.92cm2） 為皮膚擴(kuò)散面積。 以時(shí)間 t為橫坐標(biāo)，累積滲透量Q為縱坐標(biāo)，繪制經(jīng)皮滲透曲線。以Q對(duì) t進(jìn)行回歸得線性方程，根據(jù)方程可以求出穩(wěn)態(tài)透皮速率 J（ μg· cm-2· h-1） 和透 皮 時(shí) 滯 Tlag（h）， 結(jié)果見表 5、 圖 2。

3 結(jié)論及討論

3.1 選擇適合的透皮吸收接受液是開展藥物的體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)的重要基礎(chǔ)。接受液應(yīng)具有接受通過皮膚藥物的能力，首先要考慮藥物在其中的溶解度，還要考慮皮膚內(nèi)外環(huán)境的特殊性。鹽酸小檗堿在水中溶解度小，使用低濃度乙醇既可以改善其溶解性，同時(shí)可使角質(zhì)層膨脹疏松，增加皮膚的通透性［4］，還可以起到防腐的作用。鹽酸小檗堿在 pH6～pH8 的磷酸鹽緩沖液中的溶解度變化較小， 比水的溶解度高［5］， 因此再加上磷酸鹽緩沖溶液控制酸堿度。 根據(jù)結(jié)果， 最終選擇 30%乙醇-磷酸鹽緩沖溶液即可。

表 5 經(jīng)皮滲透線性方程及參數(shù) （n=3）Tab.5 Percutaneous Permeation regression equations and Parameters of berberine in three kinds of cream （n=3）

圖 2 3 種膏劑的經(jīng)皮滲透-時(shí)間曲線Fig.2 Transdermal delivery-time curve of three kinds of cream

3.2 從 3 種膏劑的回歸方程及經(jīng)皮滲透-時(shí)間曲線可以看出，鹽酸小檗堿呈一勻速釋放過程，其動(dòng)力學(xué)特征符合 Fick 擴(kuò)散規(guī)律。

3.3 在做透皮試驗(yàn)之前， 已經(jīng)測(cè)定全方及缺味方中鹽酸小檗堿的量，以保證透皮試驗(yàn)所加藥物中小檗堿含有量基本一致。從結(jié)果來看，無論全方還是缺味方，小檗堿透過率都很低。藥物的透皮吸收過程分為3個(gè)階段：藥物從基質(zhì)中釋放、藥物穿透角質(zhì)層屏障、 藥物通過表皮和真皮被血管吸收［6］。 原因分析有以下幾點(diǎn)： （1） 從第一階段 “藥物從基質(zhì)中釋放”分析，由于金黃膏是復(fù)方制劑，全方藥味達(dá)10味， 而且由于外用制劑載藥量的限制，所以每單味藥的量相對(duì)較少，皮膚內(nèi)外不能形成較大的濃度差，向體內(nèi)的滲透速率會(huì)緩慢；由于直接用藥材粉末，而非提取物或藥物成分，活性成分需要先經(jīng)過從細(xì)胞中擴(kuò)散到皮膚表面的過程，延緩了擴(kuò)散速度；另外，金黃膏基質(zhì)主要為脂溶性的蜂蠟，對(duì)小檗堿的釋放和經(jīng)皮擴(kuò)散有一定限速影響；（2） 從后兩個(gè)階段分析， 小檗堿為季銨型生物堿，脂溶性差，而小檗堿在自然界多以季銨鹽的形式存在，水溶解度也偏低，溶解度成為其吸收過程的限速因素，通過角質(zhì)層脂質(zhì)雙分子層的滲透能力受到限制；也有可能與皮膚蛋白質(zhì)或脂質(zhì)等形成可逆性結(jié)合，結(jié)合作用延長(zhǎng)藥物透過的時(shí)間。而全方的穩(wěn)態(tài)透皮速率及透皮時(shí)滯都低于缺味方，說明全方較快達(dá)到穩(wěn)態(tài)之后緩慢滲透。 缺味方 （Ⅴ） 和 （Ⅵ）的穩(wěn)態(tài)透皮速率及32 h內(nèi)鹽酸小檗堿累積透過量差別不大，有天南星、陳皮、厚樸的缺味方 （Ⅴ）透皮時(shí)滯低于缺味方 （Ⅵ）， 說明初始天南星、 陳皮、厚樸對(duì)小檗堿的皮膚滲透有一定促進(jìn)作用，隨后會(huì)受到姜黃、白芷的抑制作用。

3.4 現(xiàn) 在多 有 制 成 乳 膏 劑［7］、 巴 布 劑［8-9］、 貼 膏劑［10-11］等，基質(zhì) 不 同， 透 皮 效 果 也 各 有 差 異， 但只要與臨床適應(yīng)癥相適宜就可。 王紅［12］曾對(duì)如意金黃散 （膏） 中藥味之間的關(guān)系， 從中藥藥性及中醫(yī)藥理論方面分析，對(duì)起透皮作用的藥物是哪幾味藥提出過自己的假設(shè)， 認(rèn)為 （1） 金黃膏可能取配伍中苦寒之用佐以辛溫之藥達(dá)到溫散走竄的促滲作用， 亦或天南星。 （2） 合理的配伍， 既能達(dá)到治病作用又能滲透入內(nèi)，從局部影響全身的作用呢？即整體就是其透皮系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)即是從通過體外透皮試驗(yàn)方面加以驗(yàn)證探討。一般的透皮給藥系統(tǒng)，是指藥物以一定的速率透過皮膚，經(jīng)毛細(xì)血管吸收進(jìn)入全身血液循環(huán)達(dá)到有效濃度，產(chǎn)生療效，起到全身治療作用。還有一種情況，有些藥物與角質(zhì)層親和力大或能與角質(zhì)層發(fā)生特異結(jié)合，在皮膚內(nèi)積聚儲(chǔ)存， 形成 “儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)”， 慢慢向皮膚深部擴(kuò)散。其主要起到局部的藥理作用，而減弱了全身的治療作用。金黃膏作為醫(yī)院制劑應(yīng)用于臨床多年，療效確切。如果小檗堿也有這樣的可能性，大部分滯留在皮膚，達(dá)到抑菌消炎的作用，一部分透過皮膚起到全身治療作用，正好與金黃膏的適應(yīng)癥相吻合。金黃膏藥味較多，而每味藥的化學(xué)成分種類繁多，既有水溶性成分又有脂溶性成分，性質(zhì)各異，它組成一個(gè)整體的透皮系統(tǒng)，每種藥味、每種成分都各負(fù)其責(zé)，又相互影響，相互協(xié)同，符合傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的整體觀念。

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M ethodology of Percutaneous absorPtion in vitro of berberine and effects of other herbs from Jinhuang Cream

LIU Jun-hong1， WANG Hong2*， QU Peng-fei2， LIDi-hua1， GUO Lin2， LüYuan-shan1
（1.Tianjin Institute of Acute Abdomen in Integrated TraditionalChineseandWestern Medicine， Tianjin 300100， China； 2.The Second Hospital Affiliated to Tianjin University of Traditional ChineseMedicin， Tianjin 300150， China）

Jinhuang Cream； berberine；HPLC； percutaneous absorption； transdermal system

R940

： A

： 1001-1528（2014）01-0065-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.016

2013-03-16

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目 （81072818）

劉俊紅 （1968—） ， 女， 副研究員， 從事中藥藥學(xué)研究。 Tel： （022） 27435360 E-mail： nlnbq@sina.cn

*通信作者： 王 紅， 男， 主任醫(yī)師。 Tel： （022） 60335404， E-mail： ctwanghong@sina.com