灰旱獺-長尾黃鼠鼠疫疫源地監(jiān)測中應(yīng)用ELISA檢測F1抗體的可行性分析

熱娜·吐爾地，阿不力米提·買托乎提，布仁明德，阿布力克木·阿不都熱西提，雷 剛，王信惠，廖力夫，徐秉臣

我國的灰旱獺(Marmotabaibacina)-長尾黃鼠(Citellusundulatus)雙宿主鼠疫疫源地，僅分布在北天山北坡，東起沙灣縣的博爾霍拉地區(qū)，西到尼勒克縣的恰克蘭尼勒克溝。烏蘇市古爾圖山地牧場(N 44°050～44°20'，E83°22'～83°50') 灰旱獺-長尾黃鼠混居，1964年從自斃長尾黃鼠臟器分離出第一株鼠疫菌，1967年發(fā)生1例人間腺鼠疫死亡病例，被定為灰旱獺-長尾黃鼠雙宿主鼠疫疫源地[1]。古爾圖山地牧場在各類鼠疫疫源地中，不僅動(dòng)物血清鼠疫F1抗體陽性率較高，而且分離的鼠疫菌株也較多[1]。2010-2012年鼠疫監(jiān)測工作中，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法(ELISA)與間接血凝試驗(yàn)(IHA)檢測鼠疫F1抗體，本文報(bào)告兩種方法的檢測結(jié)果并討論ELISA鼠疫監(jiān)測中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 鼠疫監(jiān)測工作中釆集的灰旱獺、長尾黃鼠和牧犬血清，加硫柳汞防腐，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑 間接血凝試驗(yàn)檢測鼠疫菌F1抗體診斷試劑盒：吉林博德醫(yī)學(xué)免疫制品有限公司，批號：20100101，20110115，20111215；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測鼠疫菌F1抗體診斷試劑盒：新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，蘭州生物制品研究所研制，批號：20100315，20110501，20120103。

1.1.3儀器 酶標(biāo)儀(Multiskan Mk3) 上海熱電儀器有限公司；洗板機(jī)(WELLWASH 4MK2) 上海賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1IHA檢測鼠疫F1抗體(微量法) 微量血凝板管底為90°角V形，試驗(yàn)在28～37 ℃進(jìn)行，設(shè)陽性、陰性對照。初篩：每份標(biāo)本6管，每管加稀釋液25μL，首管加標(biāo)本25 μL，連續(xù)2倍稀釋到最末管；每管加1%F1抗原致敏血細(xì)胞液25 μL，旋轉(zhuǎn)振蕩1 min，28～37 ℃靜置90 min，觀察結(jié)果，凝集血細(xì)胞布滿管底為陽性反應(yīng)終點(diǎn)。驗(yàn)證：包括測滴度試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)，滴度試驗(yàn)列每管加稀釋液，抑制試驗(yàn)列加含鼠疫F1抗原稀釋液，首管加復(fù)檢標(biāo)本，連續(xù)2倍稀釋到最末管；以下操作步驟同初篩試驗(yàn)。滴度試驗(yàn)的陽性反應(yīng)滴度比抑制試驗(yàn)高2個(gè)或2個(gè)以上滴度為驗(yàn)證試驗(yàn)陽性，判為鼠疫F1抗體陽性反應(yīng)，滴度用1∶2n表示，n為陽性反應(yīng)終點(diǎn)管數(shù)[2]。

1.2.2ELISA檢測鼠疫F1抗體 試驗(yàn)在28～37 ℃進(jìn)行，設(shè)陽性、陰性對照。初篩：鼠疫F1抗原反應(yīng)板每管加稀釋液50 μL；每管加1份標(biāo)本50 μL，靜置90 min；流水沖洗5次；加酶標(biāo)Fl抗原液100 μL，反應(yīng)45 min，流水沖洗5次加TMB顯色液A液B液，避光反應(yīng)15 min，加終止液，陰性為無色或顏色很淡。觀測記錄結(jié)果：目測：距白色背景15～20 cm，從上方向下觀察，陰性(-)無色或顏色很淡，陽性(+)顏色明顯可見；比色計(jì)比色：雙波長450 nm/630 nm，標(biāo)本OD值>0.2為陽性反應(yīng)。驗(yàn)證：初篩陽性反應(yīng)標(biāo)本做驗(yàn)證試驗(yàn)，滴度試驗(yàn)列加稀釋液，抑制試驗(yàn)列加含鼠疫F1抗原的稀釋液，兩列的首管加同份標(biāo)本，連續(xù)2倍稀釋；以下操作步驟同初篩試驗(yàn)。標(biāo)本OD >0.20為陽性反應(yīng)滴度終點(diǎn)，滴度用1∶2n表示，n為陽性反應(yīng)終點(diǎn)管數(shù)。檢測滴度試驗(yàn)比抑制試驗(yàn)滴度高2個(gè)或2個(gè)以上滴度為驗(yàn)證試驗(yàn)陽性，判為鼠疫F1抗體陽性[2]。

1.2.3鼠疫細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn) 包括顯微鏡檢查，分離培養(yǎng)，噬菌體裂解試驗(yàn)，和動(dòng)物試驗(yàn)四個(gè)步驟[2]。

1.2.4統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，顯著性檢驗(yàn)，陽性率用χ2檢驗(yàn)，陽性反應(yīng)幾何平均滴度用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1鼠疫F1抗體陽性率比較 烏蘇市古爾圖地區(qū)2010-2012年，灰 旱 獺、長尾黃鼠和牧犬血清，用ELISA和IHA檢測血清鼠疫F1抗體，結(jié)果見表1。ELISA和 IHA檢測血清鼠疫F1抗體，長尾黃鼠血清的陽性率分別為11.71%(118/1008) 和1.73% (21/1216)，差異非常顯著(χ2=93.67,P<0.001)；牧犬血清的陽性率分別為38.89% (28/72) 和10.71% (7/75) ，差異非常顯著(χ2=18.56,P<0.001)。檢測長尾黃鼠和牧犬血清鼠疫F1抗體，ELISA的陽性率高于IHA。

2.2鼠疫F1抗體滴度分布 ELISA和IHA兩種方法檢測2010-2012年間的血清鼠疫F1抗體，陽性反應(yīng)滴度分布列于表2，以ELISA的陽性標(biāo)本數(shù)計(jì)算兩種方法的平均滴度。檢測長尾黃鼠血清鼠疫F1抗體， ELISA和IHA的平均滴度分別為27.805(s 23.427)和21.254(s 22.832)，差異非常顯著(t=51.38P<0.001)；牧犬血清鼠疫F1抗體平均滴度分別為27.731(s 22.736)和21.50(s 22.611)，差異非常顯著(t=14.034P<0.001)。

2.3檢驗(yàn)鼠疫菌結(jié)果 鼠疫細(xì)菌學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)見表3。從病死灰旱獺中分離的2株鼠疫菌，跳蚤分離的鼠疫菌株較多，受跳蚤保存液中結(jié)晶紫質(zhì)量和保存時(shí)間的影響，不同年份的檢出率差異較大；長尾黃鼠鼠疫菌檢出率較高，且檢出率較穩(wěn)定。長尾黃鼠鼠疫菌檢出率與F1抗體陽性率比較見表4。

3 討 論

ELISA是目前多種疾病監(jiān)測中最常用的方法，已成為國際主流技術(shù)，敏感性和特異性大大高于IHA[3]。在鼠疫監(jiān)測中，ELISA已經(jīng)成為采用國家最多的抗體檢測方法，一些新近開展鼠疫監(jiān)測的國家，在國際組織的支持下也開始使用這種方法[4-5]。我國在5年前，就把ELISA和IHA檢測鼠疫F1抗體列入了鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS279-2008)[2]。

ELISA檢測鼠疫F1抗體試劑盒，25 ℃以下陰涼處保存60 d效價(jià)穩(wěn)定，沖洗步驟洗去與特異性反應(yīng)無關(guān)的物質(zhì)，排除溶血和腐敗物質(zhì)的干擾。酶標(biāo)抗原催化底物的顯色反應(yīng)，顯示F1抗體的含量。鼠疫F1抗原致敏紅細(xì)胞是IHA檢測鼠疫F1抗體的關(guān)鍵試劑，混懸液中醛化紅細(xì)胞吸附F1抗原的量和牢度，對溫度、pH值、離子種類和強(qiáng)度的變化十分敏感，野外現(xiàn)場工作中運(yùn)輸和保存試劑，經(jīng)常偏離適宜條件，導(dǎo)致F1抗原從醛化紅細(xì)胞表面脫落，試劑的效價(jià)降低甚至完全失效。抑制試驗(yàn)只能降低特異性凝集滴度，而不改變非特異性凝集滴度。IHA檢測嚴(yán)重溶血、腐敗標(biāo)本，常出現(xiàn)高滴度非特異性凝集，低滴度特異性凝集被高滴度非特異性凝集掩蓋，這是IHA檢測鼠疫F1抗體滴度分布缺乏低滴度陽性的主要原因。檢測長尾黃鼠和牧犬血清鼠疫F1抗體，ELISA的陽性率是IHA的6.77倍(χ2=73.67,P<0.001)和3.63倍(χ2=18.56,P<0.001)，ELISA的幾何平均滴度是IHA的6.22倍(t=51.38,P<0.001)和5.15倍(t=14.034,P<0.001)。ELISA和IHA檢測長尾黃鼠和牧犬血清鼠疫F1抗體的敏感性差異非常顯著。

IHA與ELISA檢測鼠疫F1抗體陽性率顯著性檢驗(yàn)：長 尾 黃 鼠：χ2=73.67P<0.001 牧 犬：χ2系希臘文=18.56P<0.001.

Note: The significance between IHA and ELISA in detecting plague F1 antibody:Citellusundulates--χ2=73.67,P<0.001; husbandry dog--χ2=18.56,P<0.001.

表2 兩種方法檢測長尾黃鼠和牧犬血清鼠疫F1抗體滴度分布

IHA與ELISA檢測鼠疫F1抗體平均滴度顯著性檢驗(yàn)：長尾黃鼠t=51.38P<0.001 牧犬t=14.034P<0.001.

Note: The significance between IHA and ELISA in detecting the average titer of plague F1 antibody:Citellusundulates--t=51.38,P<0.001, husbandry dog--t=14.034,P<0.001.

表3 烏蘇市古爾圖地區(qū)檢驗(yàn)鼠疫菌結(jié)果

表4 ELISA和IHA長尾黃鼠F1抗體陽性率與檢菌陽性率比較

細(xì)菌學(xué)方法分離鼠疫菌和免疫學(xué)方法檢測鼠疫F1抗體，都是鼠疫監(jiān)測的重要內(nèi)容，分離鼠疫菌試劑穩(wěn)定，技術(shù)成熟，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級小白鼠，表3顯示長尾黃鼠臟器鼠疫菌檢出率高，且檢出率穩(wěn)定。表4顯示長尾黃鼠F1抗體陽性率與鼠疫菌檢出率的比值，ELISA比值大、波動(dòng)小(8.016～8.714)，IHA比值小、波動(dòng)大(0.528～1.649)，提示ELISA檢測長尾黃鼠F1抗體是灰旱獺-長尾黃鼠鼠疫疫源地監(jiān)測的敏感穩(wěn)定的指標(biāo)。

我國開展鼠疫監(jiān)測較早，至今仍沿用2005年的全國鼠疫監(jiān)測方案，該監(jiān)測方案檢測鼠疫F1抗體只有IHA一種方法。為了能與世界同步，與周邊國家的監(jiān)測結(jié)果相比較，我國也應(yīng)當(dāng)在監(jiān)測中推廣ELISA檢測抗體方法[6]。依照新版鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS279-2008)修訂鼠疫監(jiān)測方案，增加ELISA檢測抗體方法，不僅附合方案服從標(biāo)準(zhǔn)的原則，而且可提高鼠疫診斷的準(zhǔn)確性，減少根據(jù)錯(cuò)誤檢驗(yàn)結(jié)果實(shí)施防控措施的損失。在灰旱獺-長尾黃鼠鼠疫疫源地監(jiān)測中，應(yīng)用ELISA和 IHA檢測血清鼠疫F1抗體，為修訂全國鼠疫監(jiān)測方案提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和參考資料。

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