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    金黃膏中小檗堿體外透皮吸收研究

    2014-04-11 09:19:53劉俊紅曲鵬飛李棣華呂沅珊
    中成藥 2014年1期
    關(guān)鍵詞:全方膏劑透皮

    劉俊紅, 王 紅, 曲鵬飛, 李棣華, 郭 林, 呂沅珊

    (1.天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所, 天津 300100; 2.天津市中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 天津 300150)

    金黃膏中小檗堿體外透皮吸收研究

    劉俊紅1, 王 紅2*, 曲鵬飛2, 李棣華1, 郭 林2, 呂沅珊1

    (1.天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所, 天津 300100; 2.天津市中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 天津 300150)

    目的 篩選金黃膏中小檗堿體外透皮吸收試驗(yàn)的接受液并建立分析方法,探討金黃膏中其他藥味對(duì)小檗堿透皮效果的影響,進(jìn)一步探討其透皮系統(tǒng)。方法 采用體外經(jīng)皮滲透法,使用透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀,選擇大鼠腹部皮膚為滲透屏障, 以不同溶媒系統(tǒng)作為接受液, 用 HPLC測(cè)定接受液中小檗堿的量。 考察全方及某些藥味缺方中小檗堿的透皮特性。 結(jié)果 選用 30%乙醇/磷酸鹽緩沖溶液 (pH 6.8) 為接受液, 建立金黃膏透皮吸收試驗(yàn)中小檗堿的測(cè)定方法。 無論全方還是缺味方, 小檗堿透過率都較低。 缺味方 (Ⅴ) 和 (Ⅵ) 的穩(wěn)態(tài)透皮速率、 透皮時(shí)滯及32 h 內(nèi)小檗堿單位面積累積透過量都較全方高。 有天南星、 陳皮、 厚樸的缺味方 (Ⅴ) 的透皮時(shí)滯低于缺味方 (Ⅵ)。 結(jié)論 金黃膏中的小檗堿經(jīng)皮滲透緩慢,同時(shí)受復(fù)方中其他藥味的影響,其中天南星、陳皮、厚樸起一定的促進(jìn)作用,姜黃、白芷起一定的抑制作用。

    金黃膏;小檗堿;高效液相色譜法;透皮吸收;透皮系統(tǒng)

    如意金黃散出自明代陳實(shí)功[1]編著的 《 外科正宗》,由大黃、 黃柏、姜黃、白芷、 天花粉、 天南星等組成, 為 2010 年版 《中國(guó)藥典》 (一部)收錄的品種,具有活血散瘀、消腫止痛之功效,臨床用于治療瘡瘍腫痛、丹毒流注、跌打損傷等證[2]。 金黃膏是由如意金黃散經(jīng)改變劑型而制備的外用膏劑,作為醫(yī)院制劑應(yīng)用于臨床多年,療效確切。方中大黃、黃柏具有清熱解毒燥濕的作用,為君藥,本實(shí)驗(yàn)以黃柏中小檗堿為指標(biāo)成分,進(jìn)行了鹽酸小檗堿透皮吸收的方法學(xué)研究,考察了全方及缺味方膏劑中鹽酸小檗堿的體外經(jīng)皮滲透行為,并探討其它藥味對(duì)其透皮效果的影響。

    1 材料

    TK-12B型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀 (上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司), SSIPC2000 型高效液相色譜儀 (美國(guó)科學(xué)系統(tǒng)公司),EZChrom Elite Client/Server色譜工作站, AL104 電子天平 (梅特勒-托利多儀器有限公司)。 鹽酸小檗堿對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢 定 所, 批 號(hào) 110713—200911, 供 含 量 測(cè) 定用),金黃膏及缺味膏劑 (天津市中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供)。 甲醇、 乙腈為色譜純 (天津市康科德科技有限公司), 磷酸、 磷酸二氫鈉、磷酸 氫 二 鈉 為 分 析 純。 雄性 wistar大 鼠 (200 ~250 g) (由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,合格證SCXK-(軍) 2009-003)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件 Apollo C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相 A相為乙腈, B相為 0.1%磷酸水, 采用二元梯度洗脫程序 (見表 1),體積流量 1.0 m L/min, 進(jìn) 樣 量 為 20 μL, 檢測(cè) 波 長(zhǎng) 346 nm, 柱溫 30 ℃。 該色譜條件下, 理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算不低于150 000。

    表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradien t elu tion mode

    2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定鹽酸小檗堿,加入量瓶, 用乙腈配制成質(zhì)量濃度為 0.290 mg/mL的溶液,作為貯備液。

    2.3 篩選接收液最大溶解度[3]前期已經(jīng)做過鹽酸小檗堿的線性考察及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn),在此不贅述。將鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液2 m L置錐形瓶中減壓濃縮至干,加入不同的接收液1 mL超聲處理使其充分溶解,配制成過飽和溶液,稀釋一定倍數(shù), 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過, 進(jìn)樣測(cè)定, 計(jì)算結(jié)果見表 2。 確定選用接受液 30%乙醇/生理鹽水(Ⅰ)、 30%乙醇/水 (Ⅱ)、 30%乙醇/磷酸鹽緩沖溶液 (pH=6.8) (Ⅲ),再分別對(duì)其做體外透皮試驗(yàn),選擇適宜的接受液。

    表 2 鹽酸小檗堿在不同接收液中的最大溶解度 (mg/m L, n=3)Tab.2 Maxima solubility of berberine hydrochloride in different accePted solutions( mg/m L, n=3)

    2.4 供試膏劑中藥組成及供試液的制備 全方(Ⅳ) 組成為大黃、 黃柏、 姜黃、 白芷、 天花粉、天南星、陳皮、甘草、蒼術(shù)、厚樸;缺味方 (Ⅴ)為大黃、黃柏、天花粉、天南星、陳皮、甘草、蒼術(shù)、厚樸;缺味方 (Ⅵ) 為大黃、黃柏、天花粉、甘草、蒼術(shù)。3組分別制成供試膏劑。由體外透皮試驗(yàn)所得接受液, 加入梨形蒸餾瓶, 分別于70℃水浴減壓濃縮至干,精密吸取 1 mL乙腈溶解,0.45 μm微孔濾膜, 作為供試液。

    2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取一定量鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液加入梨形蒸餾瓶,分別加入不同接受液 (Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ) 8 mL, 按 “2.4” 項(xiàng)下配制供試液,再分別吸取不同體積溶液注入色譜儀,按照上述色譜條件測(cè)定。以各體積溶液對(duì)照品峰面積積分值 (Y, mAu) 對(duì)進(jìn)樣量 (X, ng) 進(jìn)行線性回歸,各接受液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表3。結(jié)果顯示,不同接受液中,鹽酸小檗堿線性良好。

    表3 3種接受液的回歸方程Tab.3 Regression equations of three kinds of accePted solu tions

    2.6 透皮吸收試驗(yàn)

    2.6.1 鼠皮的制備 取健康雄性大鼠, 將大鼠麻醉后固定四肢,剪去腹部正中線兩側(cè)的鼠毛,再用電動(dòng)剃須刀剃凈絨毛后迅速剝皮,小心剔除皮下脂肪及組織,用濾紙擦拭干凈,得離體鼠皮,放入冰箱 ( -20 ℃) 冷凍保存。

    2.6.2 滲透擴(kuò)散裝置及試驗(yàn)方法 將鼠皮從冰箱取出,放至室溫,在接收池中放入磁力攪拌子,將鼠皮固定于擴(kuò)散池與接收池之間,真皮面向接收池。試驗(yàn)時(shí),將精密稱量的膏劑涂于處理好的鼠皮角質(zhì)層,注滿接收液,液面恰與皮膚真皮層接觸,排除氣泡。開動(dòng)磁力攪拌器和恒溫水浴,磁力攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為 400 r/min, 水浴溫度 ( 37 ±0.5) ℃, 擴(kuò)散池容積6 mL, 擴(kuò)散面積為 2.92 cm2。 于32 h 內(nèi)分段取樣,補(bǔ)充相應(yīng)的空白接受液, 按 “2.4” 項(xiàng)下方法配制供試液,根據(jù)濃度吸取不同體積溶液注入色譜儀,按照上述色譜條件測(cè)定小檗堿量,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

    2.6.3 不同接受液對(duì)小檗堿體外經(jīng)皮滲透行為的影響 分別以 30%乙醇/生理鹽水 (Ⅰ)、 30%乙醇/水 ( Ⅱ )、 30% 乙 醇/磷 酸 鹽 緩 沖 溶 液(pH6.8) (Ⅲ) 為接受液, 按 “2.6.2” 項(xiàng)下方法試驗(yàn),統(tǒng)計(jì)得到不同接受液不同時(shí)間段小檗堿的單位面積平均累積透過量 Q。以時(shí)間 t為橫坐標(biāo), Q為縱坐標(biāo), 繪制經(jīng)皮滲透曲線, 見圖1。 計(jì)算不同接受液的透皮速率常數(shù) J(μg·cm-2·h-1) 和透皮時(shí)滯 (h), 經(jīng)皮滲透曲線及參數(shù)見表 4。 結(jié)果30%乙醇/磷酸鹽緩沖溶液 (pH6.8) 的透皮速率常數(shù) J最大, 32 h 單位面積累積透過量 Q最多,透皮時(shí)滯 Tlag最短, 因此確定選做透皮實(shí)驗(yàn) 的接受液,進(jìn)行下一步方法學(xué)考察。

    表 4 不同接受液中小檗堿經(jīng)皮滲透曲線及參數(shù) (n=3)Tab.4 Percutaneous Permeation curve and Parameters of berberine in different accePted solutions( n=3)

    圖 1 3 種接受液經(jīng)皮滲透-時(shí)間曲線Fig.1 Transdermal delivery-tim e cu rve of three kinds of accePted solutions

    2.6.4 精密度考察 取 “2.5” 項(xiàng)下制備的含有對(duì)照品的 30%乙醇/磷酸鹽緩沖溶液 ( pH6.8),按高、中、低3種質(zhì)量濃度分別連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次,將所得峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì),得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 分別為 1.46%、 1.86%、 2.47%。 表明精密度符合要求。

    2.6.5 穩(wěn)定性考察 將 “2.5” 項(xiàng)下制備的含有對(duì)照品的 30%乙醇/磷酸鹽緩沖溶液 ( pH6.8),在48 h內(nèi)不同的時(shí)間間隔進(jìn)樣測(cè)定, 將所得峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì), RSD為 1.21%,表明鹽酸小檗堿溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 按金黃膏處方, 除去黃柏,其它藥味用基質(zhì)制備陰性對(duì)照藥膏。按“2.6.2” 項(xiàng)操作, 間隔取樣, 將接受液混合, 作為空白接受液備用。 將對(duì)照品貯備液10 μL加入空白接受液6份,同前方法制備樣品,進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果平均回收率為 98.5%, RSD為 1.65%。

    2.6.7 全方及缺味方膏劑中鹽酸小檗堿的體外經(jīng)皮滲透行為 將全方 (Ⅳ) 及缺味方 (Ⅴ)、(Ⅵ) 藥膏分別作透皮吸收試驗(yàn), 所加藥膏量根據(jù)鹽酸小檗堿量確定,確保其基本一致。按“2.6.2” 項(xiàng)下方法試驗(yàn),按下式計(jì)算不同膏劑不同時(shí)間段鹽酸小檗堿的單位面積平均累積透過量Q及32 h 內(nèi)小檗堿累積透過百分率 Q%。

    式中 Q為 t時(shí)刻的累積透過量 (μg/cm2); (Mn為第 n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物透過量 (μg); ∑Mp為之 前 測(cè) 得 的 藥 物 透 過 量 之 和 (μg); A(2.92cm2) 為皮膚擴(kuò)散面積。 以時(shí)間 t為橫坐標(biāo),累積滲透量Q為縱坐標(biāo),繪制經(jīng)皮滲透曲線。以Q對(duì) t進(jìn)行回歸得線性方程,根據(jù)方程可以求出穩(wěn)態(tài)透皮速率 J( μg· cm-2· h-1) 和透 皮 時(shí) 滯 Tlag(h), 結(jié)果見表 5、 圖 2。

    3 結(jié)論及討論

    3.1 選擇適合的透皮吸收接受液是開展藥物的體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)的重要基礎(chǔ)。接受液應(yīng)具有接受通過皮膚藥物的能力,首先要考慮藥物在其中的溶解度,還要考慮皮膚內(nèi)外環(huán)境的特殊性。鹽酸小檗堿在水中溶解度小,使用低濃度乙醇既可以改善其溶解性,同時(shí)可使角質(zhì)層膨脹疏松,增加皮膚的通透性[4],還可以起到防腐的作用。鹽酸小檗堿在 pH6~pH8 的磷酸鹽緩沖液中的溶解度變化較小, 比水的溶解度高[5], 因此再加上磷酸鹽緩沖溶液控制酸堿度。 根據(jù)結(jié)果, 最終選擇 30%乙醇-磷酸鹽緩沖溶液即可。

    表 5 經(jīng)皮滲透線性方程及參數(shù) (n=3)Tab.5 Percutaneous Permeation regression equations and Parameters of berberine in three kinds of cream (n=3)

    圖 2 3 種膏劑的經(jīng)皮滲透-時(shí)間曲線Fig.2 Transdermal delivery-time curve of three kinds of cream

    3.2 從 3 種膏劑的回歸方程及經(jīng)皮滲透-時(shí)間曲線可以看出,鹽酸小檗堿呈一勻速釋放過程,其動(dòng)力學(xué)特征符合 Fick 擴(kuò)散規(guī)律。

    3.3 在做透皮試驗(yàn)之前, 已經(jīng)測(cè)定全方及缺味方中鹽酸小檗堿的量,以保證透皮試驗(yàn)所加藥物中小檗堿含有量基本一致。從結(jié)果來看,無論全方還是缺味方,小檗堿透過率都很低。藥物的透皮吸收過程分為3個(gè)階段:藥物從基質(zhì)中釋放、藥物穿透角質(zhì)層屏障、 藥物通過表皮和真皮被血管吸收[6]。 原因分析有以下幾點(diǎn): (1) 從第一階段 “藥物從基質(zhì)中釋放”分析,由于金黃膏是復(fù)方制劑,全方藥味達(dá)10味, 而且由于外用制劑載藥量的限制,所以每單味藥的量相對(duì)較少,皮膚內(nèi)外不能形成較大的濃度差,向體內(nèi)的滲透速率會(huì)緩慢;由于直接用藥材粉末,而非提取物或藥物成分,活性成分需要先經(jīng)過從細(xì)胞中擴(kuò)散到皮膚表面的過程,延緩了擴(kuò)散速度;另外,金黃膏基質(zhì)主要為脂溶性的蜂蠟,對(duì)小檗堿的釋放和經(jīng)皮擴(kuò)散有一定限速影響;(2) 從后兩個(gè)階段分析, 小檗堿為季銨型生物堿,脂溶性差,而小檗堿在自然界多以季銨鹽的形式存在,水溶解度也偏低,溶解度成為其吸收過程的限速因素,通過角質(zhì)層脂質(zhì)雙分子層的滲透能力受到限制;也有可能與皮膚蛋白質(zhì)或脂質(zhì)等形成可逆性結(jié)合,結(jié)合作用延長(zhǎng)藥物透過的時(shí)間。而全方的穩(wěn)態(tài)透皮速率及透皮時(shí)滯都低于缺味方,說明全方較快達(dá)到穩(wěn)態(tài)之后緩慢滲透。 缺味方 (Ⅴ) 和 (Ⅵ)的穩(wěn)態(tài)透皮速率及32 h內(nèi)鹽酸小檗堿累積透過量差別不大,有天南星、陳皮、厚樸的缺味方 (Ⅴ)透皮時(shí)滯低于缺味方 (Ⅵ), 說明初始天南星、 陳皮、厚樸對(duì)小檗堿的皮膚滲透有一定促進(jìn)作用,隨后會(huì)受到姜黃、白芷的抑制作用。

    3.4 現(xiàn) 在多 有 制 成 乳 膏 劑[7]、 巴 布 劑[8-9]、 貼 膏劑[10-11]等,基質(zhì) 不 同, 透 皮 效 果 也 各 有 差 異, 但只要與臨床適應(yīng)癥相適宜就可。 王紅[12]曾對(duì)如意金黃散 (膏) 中藥味之間的關(guān)系, 從中藥藥性及中醫(yī)藥理論方面分析,對(duì)起透皮作用的藥物是哪幾味藥提出過自己的假設(shè), 認(rèn)為 (1) 金黃膏可能取配伍中苦寒之用佐以辛溫之藥達(dá)到溫散走竄的促滲作用, 亦或天南星。 (2) 合理的配伍, 既能達(dá)到治病作用又能滲透入內(nèi),從局部影響全身的作用呢?即整體就是其透皮系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)即是從通過體外透皮試驗(yàn)方面加以驗(yàn)證探討。一般的透皮給藥系統(tǒng),是指藥物以一定的速率透過皮膚,經(jīng)毛細(xì)血管吸收進(jìn)入全身血液循環(huán)達(dá)到有效濃度,產(chǎn)生療效,起到全身治療作用。還有一種情況,有些藥物與角質(zhì)層親和力大或能與角質(zhì)層發(fā)生特異結(jié)合,在皮膚內(nèi)積聚儲(chǔ)存, 形成 “儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)”, 慢慢向皮膚深部擴(kuò)散。其主要起到局部的藥理作用,而減弱了全身的治療作用。金黃膏作為醫(yī)院制劑應(yīng)用于臨床多年,療效確切。如果小檗堿也有這樣的可能性,大部分滯留在皮膚,達(dá)到抑菌消炎的作用,一部分透過皮膚起到全身治療作用,正好與金黃膏的適應(yīng)癥相吻合。金黃膏藥味較多,而每味藥的化學(xué)成分種類繁多,既有水溶性成分又有脂溶性成分,性質(zhì)各異,它組成一個(gè)整體的透皮系統(tǒng),每種藥味、每種成分都各負(fù)其責(zé),又相互影響,相互協(xié)同,符合傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的整體觀念。

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    M ethodology of Percutaneous absorPtion in vitro of berberine and effects of other herbs from Jinhuang Cream

    LIU Jun-hong1, WANG Hong2*, QU Peng-fei2, LIDi-hua1, GUO Lin2, LüYuan-shan1
    (1.Tianjin Institute of Acute Abdomen in Integrated TraditionalChineseandWestern Medicine, Tianjin 300100, China; 2.The Second Hospital Affiliated to Tianjin University of Traditional ChineseMedicin, Tianjin 300150, China)

    Jinhuang Cream; berberine;HPLC; percutaneous absorption; transdermal system

    R940

    : A

    : 1001-1528(2014)01-0065-05

    10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.016

    2013-03-16

    國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目 (81072818)

    劉俊紅 (1968—) , 女, 副研究員, 從事中藥藥學(xué)研究。 Tel: (022) 27435360 E-mail: nlnbq@sina.cn

    *通信作者: 王 紅, 男, 主任醫(yī)師。 Tel: (022) 60335404, E-mail: ctwanghong@sina.com

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