MS2噬菌體衣殼蛋白與包裝位點(diǎn)結(jié)合特異性及其生物學(xué)應(yīng)用進(jìn)展

孫士鵬，劉貴建

中國中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053

噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，因部分能引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體。MS2噬菌體為正義單鏈RNA噬菌體，屬于輕小噬菌體科、輕小噬菌體目、輕小噬菌體屬,由外裹蛋白衣殼的核酸組成，是性菌毛RNA大腸桿菌噬菌體的4個血清型中第1血清群的典型代表。MS2噬菌體基因組含有3569個核苷酸，同時作為mRNA編碼4種蛋白質(zhì)分子，即成熟酶蛋白（也稱A蛋白）、衣殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白[1-2]。MS2噬菌體能夠通過吸附性菌毛（F-pili）感染雄性大腸桿菌，感染后每個細(xì)胞能產(chǎn)生103～104個噬菌體[2]。電子顯微鏡下MS2噬菌體直徑約27 nm[3]，衣殼蛋白是噬菌體外殼的主要蛋白，由180個化學(xué)結(jié)構(gòu)一致的亞基組成，每個亞基含有129個氨基酸殘基，形成二十面體對稱結(jié)構(gòu)[4]。A蛋白的功能是使噬菌體識別宿主并使其RNA基因組進(jìn)入宿主菌，每個噬菌體一般只存在1分子的A蛋白。噬菌體對宿主寄生具有高度特異性，只能侵染一種細(xì)菌中的某一菌株。MS2噬菌體的宿主是大腸桿菌，在人和動物的排泄物或污染的井水、河水中廣泛存在，因其物理結(jié)構(gòu)、組成和形態(tài)學(xué)、環(huán)境生存力與人腸道病毒極其相似，且易于培養(yǎng)，可作為人腸道病毒的替代病毒，用于水和污水的研究等[5-8]。

1 MS2噬菌體衣殼蛋白與包裝位點(diǎn)結(jié)合特異性的生物學(xué)應(yīng)用

MS2噬菌體復(fù)制酶編碼基因5'端存在一個由19個堿基組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（包裝位點(diǎn)，ACAUGAGGA UUACCCAUGU），是衣殼蛋白二聚體與RNA相互作用的部位，這種相互作用形成的復(fù)合物是噬菌體自我包裝的信號，在復(fù)合物的基礎(chǔ)上，成熟酶蛋白與其他包膜蛋白分子結(jié)合，并在自由能的驅(qū)動下形成相應(yīng)的空間構(gòu)像，完成MS2噬菌體的組裝[2]。包裝位點(diǎn)同時還是一個翻譯調(diào)節(jié)元件，當(dāng)衣殼蛋白表達(dá)量超過組裝需求量后，衣殼蛋白二聚體與包裝位點(diǎn)的結(jié)合能阻止核糖體結(jié)合到復(fù)制酶的起始位點(diǎn)上，從而抑制復(fù)制酶的翻譯，完成其對翻譯的調(diào)節(jié)[9-10]。

1.1 用于RNA病毒核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品

利用衣殼蛋白二聚體與包裝位點(diǎn)結(jié)合的特異性，通過基因克隆技術(shù)，把包裝位點(diǎn)編碼RNA融合至外源RNA序列上，即可將外源RNA包裝到衣殼蛋白內(nèi)組裝成MS2噬菌體樣顆粒（或稱病毒樣顆粒，VLP）。Peabody[11]等構(gòu)建了一個雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，其中一個表達(dá)質(zhì)粒用來表達(dá)MS2衣殼蛋白，另一個表達(dá)質(zhì)粒中克隆了MS2 RNA包裝位點(diǎn)的cDNA序列和lacZ基因，lacZ基因在包裝位點(diǎn)的cDNA序列的下游。由于這2個表達(dá)質(zhì)粒含不同的復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因，因此可共存于同一個宿主菌中。然后，把這2個重組表達(dá)質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過夜培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，形成了大量包裝外源RNA的MS2 VLP。在此基礎(chǔ)上，其他研究人員發(fā)展了帶盔甲的RNA（armored RNA）技術(shù)，顧名思義，MS2衣殼蛋白像盔甲一樣能夠有效保護(hù)RNA不被RNA酶降解，具有耐RNA酶、類似病毒顆粒和無生物傳染危險性的特性，被廣泛用于RNA病毒核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品[12-15]。Rowsell等將MS2野生型19堿基莖環(huán)結(jié)構(gòu)的-5位尿嘧啶替換為胞嘧啶（命名為C-variant），使C-variant適配體與衣殼蛋白的親和力與野生型相比提高了10～50倍[16]。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的李金明研究員等通過對C-variant的數(shù)量和位置改變，使得MS2 VLP能夠包裝2000 nt以上的外源RNA。研究者采用雙質(zhì)粒共表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)了含6個基因片段［SARS-CoV1、SARS-CoV2、SARS-CoV3、禽流感基質(zhì)蛋白基因（M300）和H5N1型禽流感（HA300）基因片段］共2248 nt的VLP[17]。采用單質(zhì)粒雙表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌內(nèi)能夠?qū)㈤L度達(dá)到3024 nt的外源病毒RNA成功包裝到MS2 VLP內(nèi)[14]，此長度的外源RNA已很接近野生型MS2基因組RNA（3569 nt）。雖然目前不能確定3569 nt是否是MS2 VLP包裝外源RNA的長度極限，但筆者研究發(fā)現(xiàn)，隨著包裝外源RNA長度的增加，相應(yīng)的包裝效率會下降。

1.2 用于實(shí)時動態(tài)監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)RNA的運(yùn)動

衣殼蛋白和包裝位點(diǎn)特異性結(jié)合的特性還被廣泛用于實(shí)時動態(tài)監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)RNA的運(yùn)動，如小鼠白血病病毒的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和HIV-1 RNA動態(tài)轉(zhuǎn)錄、包裝過程等[18-23]。RNA實(shí)時動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)是使用基因克隆技術(shù)，將MS2噬菌體衣殼蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）融合表達(dá)，被監(jiān)測的RNA分子上融合有多個串聯(lián)重復(fù)的MS2噬菌體衣殼蛋白的結(jié)合位點(diǎn)（包裝位點(diǎn)序列），當(dāng)MS2-GFP融合蛋白與靶RNA共表達(dá)時，大量帶有GFP標(biāo)簽的衣殼蛋白會與每個RNA分子上的包裝位點(diǎn)序列結(jié)合，在顯微鏡下形成明亮的熒光顆粒，進(jìn)而能夠指示RNA的運(yùn)動。

1.3 用于細(xì)胞內(nèi)mRNA相關(guān)microRNA的鑒定

microRNA（miRNA）是一類長約19～24 nt的非編碼單鏈小RNA分子，人類miRNA在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下轉(zhuǎn)錄成初級miRNA（pri-miRNA），在細(xì)胞核內(nèi)被切割成約70 nt的miRNA前體（premiRNA），隨后pre-miRNA通過RanGTP/Exportin 5的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步被切割加工為成熟的miRNA。在動物中，miRNA可通過與靶基因3′UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶基因翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而在細(xì)胞、組織或個體水平上影響生物體的生長發(fā)育，并參與免疫反應(yīng)[24]和多種疾病過程[25-26]。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一群長度為200～100 000 nt的RNA分子，具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。然而，近年發(fā)現(xiàn)lncRNA參與X染色體沉默、基因組印記及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程[27-30]。目前對lncRNA功能的研究才剛剛開始。Yoon等利用MS2衣殼蛋白和包裝位點(diǎn)結(jié)合的特異性，以lincRNA-p21為例，創(chuàng)造了一種被稱為MS2-TRAP（MS2-標(biāo)簽RNA親和純化）的鑒定細(xì)胞內(nèi)與RNA結(jié)合的miRNA方法[31]，鑒定了多種與lincRNA-p21結(jié)合的miRNA。他們構(gòu)建了幾種質(zhì)粒，包括表達(dá)含24個包裝位點(diǎn)的pMS2質(zhì)粒、融合表達(dá)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和MS2 RNA結(jié)合蛋白及核定位信號（NLS）的pMS2-GST質(zhì)粒、表達(dá)含24個包裝位點(diǎn)作為標(biāo)簽的目的RNA的質(zhì)粒pMS2-lin?cRNA-p21。pMS2和pMS2-GST共轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為陰性對照，pMS2-lincRNA-p21和pMS2-GST共轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染后，在細(xì)胞內(nèi)形成RNP復(fù)合物MS2 RNA/MS2-GST和lincRNA-p21-MS2 RNA/MS2-GST。裂解細(xì)胞后用含有還原型谷胱甘肽的瓊脂糖珠子純化2種復(fù)合物，提取其中的RNA，用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增鑒定相關(guān)miRNA。

1.4 用于RNA遞送載體的研究

RNA可分為編碼RNA和非編碼RNA。編碼RNA即mRNA，是能夠編碼蛋白質(zhì)的RNA；非編碼RNA是不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括rRNA、tRNA、sn?RNA、snoRNA、lncRNA和miRNA等。MS2噬菌體為正義單鏈RNA噬菌體，因其衣殼蛋白二聚體能夠識別并包裝含有包裝位點(diǎn)的外源性RNA，進(jìn)而形成MS2 VLP，因而可用于包裝編碼RNA，如抗原編碼mRNA、調(diào)節(jié)因子編碼mRNA、具特定生物活性蛋白編碼mRNA，還能包裝非編碼RNA，如反義RNA和miRNA等，可作為RNA疫苗和RNA遞送載體[32-34]。

MS2是正義單鏈RNA噬菌體，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。天然MS2的基因組RNA為原核RNA。Leg?endre等在釀酒酵母細(xì)胞YPH499內(nèi)表達(dá)了帶有MS2包裝位點(diǎn)的外源mRNA的MS2 VLP，并證實(shí)這些mRNA可在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)行使功能[10]。筆者利用單質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，在釀酒酵母YPH499細(xì)胞內(nèi)用MS2衣殼蛋白包裝了HIV-1 gag mRNA，形成了MS2 VLP，此VLP具有很好的耐DNase和RNase的特性[33]。提取RNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞（293T細(xì)胞、CHO細(xì)胞）后可檢測到目的蛋白的表達(dá)。我們還進(jìn)一步證實(shí)了純化的pMS-GAG VLP免疫BALB/c（H-2d）小鼠后可以誘導(dǎo)抗原特異性體液免疫應(yīng)答[33]。以上研究說明，不僅原核表達(dá)的MS2 VLP能包裝外源性原核RNA，通過真核表達(dá)系統(tǒng)獲得的MS2 VLP還可用于真核mRNA的遞送。

反義RNA是與特異靶RNA（主要是mRNA）互補(bǔ)的RNA分子，可通過配對堿基間氫鍵作用與靶RNA的特定互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合形成雙鏈復(fù)合物，抑制靶RNA的功能，從而調(diào)控基因的正常表達(dá)[35-36]。反義RNA不編碼蛋白質(zhì)，因而其結(jié)構(gòu)與真核mRNA不同，僅需要其序列與靶RNA序列互補(bǔ)即可，因此無論原核還是真核表達(dá)系統(tǒng)獲得的包裝有MS2噬菌體樣顆粒均可用于抑制相應(yīng)靶mRNA的表達(dá)。魏葆珺等采用雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，其中用pET28（b）載體表達(dá)MS2成熟酶蛋白和衣殼蛋白，通過RT-PCR獲得人HCV 1～389 bp cDNA序列，反向插入pACYCDuet-1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)錄后可產(chǎn)生針對HCV 5'UTR和IRES區(qū)的反義RNA。2種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，形成了內(nèi)含反義RNA的MS2 VLP。源于HIV-1的Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽具有多種靶細(xì)胞，可直接與細(xì)胞膜相互作用將外源性分子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)作用的最短有效序列為47YGRKKRRQRRR57。將內(nèi)含反義RNA的MS2 VLP與HIV-1 Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽通過化學(xué)交聯(lián)劑Sulfo-SMPB交聯(lián)，在Tat47-57轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的作用下將VLP轉(zhuǎn)入含HCV-螢火蟲螢光素酶報告基因的Huh-7細(xì)胞發(fā)揮功能，展示出其用于病毒感染治療的潛力[32]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的裝載有功能性pre-miR-146a序列的MS2噬菌體樣顆粒與Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽交聯(lián)后可將其作為miRNA的新型遞送載體，能夠被HeLa、HepG2、Huh-7及外周血單核細(xì)胞攝取，pre-miR-146a能在細(xì)胞內(nèi)被加工為成熟的miR-146a，使細(xì)胞內(nèi)miR-146a濃度增加5倍以上，進(jìn)而有效抑制下游靶基因的表達(dá)[34]。小鼠尾靜脈注射100 μg與Tat交聯(lián)的MS2 VLP后，可在小鼠外周血淋巴細(xì)胞、脾、肺、腎中檢測到高表達(dá)的miR-146a，致使自身抗體和總IgG水平下調(diào)[37]。以上研究證實(shí)了MS2 VLP還能夠作為miRNA體內(nèi)遞送載體，有效地將miRNA遞送至靶細(xì)胞并發(fā)揮功能。

2 結(jié)語

綜上所述，MS2噬菌體衣殼蛋白與包裝位點(diǎn)結(jié)合特異性強(qiáng)，MS2噬菌體樣顆粒能夠有效保護(hù)包裝RNA不被RNA酶降解，被廣泛應(yīng)用于RNA病毒核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的研究。二者間結(jié)合的特異型可作為細(xì)胞分子生物學(xué)研究的工具，如對活細(xì)胞內(nèi)功能性RNA實(shí)時動態(tài)監(jiān)測和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA相關(guān)miRNA的鑒定。通過真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)化獲得包裝外源功能性蛋白質(zhì)編碼mRNA，如抗原編碼mRNA、調(diào)節(jié)因子編碼mRNA、具特定生物活性蛋白編碼mRNA，在疫苗和基因轉(zhuǎn)運(yùn)等研究方面亦具有重要的應(yīng)用價值。此外，如通過分子克隆技術(shù)對MS2衣殼蛋白進(jìn)行改造，將諸如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列（整合素αⅤβ3特異識別的配體結(jié)構(gòu)）的腫瘤細(xì)胞靶向序列展示在MS2 VLP衣殼表面，獲得包裝有抑癌miRNA和/或抑癌lin?cRNA的MS2 VLP，不僅會實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的靶向性，還能通過多個靶點(diǎn)抑制腫瘤細(xì)胞生長或殺死腫瘤細(xì)胞，有可能給腫瘤的基因治療帶來新的突破，并為miRNA藥物治療相關(guān)載體的構(gòu)建、病毒感染、遺傳病等的治療研究帶來新的思路。

[1] Fiers W,Contreras R,Duerinck F,et al.Complete nucleotide sequence of bacteriophage MS2 RNA:primary and secondary structure of the replicase gene[J].Nature,1976,260:500-507.

[2] van Meerten D,Olsthoorn R C,van Duin J,et al.Peptide display on live MS2 phage:restrictions at the RNA genome level[J].J Gen Virol,2001,82:1797-1805.

[3] Strauss J H Jr,Sinsheimer R L.Purification and properties of bacteriophage MS2 and of its ribonucleic acid[J].J Mol Bi?ol,1963,7:43-54.

[4] Lima S M,Peabody D S,Silva J L,et al.Mutations in the hydrophobic core and in the protein-RNA interface affect the packing and stability oficosahedralviruses[J].EurJBio?chem,2004,271:135-145.

[5] Theitler D J,Nasser A,Gerchman Y,et al.Synergistic effect of heat and solar UV on DNA damage and water disinfection of E.coli and bacteriophage MS2[J].J Water Health,2012,10:605-618.

[6] Huertas A,Barbeau B,Desjardins C,et al.Evaluation of Ba?cillus subtilis and coliphage MS2 as indicators of advanced water treatment efficiency[J].Water Sci Technol,2003,47:255-259.

[7] Jolis D.The effect of storage and lag time on MS2 bacterio?phage susceptibility to ultraviolet radiation[J].Water Environ Res,2002,74:516-520.

[8] You Y,Vance G F,Sparks D L,et al.Sorption of MS2 bac?teriophagetolayered doublehydroxides:effectsofreaction time,pH,and competing anions[J].J Environ Qual,2003,32:2046-2053.

[9] Witherell G W,Gott J M,Uhlenbeck O C.Specific interac?tion between RNA phage coat proteins and RNA[J].Prog Nu?cleic Acid Res Mol Biol,1991,40:185-220.

[10]Legendre D,Fastrez J.Production in Saccharomycescerevisiae of MS2 virus-like particles packaging functional heterologous mRNAs[J].J Biotechnol,2005,117:183-194.

[11]Peabody D S.Translational repression by bacteriophage MS2 coat protein expressed from a plasmid.A system for genetic analysis of a protein-RNA interaction[J].J Biol Chem,1990,265:5684-5689.

[12]常樂,張括,張瑞,等.含輪狀病毒NSP3基因病毒樣顆粒的構(gòu)建和表達(dá)[J].北京大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2012,44(5):737-741.

[13]Shulman L M,Hindiyeh M,Muhsen K,et al.Evaluation of four different systems for extraction of RNA from stool suspen?sions using MS-2 coliphage as an exogenous control for RTPCR inhibition[J].PLoS One,2012,7:e39455.

[14]Zhan S,Li J,Xu R,et al.Armored long RNA controls or standards for branched DNA assay for detection of human im?munodeficiency virustype 1[J].JClin Microbiol,2009,47:2571-2576.

[15]Blaise-Boisseau S,Hennechart-Collette C,Guillier L,et al.Duplex real-time qRT-PCR for the detection of hepatitis A virus in water and raspberries using the MS2 bacteriophage as a process control[J].J Virol Methods,2010,166:48-53.

[16]Rowsell S,Stonehouse N J,Convery M A,et al.Crystal struc?tures of a series of RNA aptamers complexed to the same protein target[J].Nat Struct Biol,1998,5:970-975.

[17]Wei Y,Yang C,Wei B,et al.RNase-resistant virus-like par?ticles containing long chimeric RNA sequences produced by two-plasmid coexpression system[J].J Clin Microbiol,2008,46:1734-1740.

[18]Bertrand E,Chartrand P,Schaefer M,et al.Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast[J].Mol Cell,1998,2:437-445.

[19]Chartrand P,Meng X H,Singer R H,et al.Structural ele?ments required for the localization of ASH1 mRNA and of a green fluorescent protein reporter particle in vivo[J].Curr Bi?ol,1999,9:333-336.

[20]Zenklusen D,Wells A L,Condeelis J S,et al.Imaging realtime gene expression in living yeast[J].CSH Protoc,2007,2007:prot4870.

[21]Molle D,Segura-Morales C,Camus G,et al.Endosomal traf?fickingofHIV-1 gagand genomicRNAsregulatesviral egress[J].J Biol Chem,2009,284:19727-19743.

[22]Basyuk E,GalliT,MougelM,etal.Retroviralgenomic RNAs are transported to the plasma membrane by endosomal vesicles[J].Dev Cell,2003,5:161-174.

[23]Chen J,Nikolaitchik O,Singh J,et al.High efficiency of HIV-1 genomic RNA packaging and heterozygote formation re?vealed by single virion analysis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:13535-13540.

[24]Xiao C,Rajewsky K.MicroRNA control in the immune sys?tem:basic principles[J].Cell,2009,136:26-36.

[25]Kloosterman W P,Plasterk R H.The diverse functions of mi?croRNAsin animaldevelopmentand disease[J].DevCell,2006,11:441-450.

[26]Mendell J T.MicroRNAs:critical regulators of development,cellular physiology and malignancy[J].CellCycle,2005,4:1179-1184.

[27]Kung J T,Colognori D,Lee J T.Long noncoding RNAs:past,present,and future[J].Genetics,2013,193:651-669.

[28]Batista P J,Chang H Y.Long noncoding RNAs:cellular ad?dress codes in development and disease[J].Cell,2013,152:1298-1307.

[29]Dempsey L A.LncRNA regulates Ifng[J].Nat Immunol,2013,14:318.

[30]Chen I.A lncRNA for the active X[J].Nat Struct Mol Biol,2013,20:308.

[31]Yoon J H,Srikantan S,Gorospe M.MS2-TRAP(MS2-tagged RNA affinity purification):tagging RNA to identify associated miRNAs[J].Methods,2012,58:81-87.

[32]Wei B,Wei Y,Zhang K,et al.Development of an antisense RNA delivery system using conjugates of the MS2 bacterio?phage capsids and HIV-1 TAT cell-penetrating peptide[J].Biomed Pharmacother,2009,63:313-318.

[33]Sun S,Li W,Sun Y,et al.A new RNA vaccine platform based on MS2 virus-like particles produced in Saccharomyces cerevisiae[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,407:124-128.

[34]Pan Y,Zhang Y,Jia T,et al.Development of a microRNA delivery system based on bacteriophage MS2 virus-like parti?cles[J].Febs J,2012,279:1198-1208.

[35]Izant J G,Weintraub H.Inhibition of thymidine kinase gene expression by anti-sense RNA:a molecular approach to genet?ic analysis[J].Cell,1984,36:1007-1015.

[36]Nakashima N,Tamura T.Gene silencing in Escherichia coli using antisense RNAs expressed from doxycycline-inducible vectors[J].Lett Appl Microbiol,2013,56(6):436-442.

[37]Pan Y,Jia T,Zhang Y,et al.MS2 VLP-based delivery of microRNA-146a inhibitsautoantibody production in lupusprone mice[J].Int J Nanomedicine,2012,7:5957-5967.

[38]Wu M,Sherwin T,Brown W L,et al.Delivery of antisense oligonucleotides to leukemia cells by RNA bacteriophage cap?sids[J].Nanomedicine,2005,1:67-76.

[39]Brown W L,Mastico R A,Wu M,et al.RNA bacteriophage capsid-mediated drug delivery and epitope presentation[J].In?tervirology,2002,45:371-380.

[40]Wu M,Brown W L,Stockley P G.Cell-specific delivery of bacteriophage-encapsidated ricin A chain[J].Bioconjug Chem,1995,6:587-595.

[41]Ashley C E,Carnes E C,Phillips G K,et al.Cell-specific delivery of diverse cargos by bacteriophage MS2 virus-like particles[J].ACS Nano,2011,5:5729-5745.

[42]Peabody D S,Manifold-Wheeler B,Medford A,et al.Immuno?genic display of diverse peptides on virus-like particles of RNA phage MS2[J].J Mol Biol,2008,380:252-263.