鎘通過氧化應(yīng)激機(jī)制誘導(dǎo)LLC—PK1細(xì)胞損傷

方鑫　李海玲　安彩艷

[摘要] 目的 探討鎘誘導(dǎo)豬腎近曲小管上皮細(xì)胞（LLC-PK1）毒性及氧化應(yīng)激在其中的作用。 方法 用不同濃度的氯化鎘刺激細(xì)胞9h和25μmol/L的氯化鎘刺激細(xì)胞不同時(shí)間，采用Formazan 分析細(xì)胞存活率反映鎘對細(xì)胞的損傷程度；以還原型谷胱甘肽（GSH）為靶點(diǎn)，影響GSH濃度的兩個(gè)試劑BSO和NAC，觀察鎘誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中氧化應(yīng)激的作用。 結(jié)果 隨著氯化鎘染毒時(shí)間延長，細(xì)胞存活率下降，同樣，隨著劑量的增加，細(xì)胞的存活率逐漸也下降。同時(shí)BSO加重鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，NAC完全抑制鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。 結(jié)論 氯化鎘對LLC- PK1細(xì)胞具有明顯的毒性，細(xì)胞損傷是通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)，且與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 氯化鎘；豬腎近曲小管上皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激

[中圖分類號] R114 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）03-34-03

鎘是主要重金屬環(huán)境污染物，由于其分布廣泛和較長的生物半衰期（16～33年），導(dǎo)致容易在體內(nèi)肝，腎等重要器官蓄積，從而造成重要器官的損傷，如神經(jīng)退行性病變，肝，肺，腎的功能障礙和血管系統(tǒng)疾病[1-2]。而長期低劑量接觸鎘主要引起以近曲小管損傷為主要特征的腎臟損害[3]。鎘引起腎細(xì)胞損傷是具體通過什么機(jī)制，尚未完全清楚。本研究選用豬腎近曲小管上皮細(xì)胞（LLC-PK1）為實(shí)驗(yàn)對象，觀察了氯化鎘對該細(xì)胞的毒性效應(yīng)，以及誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞損傷中氧化應(yīng)激所起的作用，為進(jìn)一步闡明鎘誘導(dǎo)腎細(xì)胞損傷機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

小牛血清、消化酶、抗體、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、氯化鎘、D-L-丁硫氨酸-[R]-亞砜亞胺（BSO）等化學(xué)試劑均購買于Sigma公司（Tokyo，Japan）。全自酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio-tek，USA），CO2培養(yǎng)箱（Heraeus instruments，Germany）。Olympus IX71型倒置顯微鏡（Olympus，Hachioji-shi，Tokyo，Japan）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

豬的腎小管上皮細(xì)胞系LLC-PK1購自American Type Culture Collection（Rockville，MD）。培養(yǎng)液選用胎牛血清（DMEM/F12）培養(yǎng)基加5%小牛血清和雙抗（青霉素和鏈霉素各100U/mL），于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長約90%傳代，每周傳代2～3次。

1.3 Formazan分析

細(xì)胞活性用CCK-8（Dojindo Laboratory，Kumamoto，Japan）試劑來檢測。CCK-8試劑中含有WST–8：化學(xué)名稱：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

劑量時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系：細(xì)胞以1.5×105的密度鋪于96孔板中，用DMEM/F12培養(yǎng)基加5%小牛血清，放置于37℃、5% CO2中培養(yǎng)箱中48h后，將培養(yǎng)基換成1%的小牛血清，再用氯化鎘刺激。每孔加CdCl2應(yīng)用液10mmol/L使CdCl2終濃度分別為0、5、15、25、50、75μmol/L，培養(yǎng)9h，并以25μmol/L的終濃度對細(xì)胞分別染毒0、1、3、6、9、12h，然后每孔加入10μL CCK-8反應(yīng)1h，再用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（）表示。多組均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P<0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 氯化鎘對LLC-PK1細(xì)胞的毒性作用

采用Formazan分析法測定細(xì)胞的相對活性。觀察指標(biāo)是細(xì)胞的存活率。由表1可見：用CdCl2（25μmol/L）刺激細(xì)胞1h與對照組比較，細(xì)胞存活率沒有差異，3，6，9，12h各組與對照組比較，細(xì)胞存活率逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。由表2可見，用不同濃度的鎘細(xì)胞染毒9h后，5μmol/L的氯化鎘對細(xì)胞有輕度的增殖作用，其細(xì)胞存活率是103.15%，其他劑量組與對照組相比，細(xì)胞存活率均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著CdCl2濃度的增加，其毒性作用逐漸增大，有劑量-反應(yīng)關(guān)系。

2.2 鎘通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞損傷

研究表明大部分鎘誘導(dǎo)細(xì)胞損傷是由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的[4-5]，因此，本實(shí)驗(yàn)檢測鎘誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)。用細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點(diǎn)。結(jié)果如表3所示：細(xì)胞分成兩組，一組對照，一組實(shí)驗(yàn)組加50μmol/L CdCl2培養(yǎng)9h后，用BSO（2.5mmol/L）抑制細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）濃度，處理后實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率為17.53%，明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。相反，用NAC（2.0mmol/L）來增加細(xì)胞內(nèi)GSH濃度，處理后可見實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞存活率沒有差異見表3。

3 討論

鎘是主要的工業(yè)和環(huán)境污染物之一，腎臟是其作用的主要靶器官。本實(shí)驗(yàn)通過Formazan分析法測定細(xì)胞存活率表明鎘對LLC-PK1細(xì)胞的毒性效應(yīng)有良好的劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系可見氯化鎘作用細(xì)胞9h，已呈現(xiàn)明顯的毒性效應(yīng)，細(xì)胞的存活率已下降（63.53%），見表1，隨著CdCl2濃度或時(shí)間的增加，LLC-PK1細(xì)胞的存活率呈明顯下降趨勢。但5μmol/L CdCl2刺激細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞有增殖的現(xiàn)象，這與紀(jì)存委等[6]的報(bào)道鎘對細(xì)胞存在Hormesis效應(yīng)，即在較低濃度時(shí)具有刺激細(xì)胞生長的作用，而高濃度時(shí)則對細(xì)胞有抑制作用，的結(jié)果一致。結(jié)果表明CdCl2對LLC-PK1細(xì)胞毒性有良好的劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。此結(jié)果與任香梅等[7]結(jié)果一致。endprint

Gennari等報(bào)道，鎘可以促進(jìn)氧自由基的形成[3]和降低細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化物質(zhì)-谷胱甘肽（GSH）的濃度[8]，會造成多種細(xì)胞損傷。大多數(shù)毒性作用是由氧化應(yīng)激所介導(dǎo)[9-10]。藍(lán)暉翔等研究表明，氯化鎘、氯化汞單獨(dú)及聯(lián)合染毒L02細(xì)胞可引起顯著的DNA損傷。這可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[11]。環(huán)境污染物，包括工業(yè)和日用化工，農(nóng)藥，化肥，重金屬和電離輻射，重金屬，特別是鎘是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要因素。本實(shí)驗(yàn)檢測鎘誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)。用細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點(diǎn)。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是抗氧化劑、巰基保護(hù)劑，也是一種自由基清除劑，研究也顯示，對急性、亞慢性鎘染毒大鼠肝、腎損傷具有明顯的拮抗和保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同樣，NAC增加細(xì)胞內(nèi)GSH濃度能明顯減輕鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，效果非常明顯，BSO降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度可以加重鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷（表3），此結(jié)果與陽光等[13]研究相同。這說明鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系，但其具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，氯化鎘對LLC-PK1細(xì)胞有明顯毒性，具有很好的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果為今后研究提供理論依據(jù)，但鎘如何影響細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2013-11-06）endprint

Gennari等報(bào)道，鎘可以促進(jìn)氧自由基的形成[3]和降低細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化物質(zhì)-谷胱甘肽（GSH）的濃度[8]，會造成多種細(xì)胞損傷。大多數(shù)毒性作用是由氧化應(yīng)激所介導(dǎo)[9-10]。藍(lán)暉翔等研究表明，氯化鎘、氯化汞單獨(dú)及聯(lián)合染毒L02細(xì)胞可引起顯著的DNA損傷。這可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[11]。環(huán)境污染物，包括工業(yè)和日用化工，農(nóng)藥，化肥，重金屬和電離輻射，重金屬，特別是鎘是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要因素。本實(shí)驗(yàn)檢測鎘誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)。用細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點(diǎn)。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是抗氧化劑、巰基保護(hù)劑，也是一種自由基清除劑，研究也顯示，對急性、亞慢性鎘染毒大鼠肝、腎損傷具有明顯的拮抗和保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同樣，NAC增加細(xì)胞內(nèi)GSH濃度能明顯減輕鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，效果非常明顯，BSO降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度可以加重鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷（表3），此結(jié)果與陽光等[13]研究相同。這說明鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系，但其具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，氯化鎘對LLC-PK1細(xì)胞有明顯毒性，具有很好的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果為今后研究提供理論依據(jù)，但鎘如何影響細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-11-06）endprint

Gennari等報(bào)道，鎘可以促進(jìn)氧自由基的形成[3]和降低細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化物質(zhì)-谷胱甘肽（GSH）的濃度[8]，會造成多種細(xì)胞損傷。大多數(shù)毒性作用是由氧化應(yīng)激所介導(dǎo)[9-10]。藍(lán)暉翔等研究表明，氯化鎘、氯化汞單獨(dú)及聯(lián)合染毒L02細(xì)胞可引起顯著的DNA損傷。這可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[11]。環(huán)境污染物，包括工業(yè)和日用化工，農(nóng)藥，化肥，重金屬和電離輻射，重金屬，特別是鎘是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要因素。本實(shí)驗(yàn)檢測鎘誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)。用細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點(diǎn)。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是抗氧化劑、巰基保護(hù)劑，也是一種自由基清除劑，研究也顯示，對急性、亞慢性鎘染毒大鼠肝、腎損傷具有明顯的拮抗和保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同樣，NAC增加細(xì)胞內(nèi)GSH濃度能明顯減輕鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，效果非常明顯，BSO降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度可以加重鎘導(dǎo)致的細(xì)胞損傷（表3），此結(jié)果與陽光等[13]研究相同。這說明鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系，但其具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，氯化鎘對LLC-PK1細(xì)胞有明顯毒性，具有很好的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)，同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果為今后研究提供理論依據(jù)，但鎘如何影響細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽的水平的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-11-06）endprint