運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在生物煉制中的研究進(jìn)展

何明雄, 吳 波, 譚芙蓉, 王景麗, 稅宗霞, 秦 晗, 代立春, 胡啟春

1.農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所, 生物質(zhì)能技術(shù)研究中心, 成都 610041;

2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610041

當(dāng)前人類社會(huì)發(fā)展迅猛，同時(shí)面臨全球環(huán)境惡化、能源短缺和資源匱乏等三大危機(jī)的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。在這種形勢(shì)下，開發(fā)清潔的可再生能源已成為全球能源與環(huán)境領(lǐng)域的一個(gè)緊迫課題。我國(guó)能源形勢(shì)非常嚴(yán)峻，據(jù)《2013年國(guó)內(nèi)外油氣行業(yè)發(fā)展報(bào)告》(中國(guó)石油集團(tuán)經(jīng)濟(jì)技術(shù)研究院)，2013年中國(guó)原油進(jìn)口量約為2.89億t，中國(guó)對(duì)外原油依存度達(dá)到了58.1%，到2020年中國(guó)石油對(duì)外依存度很有可能上升至66%，解決能源替代問題成為關(guān)乎國(guó)民經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略性問題。

我國(guó)的纖維素類生物質(zhì)原料非常豐富，據(jù)2011年1月21日農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《全國(guó)農(nóng)作物秸稈資源調(diào)查與評(píng)價(jià)報(bào)告》顯示：我國(guó)農(nóng)作物秸稈可收集資源量約為7億t。將這些資源轉(zhuǎn)化為燃料乙醇或其他生物基材料具有很大的潛力。當(dāng)前，以生物能源、生物基產(chǎn)品等為主要內(nèi)容的生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)，不僅是拓展農(nóng)業(yè)功能、促進(jìn)資源利用的戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)，也對(duì)減輕我國(guó)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境污染和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展等具有重要的戰(zhàn)略意義和現(xiàn)實(shí)意義。

雖然國(guó)內(nèi)已經(jīng)在生物質(zhì)能源領(lǐng)域已進(jìn)行了大量的有益探索和嘗試，取得了一些進(jìn)展，研究領(lǐng)域涉及生物質(zhì)資源原料學(xué)(如秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物資源、能源植物等)、預(yù)處理技術(shù)、發(fā)酵過程優(yōu)化與控制、高值化利用技術(shù)(如生物燃?xì)獍l(fā)電、生物燃?xì)廛囉萌剂霞夹g(shù)和車用液體燃料技術(shù)等)及環(huán)保處理技術(shù)(如沼液—沼渣生態(tài)循環(huán)利用模式等)等，初步形成了沼氣化、固體及液體燃料化等能源利用技術(shù)模式。然而在纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料乙醇或其他生物基材料的過程中，尚存在大量未解決的關(guān)鍵科學(xué)問題，尤其是缺乏能夠同時(shí)高效利用纖維素類水解物的發(fā)酵菌株，已成為纖維素生物質(zhì)高效與高值轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵制約因素。

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)是目前唯一一種通過ED(Entner-Doudoroff)途徑厭氧發(fā)酵葡萄糖的微生物，其獨(dú)特的代謝途徑使其成為構(gòu)建產(chǎn)乙醇工程菌的優(yōu)選宿主之一；同時(shí)由于該菌具有較高的糖利用效率等優(yōu)點(diǎn)，也是其他生物基化學(xué)品生產(chǎn)的重要候選平臺(tái)微生物，如山梨醇、葡萄糖酸、丁二酸和異丁醇等。因此本文從運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的研究歷程、分子生物學(xué)基礎(chǔ)、菌種改良及該菌在生物能源及生物基化學(xué)品生物煉制體系中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以闡明該菌可作為纖維素生物質(zhì)生物煉制系統(tǒng)的新的重要平臺(tái)微生物。

1 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的研究歷程

1911年，Barker和Hiller[1]在變質(zhì)的蘋果酒中研究發(fā)現(xiàn)，一種特殊的細(xì)菌與其變質(zhì)有關(guān)；1924年Lindner從龍舌蘭酒中分離得到了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌[2]。20世紀(jì)50年代早期，人們發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在厭氧條件下主要通過ED途徑代謝葡萄糖，它可以發(fā)酵葡萄糖、果糖和蔗糖等六碳糖產(chǎn)乙醇，但不能利用五碳糖生產(chǎn)乙醇。迄今為止，該菌是唯一一種通過ED途徑厭氧發(fā)酵葡萄糖的微生物。自20世紀(jì)初分離得到該菌以來，研究者已在生態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)、菌株選育、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方面做了大量的研究[3～8]。同釀酒酵母相比，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌具有如下優(yōu)點(diǎn)：較高的糖吸收率、較高的乙醇產(chǎn)率、較少的生物量以及較高的乙醇耐受力等。但該菌底物利用范圍過窄，一般野生型菌株只能以葡萄糖、果糖和蔗糖作為生產(chǎn)乙醇的底物，不能將復(fù)雜的碳水化合物代謝為乙醇。為拓寬其底物利用范圍，研究者將其他微生物中相關(guān)的水解酶基因，如阿拉伯糖或者纖維素代謝的相關(guān)基因轉(zhuǎn)移到該菌中，使其具有利用其他底物的能力[9]。隨著2005年該菌全基因組序列的公布[10]和2006年杜邦公司宣布對(duì)該菌進(jìn)行玉米秸稈燃料乙醇的研究[11]，其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景值得我們關(guān)注。

2 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及菌種改良

自20世紀(jì)80年代以來，研究者已就運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的遺傳操作平臺(tái)系統(tǒng)開展了大量的研究[9,12,13]，如野生型質(zhì)粒、廣譜宿主載體、穿梭質(zhì)粒、表達(dá)系統(tǒng)、基因?qū)搿?dòng)子和報(bào)告基因等；同時(shí)在關(guān)鍵基因敲除、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方面也開展了大量研究[14]。目前，已有7株運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株完成了基因組測(cè)序，包括ZM4(ATCC31821)[15]、NCIMB11163[16]、ATCC 10988[17]、ATCC 29191[18]、CP4(NRRL B-14023)[19]、ATCC 29192[20]和ZM401(ATCC 31822)[21]；同時(shí)，還對(duì)不同條件下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了研究，主要包括厭氧和好氧條件[22]、纖維素水解物抑制物(呋喃甲醛)[23]和乙醇[24,25]等。何明雄等[23,24]通過代謝分析及表達(dá)譜芯片等技術(shù)，首次比較了不同生理狀態(tài)下環(huán)境脅迫因子對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的生長(zhǎng)抑制、葡萄糖代謝規(guī)律和基因表達(dá)譜的差異，揭示了這些抑制因子對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌代謝和基因轉(zhuǎn)錄的影響。在呋喃甲醛脅迫情況下，有433個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生了變化，其中上調(diào)表達(dá)的基因216個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因217個(gè)；而在乙醇脅迫情況下，有127個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生了變化，其中上調(diào)表達(dá)的基因89個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因38個(gè)。GO分析表明，這些基因涉及細(xì)胞膜、代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及未知功能等。因此，隨著運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因組序列的測(cè)定、基因注釋的不斷完善及代謝網(wǎng)絡(luò)的日漸清晰，在功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等層次的深入研究，將為理解并運(yùn)用該菌的代謝、基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律并且高效調(diào)控代謝物生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)[10,26]。

此外，構(gòu)建和選育高效且具有高脅迫適應(yīng)能力的發(fā)酵工程菌株是實(shí)現(xiàn)纖維素生物質(zhì)高效和高值轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。目前在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的構(gòu)建和選育等方面，國(guó)內(nèi)外研究者已開展了大量的研究工作，獲得了一些性能改進(jìn)的工程菌株。主要采用的策略包括：傳統(tǒng)的誘變育種[9]、轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)[27～29]、適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)[30,31]和代謝工程技術(shù)等。

3 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生產(chǎn)生物能源及生物基化學(xué)品

3.1運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生產(chǎn)燃料乙醇

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在厭氧條件下主要通過ED途徑代謝葡萄糖，它可以發(fā)酵葡萄糖、果糖和蔗糖等六碳糖產(chǎn)乙醇，但不能利用五碳糖生產(chǎn)乙醇。因此,在1995年以前，利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇的研究主要集中在以甘蔗、糖蜜、淀粉類和葡萄糖等為原料上，國(guó)內(nèi)外研究者進(jìn)行了廣泛而深入的研究和系統(tǒng)評(píng)估，顯示了較高的乙醇產(chǎn)率[2，9，12，13，32～35]。但基于食物安全等考慮，發(fā)展基于纖維素生物質(zhì)為原料的燃料乙醇將是未來發(fā)展的趨勢(shì)[36～38]，為了獲得利用低成本原料(如纖維素、半纖維素和淀粉等)且乙醇產(chǎn)率高的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株，研究者們已將其他微生物中五碳糖代謝途徑相關(guān)基因或水解酶基因等轉(zhuǎn)移到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，拓展該菌的底物利用范圍。這些工作為進(jìn)一步提高運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇生產(chǎn)性能提供了可能，也為未來的研究工作提供了很有益的經(jīng)驗(yàn)。

目前，已構(gòu)建獲得多株具有木糖、阿拉伯糖等五碳糖利用能力的重組菌株，如，Z.mobilisCP4(pZB5)[39]、Z.mobilisCP4(pZB206)[40]、Z.mobilis206C(pZB301)[41]、Z.mobilisAX101[42]和Z.mobilisHYMX[29]等，這些菌株包括質(zhì)粒復(fù)制型或基因組整合型運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌工程菌株。同時(shí)，通過運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌發(fā)酵不同的纖維素生物質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇，如玉米秸稈[43～45]、竹子[46]等，國(guó)內(nèi)外均進(jìn)行了大量的研究，積累了大量的發(fā)酵工藝數(shù)據(jù)，為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌利用纖維素生物質(zhì)水解物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇奠定了基礎(chǔ)。

然而，生產(chǎn)纖維素乙醇需要多個(gè)步驟才能完成，主要包括預(yù)處理、酶解和發(fā)酵等。在預(yù)處理階段，容易形成呋喃甲醛、乙酸等抑制微生物發(fā)酵的物質(zhì)，因此，構(gòu)建和選育具有高脅迫適應(yīng)能力的菌株是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)[23,24,47～49]。目前，已通過基因工程、適應(yīng)性進(jìn)化等方法獲得了一些具有乙酸耐受性的重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，如Z.mobilisZM4/AcR(pZB5)[50]。

另外，由于發(fā)展CBP(consolidated bioprocessing)工藝是降低纖維素乙醇生物轉(zhuǎn)化過程成本的有效手段[51，52]，國(guó)外研究者也嘗試將纖維素水解相關(guān)酶基因直接轉(zhuǎn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，以期獲得具有直接發(fā)酵纖維素生物質(zhì)產(chǎn)乙醇的“超級(jí)工程菌株”，Linger等[53]將來自嗜酸纖維素分解菌(Acidothermuscellulolyticus)的E1和GH12纖維素水解酶基因?qū)脒\(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)；Thirumalai等[54]將來自素食昆蟲消化道的5個(gè)纖維素水解酶基因在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中進(jìn)行表達(dá)，重組菌株能直接利用經(jīng)過預(yù)處理的纖維素原料發(fā)酵產(chǎn)生乙醇；Kojima等[55]也將來自纖維單胞菌(Cellulomonasfimi)的6個(gè)纖維素水解酶基因(CenA，CenB，CenD,CbhA，CbhB和Cex)和來自白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)的2個(gè)纖維素水解酶基因 (cenA，bgl)在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中進(jìn)行表達(dá)。這些研究展示了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌作為一種新型的CBP平臺(tái)微生物在纖維素乙醇生產(chǎn)中的潛力。

3.2運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌聯(lián)產(chǎn)山梨醇和生物酸

2013年，美國(guó)能源部公布了未來12種最具前景的生物煉制產(chǎn)品[56]，包括丁二酸(succinic)、反丁烯二酸(fumaric)、蘋果酸(malic)、2，5-呋喃二羧酸(2，5-furan dicarboxylic acid，F(xiàn)DCA)、3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HPA)、天門冬氨酸(aspartic acid)、谷氨酸(glutamic acid)、葡萄糖二酸(glucaric acid)、衣康酸(itaconic acid)、乙酰丙酸(levulinic acid)、3-羥基-γ-丁內(nèi)酯(3-Hydroxybutyrolactone)，甘油(glycerol)，山梨醇(sorbitol)，木糖醇(xylitol)及阿拉伯糖醇(arabinitol)等。

山梨醇是美國(guó)能源部篩選的12個(gè)最具開發(fā)潛力的生物質(zhì)來源的關(guān)鍵中間體之一，葡萄糖酸是最具開發(fā)潛力的30個(gè)關(guān)鍵中間體之一。從這兩個(gè)關(guān)鍵中間體出發(fā)，可以得到多種在化學(xué)品生產(chǎn)和材料市場(chǎng)上具有廣泛用途的中間產(chǎn)品。

1984年，Barrow等[57]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在以蔗糖、葡萄糖和果糖混合物為碳源時(shí)，其乙醇產(chǎn)率下降；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，乙醇產(chǎn)率下降的原因是由于生成了副產(chǎn)物——山梨醇。隨后，Leigh等[58]提出了山梨醇的合成代謝途徑，Zachariou和Scopes[59]證實(shí)葡萄糖果糖氧化還原酶glucose-fructose oxidoreductase，GFOR) 和葡糖酸內(nèi)酯酶(glucono-σ-gluconase，GL)負(fù)責(zé)山梨醇的生物合成。這些研究表明：運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌可在GFOR的介導(dǎo)下，通過一步酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)山梨醇的生物合成，同時(shí)還可生成葡萄糖酸等副產(chǎn)品?；谶@些研究，國(guó)內(nèi)外研究者發(fā)展了游離酶、全細(xì)胞、滲透化處理細(xì)胞及固定化細(xì)胞等多種山梨醇生產(chǎn)工藝[60，61]。如Chun和Rogers[60]發(fā)展了一種山梨醇聯(lián)產(chǎn)葡萄糖酸的工藝，在以300 g/L葡萄糖和300 g/L果糖為碳源的條件下，利用滲透化處理的細(xì)胞，發(fā)酵15 h后，山梨醇產(chǎn)量可達(dá)290 g/L，葡萄糖酸產(chǎn)量可達(dá)290 g/L，其產(chǎn)率接近理論產(chǎn)率的95%。盡管重組干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)[62]和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)[63]已被應(yīng)用于生物山梨醇的合成研究，但其產(chǎn)率僅為0.65～0.67 mol/mol葡萄糖[64]，較運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌低；運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌具有特殊的山梨醇合成代謝途徑、較高的糖利用效率，并能產(chǎn)生更高價(jià)值的副產(chǎn)物，因此，利用該菌聯(lián)產(chǎn)山梨醇和葡萄糖酸是較具潛力的生物制造過程。但由于野生型菌株中葡萄糖果糖氧化還原酶的活性較低，且受葡萄糖濃度的調(diào)控，為改善山梨醇的合成效率，Liu等[65]利用基因工程技術(shù)，過表達(dá)葡萄糖果糖氧化還原酶，結(jié)合發(fā)酵工藝調(diào)節(jié)，進(jìn)一步改善了山梨醇的產(chǎn)率。

有趣的是，Satory等[66]在研究GFOR的催化底物時(shí)發(fā)現(xiàn)：在果糖存在的條件下，該酶還可利用其他醛糖(aldose sugars)合成相應(yīng)的醛糖酸(aldonic acid)，其轉(zhuǎn)化率依糖的不同可達(dá)9%～84%。這表明有可能利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行其他生物酸的合成，如乳糖酸(lactobionic acid，LBA)、麥芽糖酸(maltobionic)、木質(zhì)酸(xylonic acid)、半乳糖酸(galactonic acid)、阿糖酸(arabinonic acid)、甘露酸(mannonic acid)和纖維素二糖酸(cellobionic acid)等。以乳糖酸為例，由于其在醫(yī)藥、食品和化工等行業(yè)中的廣泛用途，Satory等[66]發(fā)展了一種利用果糖和乳糖混合物轉(zhuǎn)化生成乳糖酸的完全混合反應(yīng)器(continuously stirred tank reactor，CSTR)工藝，經(jīng)70 h連續(xù)發(fā)酵，乳糖酸產(chǎn)率可達(dá)110 g/L·d。Pedruzzi等[67]和Malvessi等[68]也分別利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行了乳糖酸生物合成的研究。因此，基于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌特有的GFOR-GL酶促反應(yīng)機(jī)制，使得利用該菌聯(lián)產(chǎn)山梨醇和生物酸成為了可能。

3.3運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生產(chǎn)果聚糖

果聚糖是一種果糖聚合物，在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的用途[69]。實(shí)際上，Dawes和Ribbons[70]在1966年就發(fā)現(xiàn)在以蔗糖為底物時(shí)，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌合成乙醇的量減少，其原因是生成了一種新的副產(chǎn)物——果聚糖。之后的研究也進(jìn)一步證實(shí)了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能將蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖[71～73]。更進(jìn)一步的研究表明，果聚糖和山梨醇的形成是乙醇產(chǎn)率下降的重要原因[57，58，74]。基于此，Beker等[75]建立了一種利用果糖聯(lián)產(chǎn)乙醇和果聚糖的發(fā)酵工藝，其果聚糖產(chǎn)率可達(dá)3.2 g/L·h。分子生物學(xué)研究還表明，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌具有蔗糖水解所需要的酶SacA、SacB和SacC[76]?；谠撗芯?，Senthilkumar等[77]構(gòu)建了1株SacC突變的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株，提高了果聚糖的產(chǎn)率。Silbir等[78]也通過響應(yīng)面優(yōu)化方法，對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌產(chǎn)果聚糖的影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，果聚糖最大產(chǎn)生速率可達(dá)6.556 g/L·h。這些研究為利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生產(chǎn)果聚糖奠定了基礎(chǔ)。

3.4運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生產(chǎn)丁二酸

丁二酸，又稱琥珀酸，是許多厭氧和兼性厭氧微生物的代謝中間產(chǎn)物。作為一種重要的有機(jī)化工原料及中間體，丁二酸廣泛用于生物高分子、食品與醫(yī)藥等行業(yè)，市場(chǎng)潛在需求量巨大。同時(shí)，它作為一種重要的C4平臺(tái)化合物，被美國(guó)能源部認(rèn)為是未來12種最具前景的生物煉制產(chǎn)品之一[56]。2013年市場(chǎng)研究公司Transparency Market Research發(fā)布了關(guān)于丁二酸市場(chǎng)的分析報(bào)告“Succinic Acid Market-Global Industry Analysis，Size，Share，Growth，Trends and Forecast，2012-2018”，預(yù)計(jì)到2018年，丁二酸的市場(chǎng)份額可達(dá)8.362億美元?；谶@些考慮，利用生物質(zhì)資源生產(chǎn)丁二酸已成為生物煉制技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一。

目前,用于丁二酸生產(chǎn)的菌株主要包括產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌(Mannheimiasucciniciproducens)、脆弱類桿菌(Bacteroidesfragilis)和谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)[79，80]；同時(shí)，重組大腸桿菌[81，82]和釀酒酵母[83，84]等也被用于生物基丁二酸的生產(chǎn)研究。盡管已通過敲除(或失活)丁二酸競(jìng)爭(zhēng)途徑中的酶、增強(qiáng)丁二酸代謝途徑及其代謝中的關(guān)鍵酶等代謝工程技術(shù)，獲得了一些可利用生物質(zhì)糖發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的重組菌株，但由于這些菌株基本采用厭氧發(fā)酵方式，且依然伴隨大量副產(chǎn)物的形成，給下游的分離工藝增加了成本。

2012年，Lee等[85]構(gòu)建了一個(gè)基于基因組尺度的代謝模型(ZmoMBEL601)，提出了一種利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌高效生產(chǎn)生物基丁二酸的策略，即通過敲除該菌ED代謝途徑的關(guān)鍵酶基因：丙酮酸脫羧酶基因pdc、乙醇脫氫酶基因adhB和乳酸脫氫酶基因ldhA。上述這些是基于代謝模擬得到的策略，實(shí)際上，Seo等[86]通過基因敲除，已得到一株pdc和ldhA基因的雙基因敲除突變株(△pdc△ldhA)，丁二酸產(chǎn)率可達(dá)1.46 mol/mol 葡萄糖，可達(dá)其理論產(chǎn)率的95%，顯示了較大的丁二酸生產(chǎn)潛力?；谶@些研究，本實(shí)驗(yàn)室也提出了一種利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生產(chǎn)丁二酸的的策略[14]。Widiastuti等[87]也通過基因組尺度的代謝網(wǎng)絡(luò)模擬(izm363)，證實(shí)了pdc和adh基因在乙醇發(fā)酵中的重要功能。Pentjuss等[88]則通過化學(xué)計(jì)量學(xué)系統(tǒng)分析了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在不同培養(yǎng)基條件下的代謝網(wǎng)絡(luò)。這些研究為深入理解運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌特殊的生理生化特征及通過代謝調(diào)控手段生產(chǎn)目的生物基化學(xué)品提供了理論基礎(chǔ)。

3.5運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生產(chǎn)異丁醇

近年來，異丁醇(isobutanol)因其作為生物燃料的優(yōu)點(diǎn)，逐漸引起了研究者的興趣[89，90]。目前，重組大腸桿菌[90～92]、釀酒酵母[93～95]、谷氨酸棒狀桿菌[94，96～98]、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)[99]以及真菌-細(xì)菌混合菌系(fungal-bacterial consortia)等[100]已被用于生物基異丁醇的研究。同樣地，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌也作為一種新的模式平臺(tái)微生物被應(yīng)用于異丁醇的研究。研究者已通過代謝途徑工程將來自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的2-酮異戊酸脫羧酶基因kivd和乙醇脫羥酶基因adhA轉(zhuǎn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，得到了一株可產(chǎn)生異丁醇的重組菌株[101]。為大幅度提高該重組菌株的異丁醇產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)室提出敲除該菌ED代謝途徑的關(guān)鍵酶基因或者通過導(dǎo)入丙氨酸生物合成代謝途徑的關(guān)鍵酶基因的策略，如，L-丙氨酸脫氫酶基因alaD[14]。這些研究為利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生產(chǎn)新型生物液體燃料奠定了基礎(chǔ)。

4 展望

通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，錯(cuò)綜復(fù)雜、多分支的代謝途徑是細(xì)胞高效生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的負(fù)擔(dān)，這些途徑額外消耗細(xì)胞代謝的能量，和產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)各種代謝物前體和輔助因子。與大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物相比，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌具有基因組更小、代謝途徑單一和代謝副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，顯示出了將纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇及其他生物基平臺(tái)化合物的潛力，可成為一種新的平臺(tái)能源微生物[14]。

盡管目前已完成了該菌的全基因組序列測(cè)定，并在轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)層面開展了相關(guān)的研究，但總體而言，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在分子生物學(xué)層面的研究水平還低于模式生物，并且目前尚未有該菌在生物能源及生物基平臺(tái)化合物商業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用的報(bào)道。

就纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)大宗生物能源物質(zhì)及生物基平臺(tái)化合物而言，其主要制約瓶頸是生產(chǎn)成本問題。而缺乏高效和高脅迫適應(yīng)能力的發(fā)酵菌株是其關(guān)鍵制約因素。理想的菌種應(yīng)該具備以下生理特性：優(yōu)化的合成代謝途徑；生長(zhǎng)速度快；營(yíng)養(yǎng)需求單一；能高效利用多種底物(尤其是纖維素水解液中的五碳糖和六碳糖等)；對(duì)纖維素水解液中的有毒物質(zhì)(如呋喃甲醛、乙酸等)和目標(biāo)產(chǎn)物的有耐受能力(有機(jī)醇、有機(jī)酸等)，對(duì)低pH和高溫等具有很好的耐受性。但由于這些生理特性的復(fù)雜性，難以通過傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)獲得相應(yīng)的表型。因此，未來的研究不僅需要利用現(xiàn)代生物組學(xué)技術(shù)結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)研究，闡明復(fù)雜表型的分子機(jī)制；更需要結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建和選育具有優(yōu)良特性的工程菌株，為纖維素生物質(zhì)的高效與高值轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。目前，一些新的代謝工程技術(shù)，如基因組重組、全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程技術(shù)、適應(yīng)性進(jìn)化和最小基因組等技術(shù)正逐漸應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的改造，為通過該菌商業(yè)化生產(chǎn)生物能源及生物基平臺(tái)化合物提供了新的選擇。

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