p53基因及其功能研究進(jìn)展

李文娟，潘慶杰，李美玉

青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物生殖發(fā)育與基因工程研究所，山東 青島 266109

抑癌基因包括Rb基因、p53基因、NF-1基因、WT基因、結(jié)腸腺瘤性息肉（APC）基因和結(jié)腸癌缺失（DCC）基因等[1]，其中前兩者為最重要且最為人了解的2個(gè)基因。自發(fā)現(xiàn)p53基因以來，人們對(duì)該基因的認(rèn)識(shí)逐漸深入。p53基因家族包括p53、p63、p73基因。有研究顯示，在p53激活Bax、PARP通路和細(xì)胞凋亡的過程中，TAp63和TAp73起重要作用，也就是說p53、p63和p73之間存在相互作用。其中，p53基因在細(xì)胞應(yīng)激和腫瘤抑制中起關(guān)鍵作用，該基因有DNA修復(fù)、阻滯細(xì)胞周期、抑制血管生成、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等作用。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在人體發(fā)生的所有惡性腫瘤中，有一半以上會(huì)出現(xiàn)p53基因的突變或缺失，說明該基因在人類腫瘤的發(fā)生上有重要作用。因此，自1979年Lane[2]等發(fā)現(xiàn)該基因以來，各國(guó)科學(xué)家對(duì)該基因及其功能進(jìn)行了大量研究。在此，我們簡(jiǎn)要闡述國(guó)內(nèi)外對(duì)p53基因及其編碼產(chǎn)物的研究現(xiàn)狀。

1 p53基因的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制

1.1 p53基因的結(jié)構(gòu)

人類p53基因位于17號(hào)染色體短臂1區(qū)31帶，即17p13.1，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)顯子組成，其cDNA全長(zhǎng)2074 bp，有單一開放讀框，其中第1個(gè)外顯子不編碼，其上游400 bp處有啟動(dòng)子p1，下游1 kb處有啟動(dòng)子p2，兩者為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，第2、4、5、7、8外顯子分別編碼5個(gè)進(jìn)化上高度保守的結(jié)構(gòu)域[3]。其下游基因主要包括 p21、MDM2、CD95/fas、Bax、WT1、p53AIPI、pig3、Cyclin G等[4]，并直接影響了p53基因的多樣性。p53分為野生型和突變型，野生型p53為正常的p53基因，其突變方式包括點(diǎn)突變、缺失突變、移碼突變、基因重排等。野生型P53蛋白的半衰期很短，用免疫組化很難檢測(cè)到；而突變型P53蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變，半衰期延長(zhǎng)，用免疫組化可以檢測(cè)出，因此當(dāng)檢測(cè)到組織中P53蛋白表達(dá)量高時(shí)，可以判斷為突變型P53基因。P53蛋白主要包含3個(gè)功能區(qū)域，即N2末端轉(zhuǎn)錄區(qū)域（TAD）、C2末端寡居區(qū)域（OD）和核心區(qū)域（DBD）[5]。由于DBD可以結(jié)合特異序列的DNA，因此最為重要。

研究發(fā)現(xiàn)p53基因的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與雌激素代謝相關(guān)的腫瘤疾病有關(guān)聯(lián)[6]：p53基因第4外顯子72位密碼子具有GGT/CCT單核苷酸多態(tài)性，使編碼的精氨酸被脯氨酸取代，與多種腫瘤的易感性有關(guān)；第3個(gè)內(nèi)含子區(qū)16 bp的插入序列5'-GACCTGGAG?GCTGGG-3'多態(tài)性，有該序列的等位基因是A'，無該序列的為A，前者較罕見；第6內(nèi)含子的MspⅠ限制性酶切位點(diǎn)G/A單核苷酸多態(tài)性，其中第一種與腫瘤相關(guān)性的研究最多。第4外顯子編碼的精氨酸和脯氨酸均為野生型，穩(wěn)定性相同，空間構(gòu)象和P53抗體的結(jié)合表位相似，但分子生物學(xué)行為和功能不完全相同。P53脯氨酸型蛋白與部分轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合較強(qiáng)，可能更有效地激活轉(zhuǎn)錄，使下游基因表達(dá)上調(diào)，而P53精氨酸型蛋白則能較好地抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及對(duì)細(xì)胞損傷進(jìn)行修復(fù)[7]。

1.2 P53蛋白的作用機(jī)制

p53基因轉(zhuǎn)錄生成全長(zhǎng)2.5 kb的mRNA，后者編碼的蛋白含393個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為53×103。p53基因可調(diào)節(jié)大量靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞周期組織、凋亡、分化、靜息、DNA損傷、血管生成和轉(zhuǎn)移的抑制及其他功能[8]。

野生型P53蛋白有抗細(xì)胞增殖的作用，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂，使其停留在G1期而不進(jìn)入S期。其作用機(jī)制為：由于野生型P53蛋白可通過抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，為細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)酶修復(fù)損傷DNA爭(zhēng)取更多的時(shí)間，避免DNA突變?cè)谌旧w上的積累，如果損傷的DNA太嚴(yán)重而無法修復(fù)時(shí)，P53會(huì)觸發(fā)凋亡系統(tǒng)調(diào)控受損細(xì)胞凋亡。野生型P53蛋白具有上調(diào)CDK抑制劑p21WAFI/CIPI基因轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而降低CDK的活性，不能磷酸化Rb進(jìn)而使細(xì)胞停留在G1/S期。該蛋白還可以與增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）共同作用，降低DNA聚合酶的活性，使損傷細(xì)胞的DNA復(fù)制過程停止，進(jìn)而開始DNA的修復(fù)[9]。

P53聯(lián)系著不同的細(xì)胞應(yīng)急和細(xì)胞應(yīng)答，受離子輻射、化學(xué)藥物及異常的細(xì)胞信號(hào)的刺激而得以表達(dá)，表達(dá)升高后受到p53-mdm2、p14ARF-mdm2環(huán)路的精確調(diào)節(jié)。已開發(fā)出一種能干擾p53-MDM2復(fù)合物形成、促進(jìn)P53蛋白釋放并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的類似P53蛋白的多肽[10]。而Svane等[11]已研制出結(jié)合了P53肽段的樹突細(xì)胞疫苗，臨床發(fā)現(xiàn)P53表達(dá)增高，有三分之一的患者病情穩(wěn)定或輕度消退。

2 p53基因表達(dá)的檢測(cè)

通過對(duì)p53基因及其產(chǎn)物的監(jiān)測(cè)，可以對(duì)腫瘤做出早期診斷和預(yù)測(cè)，并且可以對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后做出科學(xué)推斷。

2.1 納米探針檢測(cè)

由于納米金顆粒具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)及較好的生物相容性，因此日益受到人們的關(guān)注[12]。1971年Faulk和Taylor[13]用免疫金與兔抗沙門菌抗血清結(jié)合檢測(cè)表面抗原，納米金作為一種免疫標(biāo)記技術(shù)開始快速發(fā)展。蘇州大學(xué)黃云艷的畢業(yè)論文中提到使用標(biāo)記了P53捕捉抗體的納米磁珠來富集和分離血清中的P53蛋白，然后用標(biāo)記了P53檢測(cè)抗體和HRP的納米金探針檢測(cè)已富集的P53蛋白。用IgG-Au-DNA-HRP型探針檢測(cè)P53蛋白，當(dāng)HRP分子和P53抗體的比例為2.5∶1時(shí)效果明顯。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

免疫組織化學(xué)法的原理就是利用特異性抗體與P53蛋白發(fā)生抗原抗體顯色反應(yīng)，根據(jù)顯色斑點(diǎn)的有無和強(qiáng)弱，間接判斷P53蛋白的有無或多少。該方法得到了廣泛應(yīng)用[14-15]，但不能大批量篩查樣本。

2.3 利用同位素免疫檢測(cè)

可以利用同位素標(biāo)記進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)來檢測(cè)蛋白質(zhì)。放射性同位素標(biāo)記物的顯示具有高靈敏性，抗原抗體反應(yīng)具有高特異性，兩者結(jié)合起來檢測(cè)P53蛋白，精確性高，樣品用量少，且易規(guī)范化和自動(dòng)化[16]。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

有研究證明，用流式細(xì)胞儀可以雙參數(shù)分析P53蛋白和DNA的關(guān)系[17]，該實(shí)驗(yàn)用DO-1單抗標(biāo)記P53蛋白，用PI染色DNA，結(jié)果證明可以用該方法測(cè)定P53蛋白。

2.5 組織微陣列檢測(cè)

組織微陣列又稱組織芯片，是將若干石蠟包埋塊上的各種典型組織轉(zhuǎn)移到一個(gè)新石蠟塊上重新構(gòu)建微型化高通量組織陣列的方法。用該方法可在一張玻璃板上排列成百上千個(gè)組織標(biāo)本，進(jìn)而研究組織標(biāo)本DNA、RNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)。可以用該法測(cè)定P53蛋白，具有數(shù)據(jù)量大、微型化、自動(dòng)化和節(jié)省勞動(dòng)力等優(yōu)點(diǎn)。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的基本過程是將抗原（抗體）吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果。檢測(cè)P53蛋白可采用雙抗夾心法，原理仍然是抗原抗體特異反應(yīng)，洗脫未結(jié)合部分，顯色顯示P53蛋白含量。實(shí)驗(yàn)證明該方法敏感性強(qiáng)，特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性好[18]。但該方法有容易出現(xiàn)假陽性和操作繁瑣等缺點(diǎn)。

3 p53基因的功能及應(yīng)用研究

3.1 p53基因的功能

p53基因的具有阻滯細(xì)胞周期的作用。p53基因可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中G1和G2/M期校正點(diǎn)的監(jiān)測(cè)，與轉(zhuǎn)錄激活功能密切相關(guān)，p2IWAF/CIPI基因是p53的下游基因，該基因編碼的蛋白可以與一系列Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致高磷酸化Rb蛋白堆積，進(jìn)而抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子活性，使G1期阻滯。

p53基因還具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。p53基因可以通過Bax/Bcl-2、Fas/Apo1、IGF-Bp3等蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡，還可以通過死亡信號(hào)受體蛋白如TNF受體和Fas蛋白途徑誘導(dǎo)凋亡。有學(xué)者認(rèn)為p53還可以直接刺激線粒體釋放高毒性的氧自由基引發(fā)凋亡[19]。

p53基因可以維持基因組穩(wěn)定。P53參與DNA的修復(fù)過程，切除錯(cuò)配核苷酸結(jié)合和調(diào)節(jié)核苷酸內(nèi)切修復(fù)因子的活性，如XPB因子和XPD因子。還可以利用自身3'→5'核酸外切酶活性與p21WAFI、GADD45和PCNA形成復(fù)合物發(fā)揮作用。

p53基因可抑制腫瘤血管生成。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到一定程度以后，能通過自分泌途徑形成促血管生成因子，刺激營(yíng)養(yǎng)血管在腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)增生。研究發(fā)現(xiàn)p53基因可調(diào)控下游多個(gè)基因的表達(dá)，刺激抑制血管生成基因的表達(dá)，進(jìn)而起到抑制腫瘤血管生成的作用，因此在各種腫瘤疾病的研究中發(fā)揮重要作用。

3.2 p53基因在膽管癌中的研究

對(duì)膽管癌的研究發(fā)現(xiàn)，p53基因的突變均發(fā)生在高度保守區(qū)，主要分布在CPG位點(diǎn)，由G∶C向A∶T轉(zhuǎn)化。Head等[20]進(jìn)一步證實(shí)膽管癌細(xì)胞中的p53基因第272～282密碼子存在錯(cuò)義、插入及缺失突變。

3.3 p53基因在肝癌中的研究

研究證明，p53基因的突變與肝癌的病理密切相關(guān)，突變率與肝癌分化呈負(fù)相關(guān)。此外，p53基因的表達(dá)還與腫瘤生長(zhǎng)與浸潤(rùn)有關(guān)，有實(shí)驗(yàn)證明浸潤(rùn)性肝癌P53蛋白的表達(dá)顯著高于非浸潤(rùn)性。有研究發(fā)現(xiàn)p53基因249位點(diǎn)的突變與肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生率、腫瘤包膜完整性、有無肝內(nèi)播散結(jié)點(diǎn)、是否為多發(fā)病灶等密切相關(guān)。

3.4 p53基因在胃癌中的研究

胃癌中最常突變的抑癌基因就是p53，不同類型及不同病因所致的胃癌患者，該基因的突變率不同。p53基因的突變和過表達(dá)發(fā)生在癌變的不同階段，在晚期胃癌和轉(zhuǎn)移者中更常發(fā)生，而不完全結(jié)腸化生和異型增生也有較高的檢出率。在腸型胃癌中，p53基因突變以無義突變、內(nèi)含子突變、沉默突變常見，且突變率高于彌散性胃癌。此外，有萎縮性胃炎病史的患者，該基因的突變率也明顯較高。

4 p53基因的研究前景

自p53基因被發(fā)現(xiàn)以來，對(duì)該基因細(xì)胞調(diào)控方面的研究取得了一些進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)ONXY-015系統(tǒng)可以定位并殺死高表達(dá)p53變異基因的靶細(xì)胞，而且不損傷表達(dá)野生型的細(xì)胞。也有研究發(fā)現(xiàn)糖-膽固醇的去泛素化作用不僅可以通過增加p53的穩(wěn)定性而引發(fā)細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡，還可以激活p53家族通路。糖-膽固醇的去泛素化作用還可以激活Pinl，全面活化p53，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。

對(duì)p53基因的研究開始應(yīng)用于癌癥的臨床治療上。用野生型p53基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，可能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并且脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染p53動(dòng)物模型已構(gòu)建成功，已開展通過重組腺病毒介導(dǎo)的p53基因來治療惡性腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，p53可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期捕獲、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放療、化療和熱療的敏感性，所以，如果利用該基因和傳統(tǒng)的化療等手段聯(lián)合使用，會(huì)取得較好的治療效果。腫瘤基因治療方法的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞最有效的途徑就是轉(zhuǎn)染那些失活的腫瘤抑制基因，而p53能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期捕獲、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放療、熱療和化學(xué)藥物的敏感性，這些優(yōu)點(diǎn)使p53基因的功能在腫瘤的治療和預(yù)防方面得到越來越多的關(guān)注。

隨著對(duì)p53基因的研究，更多治療腫瘤的新思路被提出：下調(diào)突變型p53基因的活性與表達(dá)；引入特殊的細(xì)胞因子，抑制腫瘤的惡性表型，進(jìn)而使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)為正常的細(xì)胞；采用點(diǎn)突變，修復(fù)突變基因或使突變基因失活。

隨著p53基因網(wǎng)絡(luò)的提出，人們將對(duì)P53在各種癌癥中的作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究，不是孤立地觀察各個(gè)基因，而是結(jié)合起來分析。相信該基因的作用將會(huì)得到更好的闡述，同時(shí)會(huì)充分利用P53功能及突變尋找更有效的載體，提高轉(zhuǎn)染率，開發(fā)更多的可有效治療各種癌癥的藥物。

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