丹參酮ⅡA誘導(dǎo)體外胃癌細(xì)胞的自噬

趙雪峰， 魏敬妙， 李 勇*， 張志棟， 賈 楠

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院普外科， 河北 石家莊 050011； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科， 河北 石家莊 050011）

丹參酮ⅡA誘導(dǎo)體外胃癌細(xì)胞的自噬

趙雪峰1， 魏敬妙2， 李 勇1*， 張志棟1， 賈 楠1

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院普外科， 河北 石家莊 050011； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科， 河北 石家莊 050011）

目的 探討丹參酮ⅡA體外對(duì)人胃癌 SGC7901 細(xì)胞自噬的影響， 初步探討其抑制腫瘤的機(jī)制。 方法 MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度 （0.5、 1、 2 和 4 μg/mL） 丹參酮ⅡA作用體外培養(yǎng)的胃癌 SGC7901 細(xì)胞共孵 24、 48、 72 h 后， 細(xì)胞增殖活力的改變； 1、 2 和 4 μg/mL丹參酮ⅡA作用 SGC7901 細(xì)胞 48 h 后， 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞自噬小體的水平； 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR和 Western blot分別測(cè)定自噬相關(guān)蛋白 Beclin 1、 磷酸酯酶與張力蛋白同源物 （ PTEN） 、LC3-Ⅱ和 LC3-I的 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 0.5 μg/mL丹參酮ⅡA對(duì)胃癌 SGC7901 細(xì)胞沒有明顯的生長(zhǎng)抑制作用， 1 μg/mL以上各質(zhì)量濃度丹參酮ⅡA對(duì)胃癌 SGC7901 細(xì)胞則有明顯的生長(zhǎng)抑制作用； 流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示， 與對(duì)照組相比， 丹參酮ⅡA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 （P＜0.05）； 細(xì)胞內(nèi)酸性自噬小體含量增加 （P＜0.05）； 實(shí)時(shí)定量 RTPCR和 Western blot結(jié)果顯示， 與對(duì)照組相比， Beclin-1、 PTEN和 LC3-ⅡmRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸升高， LC3-I表達(dá)下降 （P＜0.05）。 結(jié)論 丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)人胃癌 SGC7901 細(xì)胞自噬， 其機(jī)制可能涉及上調(diào)自噬相關(guān)基因表達(dá)Beclin-1， 促進(jìn)自噬標(biāo)志蛋白 LC3-I向 LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化， 促進(jìn)自噬調(diào)控蛋白 PTEN表達(dá)。

丹參酮ⅡA；胃癌；自噬

KEY WORDS： tanshinoneⅡA； gastric cancer； autophagy

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，“瘀血在經(jīng)絡(luò)臟腑之間，結(jié)為癥瘕 （腫瘤）”， 基于腫瘤與血瘀證的關(guān)系， 臨床常采用丹參、當(dāng)歸、莪術(shù)等活血化瘀藥進(jìn)行抗腫瘤治療， 并取 得了良 好的療效［1］。 丹參 酮 ⅡA （tanshinoneⅡA， Tan ⅡA）是丹參 Salvia miltiorrhiza中提取的重要脂溶性單體成分之一，近年的研究表明，丹參酮ⅡA具有廣泛的抗腫瘤活性，可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、 誘導(dǎo)凋亡和分化［2］。 自噬是細(xì)胞通過溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程。由于多腫瘤細(xì)胞均發(fā)生自噬活性的改變，因此，腫瘤治療中，以自噬為靶標(biāo)的藥物的研發(fā)受到廣泛關(guān)注［3］。 丹參酮ⅡA對(duì)人胃癌細(xì)胞自噬作用的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要通過觀察丹參酮ⅡA對(duì)胃癌 SGC-7901 細(xì)胞自噬的影響， 探討其對(duì)胃癌抑制的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑及主要儀器 SGC-7901 細(xì)胞為人胃癌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)研究院上海細(xì)胞研究所。 胎牛血清、 RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、 胰蛋白酶， 購(gòu)自美國(guó) GIBCO公司； MTT和丹參酮ⅡA（ 純度 ＞99%） 購(gòu) 自 Sigma公 司； 吖 啶 橙 購(gòu) 自Sigma-Aldrich 公司， Beclin 1、磷酸酯酶與張力蛋白同源物 （ PTEN） 、 LC3-Ⅱ、 LC3-I和 β-actin 抗體購(gòu) 自 Santa Cruz公 司； TRIzol試 劑 為 美 國(guó) invitrogen 公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為 Promega公司產(chǎn)品； Real-Time PCR試 劑 盒 為 fermentas公 司 產(chǎn)品； 引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。 Real-Time PCR儀為美國(guó) ABI公司產(chǎn)品； Becton Dickinsor FACscan 流式細(xì)胞儀為美國(guó) BD公司產(chǎn)品； 電泳和 轉(zhuǎn) 膜系 統(tǒng) 為 Bio-Rad 公 司 產(chǎn) 品； PVDF膜 為Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901 細(xì)胞在含有 10%胎牛血清、 100 kU/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 在含 5%CO2、 37 ℃條件下恒溫孵育。 每 3 天用含 0.02%EDTA的 0.25%胰蛋白酶溶液消化以1∶3的比例傳代。

1.3 MTT SGC7901 細(xì)胞以 5 ×103個(gè)/mL密度接種于 96 孔板，于 37 ℃和 5%的 CO2條件下培養(yǎng)24 h后， 用含有不同質(zhì)量濃度的丹參酮ⅡA（0.5、1、 2、 4 μg/mL） 分別處理細(xì)胞 24、 48、 72 h， 對(duì)照組加入 0.1%DMSO。 每組設(shè)置 6 個(gè)復(fù)孔。 各實(shí)驗(yàn)組于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h 加入 20 μL的 MTT（質(zhì)量濃度為 5 mg/mL）， 培養(yǎng) 4 h 后棄去培養(yǎng)液， 加入DMSO 150 μL于室溫振蕩 15 min 使結(jié)晶溶解， 酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)光密度值 （OD值）， 以 OD值表示 SGC7901 細(xì)胞增殖能力。 以上實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.4 AnnexinV/PI流式細(xì)胞分析法檢測(cè)細(xì)胞凋亡5 ×103個(gè)/mL接種于 12 孔板中， 于 37 ℃和 5%的 CO2條件下培養(yǎng)24 h 后， 加入不同質(zhì)量濃度的丹參酮ⅡA（1、 2 和 4 μg/mL）， 分別處理細(xì)胞 48 h，溶劑對(duì)照加入0.1%DMSO。 收集各組細(xì)胞 （包括培養(yǎng)基中的和貼壁的）， 用冷的 PBS 清洗 1 遍， 每管加入 500 μL結(jié)合緩沖液和 5 μL的 AnnexinV和 PI，室溫避光染色 5 min， 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5 細(xì)胞自噬小體的定量檢測(cè) SGC-7901 細(xì)胞以5 ×103個(gè)/mL接種于 6 孔板， 于 37 ℃和 5%的CO2條件下培養(yǎng) 24 h， 用不同質(zhì)量濃度的丹參酮ⅡA（1、 2 和 4 μg/m L） 分別處理細(xì)胞 48 h， 溶劑對(duì)照加入 0.1%DMSO，收集各組細(xì)胞， 用吖啶橙 （1 μg/mL） 室溫避光染色 20 min，離心后棄去染液， 用 1 ×PBS 清洗 3 次后， 再用 1 ×PBS 重懸細(xì)胞， 上流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)， FL1 通道檢測(cè)綠色熒光，F(xiàn)L3 通道檢測(cè)紅色熒光，以紅色熒光的強(qiáng)弱反映細(xì)胞內(nèi)酸性自噬小體的多少。

1.6 總 RNA 提取及 Real-Time PCR SGC-7901細(xì)胞以 5 ×103個(gè)/mL接種于 6 孔板， 于 37 ℃和5%的 CO2條件下培養(yǎng)24 h， 用不同質(zhì)量濃度的丹參酮Ⅱ A （1、 2、 4 μg/mL） 作用 SGC7901 細(xì)胞48 h， 溶劑對(duì)照加入 0.1%DMSO， 收集各組細(xì)胞，用 Trizol試劑提取各組細(xì)胞總 RNA， 紫外分光光度儀測(cè)定 RNA濃度及純度， 并經(jīng)電泳鑒定后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 以 cDNA為 模板進(jìn)行 Real-Time PCR 反應(yīng)。以 GAPDH為內(nèi)參照。

Beclin1 基因上游引物 5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3′， 下游引物 5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTG G-3′。 LC3-I上 游 引 物 5′-TCCCGGACCATGTCAACAT-3′； 下 游 引 物 5′-ACCATGCTGTGCTGGTTCAC-3′。 LC3-Ⅱ上游引 物 5′-ACCATGCCGTCGGAGAAG-3′；下游引物 5′-ATCGTTCTATTATCACCGGGATTTT-3′。 PTEN上游引物 5′-TCACCAACTGAAGTGGCTAAAGA-3′； 下游引物 5′-CTCCATTCCCCTAACCCGA-3′。 GAPDH 上 游 引物 5′-GTAAAGACCTCTATGCCATCA-3′； 下 游 引 物 5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′。

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線獲取目的基因和內(nèi)參基 因 的 Ct值， 以 目 的 基 因 Beclin 1、 PTEN、LC3-Ⅱ和 LC3-I表達(dá)的相對(duì)定量值 （RQ值） 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.7 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)分子的蛋白水平SGC-7901 細(xì)胞以 5 ×103密度接種于 6 孔板， 于 37℃和5%的 CO2條件下培養(yǎng)24 h， 用不同質(zhì)量濃度的丹參酮ⅡA（1、 2 和 4 μg/mL） 作用 SGC7901 細(xì)胞 48 h， 溶劑對(duì)照加入 0.1%DMSO，收集各組細(xì)胞， 用 裂 解 緩 沖 液 （50 mmol/L Tris pH 7.2， 1% Triton X-100， 0.5% 脫氧膽酸 鈉， 0.1% 十二烷基硫 酸 鈉 ， 500 mmol/L NaCl， 10 nmol/L MgCl2， 10 mg/mL亮 抑 蛋 白 酶 肽， 10 mg/mL 抑 肽 酶， 1 mmol/L苯甲基磺酰氟） 裂解整個(gè)細(xì)胞， 細(xì)胞總蛋白經(jīng) 10%SDS-PAGE分 離 后 轉(zhuǎn) 到 PVDF膜 上。PVDF膜在5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h， 各目標(biāo)分子特異性一抗4℃過夜，接著，用辣根過氧化酶標(biāo)記的相應(yīng)的二抗室溫孵育 2 h。 ECL法檢測(cè)結(jié)合的目的條帶。 以磷酸生油醛脫氫酶 （GAPDH） 作為內(nèi)參 照， 用 目 的 蛋 白 Beclin 1、PTEN、 LC3-Ⅱ 和LC3-I光密度值/內(nèi)參照光密度值的比值進(jìn)行比較。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以表示， 采用SPSS 13.0 統(tǒng) 計(jì) 分 析 軟 件 進(jìn) 行 單 因 素 方 差 分 析 和Dunnett檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA抑制 SGC7901 細(xì)胞增殖 丹參酮ⅡA（0.5、 1、 2 和 4 μg/m L） 作用 SGC7901 細(xì)胞 24、 48、72 h 后， 與 對(duì) 照 組 相 比， 1、2、4 μg/mL丹參酮ⅡA對(duì)胃癌細(xì)胞以質(zhì)量濃度和時(shí)間依賴的方式抑制細(xì)胞增殖 （P＜0.05）。 結(jié)果見表 1。

2.2 丹參酮ⅡA誘導(dǎo) SGC7901 細(xì)胞凋亡 丹參酮ⅡA （1、 2、 4 μg/mL） 作 用 SGC7901 細(xì) 胞 48 h后，流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比，各質(zhì)量濃度丹參酮ⅡA明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 （P＜0.05）。 結(jié)果見表 2。

表1 丹參酮ⅡA對(duì) SGC7901 細(xì)胞增殖的影響 （， n=6）Tab.1 Effect of TanⅡA to Proliferation for gastric cancer cells line SGC7901 （， n=6）

表1 丹參酮ⅡA對(duì) SGC7901 細(xì)胞增殖的影響 （， n=6）Tab.1 Effect of TanⅡA to Proliferation for gastric cancer cells line SGC7901 （， n=6）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與同組 24 h 比較，#P＜0.05；與同組48 h 比較，ΔP＜0.05

組 別 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 1.02 ±0.18 1.04 ±0.16 1.01 ±0.15 0.5 μg/mL丹參酮 ⅡA 0.94 ±0.16 0.87 ±0.14 0.85 ±0.13 1 μg/mL丹參酮ⅡA 0.77 ±0.13*0.63 ±0.11* 0.56 ±0.07*#2 μg/mL丹參酮ⅡA 0.62 ±0.08*0.52 ±0.06*# 0.44 ±0.06*#Δ4 μg/mL丹參酮ⅡA 0.53 ±0.07*0.42 ±0.06*# 0.32 ±0.05*#Δ

表 2 丹參酮ⅡA對(duì) SGC7901 細(xì)胞細(xì)胞凋亡率、 自噬小體的影響 （， n=6）Tab.2 Effect of TanⅡA to aPoPtosis for gastric cancer cells line SGC7901 （， n=6）

表 2 丹參酮ⅡA對(duì) SGC7901 細(xì)胞細(xì)胞凋亡率、 自噬小體的影響 （， n=6）Tab.2 Effect of TanⅡA to aPoPtosis for gastric cancer cells line SGC7901 （， n=6）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組 別 細(xì)胞凋亡率/% 自噬小體 /%對(duì)照組 2.92 ±0.35 4.16 ±0.64 1 μg/m L丹參酮ⅡA 8.73 ±1.51* 9.77 ±1.92*2 μg/m L丹參酮ⅡA 12.24 ±2.27* 13.28 ±2.95*4 μg/m L丹參酮ⅡA 15.39 ±3.15* 16.54 ±3.28*

2.3 丹參酮ⅡA促進(jìn) SGC7901 細(xì)胞生成酸性自噬小體 與溶劑對(duì)照組酸性自噬小體的比例相比，丹參酮ⅡA組酸性自噬小體的比例明顯增加 （P＜0.05）， 表明丹參酮ⅡA可誘導(dǎo) SGC7901 細(xì)胞自噬。結(jié)果見表2。

2.4 丹參酮ⅡA對(duì) SGC7901 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步觀察丹參酮ⅡA對(duì) SGC7901細(xì)胞自 噬 影響的 機(jī) 制，通過 real-time RT-PCR和Western blot對(duì) 自 噬 相 關(guān) 蛋 白 Beclin-1、 PTEN、LC3-I和 LC3-ⅡmRNA和蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)， 結(jié)果表明， 與對(duì)照組相比， 丹參酮ⅡA作用 SGC7901細(xì)胞 48 h 后， Beclin-1、 PTEN和和蛋白表達(dá)水平逐漸 升 高， LC3-I表 達(dá) 下 降，除 1 μg/mL丹 參酮ⅡA組 LC3-ⅡmRNA外， 其他差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。 結(jié)果見表 3， 表 4， 圖 1。

表 3 丹 參酮ⅡA對(duì) SGC7901 細(xì)胞 Beclin 1、 PTEN、 LC3-Ⅱ 和 LC3-I m RNA的影響 （， n=3）Tab.3 Effect of TanⅡ A to Beclin 1， PTEN， LC3-Ⅱ，LC3-I m RNA in gastric cancer cells line SGC7901（， n=3）

表 3 丹 參酮ⅡA對(duì) SGC7901 細(xì)胞 Beclin 1、 PTEN、 LC3-Ⅱ 和 LC3-I m RNA的影響 （， n=3）Tab.3 Effect of TanⅡ A to Beclin 1， PTEN， LC3-Ⅱ，LC3-I m RNA in gastric cancer cells line SGC7901（， n=3）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組 別 LC3-Ⅰ Beclin-1 PTEN LC3-Ⅱ?qū)φ战M 1.20 ±0.20 1.07 ±0.13 1.07 ±0.14 1.10 ±0.13 1 μg/mL丹參酮ⅡA 0.77 ±0.16*1.64 ±0.20*1.65 ±0.20*1.07 ±0.13 2 μg/mL丹參酮ⅡA 0.53 ±0.16*3.34 ±0.61*3.35 ±0.62*1.82 ±0.32*4 μg/mL丹參酮ⅡA 0.34 ±0.01*4.59 ±0.76*3.72 ±0.78*2.36 ±0.41*

表 4 丹 參酮ⅡA對(duì) SGC7901 細(xì)胞 Beclin 1、 PTEN、 LC3-Ⅱ和 LC3-I 蛋白的影響 （， n=3）Tab.4 Effect of TanⅡ A to Beclin 1， PTEN， LC3-Ⅱ，LC3-I Protein in gastric cancer cells line SGC7901 （， n=3）

表 4 丹 參酮ⅡA對(duì) SGC7901 細(xì)胞 Beclin 1、 PTEN、 LC3-Ⅱ和 LC3-I 蛋白的影響 （， n=3）Tab.4 Effect of TanⅡ A to Beclin 1， PTEN， LC3-Ⅱ，LC3-I Protein in gastric cancer cells line SGC7901 （， n=3）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組 別 LC3-Ⅰ Beclin-1 PTEN LC3-Ⅱ?qū)φ战M 1.12 ±0.16 0.37 ±0.05 0.26 ±0.04 0.31 ±0.03 1 μg/mL丹參酮ⅡA 0.71 ±0.11*0.62 ±0.12*0.55 ±0.08*0.48 ±0.06*2 μg/mL丹參酮ⅡA 0.55 ±0.09*0.71 ±0.11*0.69 ±0.12*0.65 ±0.11*4 μg/mL丹參酮ⅡA 0.44 ±0.01*0.85 ±0.13*0.97 ±0.18*0.86 ±0.14*

圖 1 丹參 酮 ⅡA對(duì) SGC7901 細(xì) 胞 Beclin 1、 PTEN、LC3-Ⅱ和 LC3-I蛋白的影響Fig.1 Effect of TanⅡ A to Beclin 1， PTEN， LC3-Ⅱ ， LC3-I Protein in gastric cancer cells line SGC7901 （， n=3）

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)一些中國(guó)傳統(tǒng)中藥具有明顯的抗腫瘤活性。已有研究證實(shí)，丹參酮ⅡA是具有廣泛抗癌作用的新型抗癌中藥單體，可抑制等多種癌細(xì)胞生長(zhǎng)。丹參酮ⅡA可通過抑制胃癌細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡抑制胃癌生長(zhǎng)［4-5］， 但對(duì)胃癌自噬的影 響未見報(bào)道。自噬對(duì)于細(xì)胞存活而言可謂是把雙刃劍，一方面當(dāng)細(xì)胞在機(jī)體出現(xiàn)感染或者缺氧等應(yīng)激刺激時(shí)，自噬會(huì)保護(hù)細(xì)胞使其存活，如果應(yīng)激持續(xù)時(shí)間太長(zhǎng)，則可出現(xiàn)自噬性細(xì)胞死亡。可見，細(xì)胞發(fā)生自噬有可能促進(jìn)生長(zhǎng)也有可能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，若能有效調(diào)控自噬，將對(duì)癌癥治療和退行性疾病的療效有很大提高［6］。

本實(shí)驗(yàn)首先觀察了丹參酮ⅡA對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901 增殖和凋亡的影響， 與報(bào)道一致， 本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)其凋亡。有報(bào)道表明，某些抗腫瘤藥物在促進(jìn)凋亡的同時(shí)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞自噬［7-8］。 自噬的 重要特征是胞質(zhì)內(nèi) 大量的酸性自噬小體形成，這些酸性自噬小體吞噬了細(xì)胞質(zhì)和 （或） 細(xì)胞器后， 經(jīng)過吖啶橙染色呈現(xiàn)出亮紅色熒光，且熒光強(qiáng)度可反映酸性自噬小體的酸度和 （或） 容積。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光的強(qiáng)度， 初步證實(shí)了丹參酮ⅡA作用 SGC7901細(xì)胞后，細(xì)胞自噬增加。

自噬是受一系列自噬相關(guān)基因調(diào)控的，比如Beclin 1 基因是研究較多的自噬相關(guān)基因， 可通過促進(jìn)自噬抑制腫瘤的生長(zhǎng)，是候選的腫瘤抑制基因［5］。 有研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中 Beclin 1 的陽性表達(dá)率低于正常組織， 且 Beclin 1 的蛋白表達(dá)水平與胃癌分化程度有關(guān)［9］。 最近有人認(rèn)為 Beclin 1 可作為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者生存時(shí)間的預(yù)測(cè)因子［10］。PTEN是已知的抑癌基因， 可使細(xì)胞自噬開啟， 研究表明 PTEN的突變 可 抑制自噬［11-12］； 而且 PTEN的陽性表達(dá)率與胃癌組織的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋 巴 轉(zhuǎn) 移 呈 正 相 關(guān)［6］。 因 此， 認(rèn) 為 Beclin 1 和PTEN高表達(dá)可促進(jìn)胃癌自噬， 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明， 丹參酮ⅡA作用后， Beclin 1 和 PTEN的表達(dá)隨著質(zhì)量濃度增加逐漸升高。

LC3， 即微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3，酵母自噬相關(guān)蛋白8在哺乳動(dòng)物的同源類似物，是目前自噬的唯一標(biāo)志蛋白［13-14］。 LC3 有兩種存在形式： LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ［15］， 自 噬 發(fā) 生 時(shí)， LC3-Ⅰ 可 轉(zhuǎn) 化 形 成LC3-Ⅱ，二者的水平和比值可以反應(yīng)細(xì)胞自噬活性。 通過實(shí)時(shí)定量 PCR和 Western blot分析， 發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA作用后 LC3-ⅡmRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸 升 高， LC3-Ⅰ 表 達(dá) 下 降， 出 現(xiàn) LC3-Ⅰ 向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化， 此結(jié)果提示丹參酮ⅡA可促進(jìn)胃癌自噬，其具體機(jī)制值得進(jìn)一步探索。

綜上所述，丹參酮ⅡA可通過促進(jìn)自噬相關(guān)基因 Beclin 1、 PTEN和 LC3-Ⅱ的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞自噬。然而，由于自噬在腫瘤的作用及機(jī)制還存在較大爭(zhēng)議以及自噬的復(fù)雜性，需要進(jìn)行更深入的研究以明確丹參酮ⅡA對(duì)胃癌自噬的影響。

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TanshinoneⅡA induces autoPhagy of human gastric cancer SGC7901 cells line in vitro

ZHAO Xue-feng1， WEI Jing-miao2， LIYong1*， ZHANG Zhi-dong1， JIA Nan1
（1.Departmentof General Surgery， The Fourth Hospital Affiliated to HebeiMedical University， Shijiazhuang 050011， China； Departmentof Hepatobiliary Surgery， The Fourth Hospital Affiliated to HebeiMedical University， Shijiazhuang 050011， China）

AIM To investigate the effect of tanshinoneⅡ A （ Tan Ⅱ A） on the autophagy of human gastric cancer SGC7901 cells and possible mechanism.M ETHODS SGC7901 cells were cultured in vitro and incubated with different concentrations（0.5， 1， 2， 4 μg/m L） TanⅡA in different time（24， 48， 72 h）.MTT assay was developed to detect the cell proliferation.The cell apoptotic rate and the content of acidic vesicular organelles contentwere detected by flow cytometry in 48 h.The expressions of autophagy-associated protein Beclin 1， phosphatase and tensin homolog（PTEN）， LC3-I and LC3-Ⅱ were detected by real-time RT-PCR and western blot. RESULTS TanⅡA（0.5 μg/mL） had no significant effect on proliferation of SGC7901 cells compared to DMSO group （ P＞0.05 ） .Tan Ⅱ A showed a dose-and time-dependent growth inhibition at the concentration above 1 μg/mL（P＜0.05） .Compared with DMSO group， the cell apoptotic rate and content acid vesicular organelles content increased with the treatment of Tan ⅡA.The results of real-time RT-PCR and western blot showed that compared with DMSO group， the expressions of Beclin 1， PTEN and LC3-Ⅱ were significantly up-regulated aswell as the experssion of LC3-Iwas significantly down-regulated （P＜0.05）.CONCLUSION Tan ⅡA induces the auophagy of human gastric cancer SGC7901 cells in time-and dose-dependentmanner in vitro， whichmay be related to the up-regulation of Beclin 1， PTEN and LC3-Ⅱ， as well as down-regulation of LC3-I.

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0010-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.003

2013-02-18

趙雪峰 （ 1976—）， 男， 副 主 任 醫(yī) 師， 博 士， 從 事 消 化 道 腫 瘤 的 臨 床 與 基 礎(chǔ) 研 究。 Tel： 13933012139， E-mail： xuexuexue1976@126.com

*通信作者： 李 勇 （1958—）， 男， 教授， 主任醫(yī)師， 博士生士師， 博導(dǎo)， 從事消化道腫瘤的臨床與基礎(chǔ)研究。 Tel： 13931116966