三種重組蛋白混合抗原的間接ELISA法檢測(cè)人血清弓形蟲IgM和IgG抗體

丁邦勝，李 霞，羅慶禮，余 莉 ，沈繼龍

弓形蟲是一種專性胞內(nèi)寄生原蟲，也是機(jī)會(huì)性致病原蟲，人體獲得性感染弓形蟲后通常無明顯的臨床表現(xiàn)，但對(duì)免疫力低下的病人可引起嚴(yán)重的弓形蟲病[1-2]。母體孕期弓形蟲感染可引起死胎、流產(chǎn)、畸形和智力障礙等[3]。弓形蟲病的臨床表現(xiàn)多種多樣，僅靠臨床表現(xiàn)來診斷十分困難，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是一種非常重要的輔助手段。弓形蟲病的檢測(cè)方法雖多，但血清免疫診斷尤其ELISA檢測(cè)法仍是當(dāng)前弓形蟲感染實(shí)驗(yàn)室診斷的主要手段[4-8]。就ELISA法而言，診斷抗原的選擇和抗原的質(zhì)量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性非常重要。在以往的研究中我們已完成了剛地弓形蟲RH株pET-28a/rSAGl，pET-28a/HXGPRT和pET-28a/AK載體的構(gòu)建以及重組蛋白的免疫特異性的驗(yàn)證[9-11]；HXGPRT和AK兩種蛋白酶對(duì)弓形蟲生存作用的研究[12-15]以及用重組抗原rSAG1，rHXGPRT和rAK組合成“雞尾酒”式的多種抗原的聯(lián)合診斷對(duì)弓形蟲IgG抗體檢測(cè)的初步研究[16]。本文是以rSAG1、rHXGPRT和rAK作為檢測(cè)抗原，對(duì)66例IgM陽性和70例弓形蟲IgG血清，以及30陰性血清進(jìn)行平行檢測(cè)，探索三種抗原混合在弓形蟲病免疫診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器、試劑和菌種 上海第三分析儀器廠生產(chǎn)的UV-754紫外分光光度計(jì)；美國BIO-RAD公司的PowerPac蛋白電泳儀；美國BioTech公司的全自動(dòng)酶標(biāo)儀。蛋白純化試劑盒His·Ban Purification Kit購自Novagen公司；弓形蟲IgG和弓形蟲IgM試劑盒(Toxo-ELISA kit)，由美國Zeus(宙斯)公司生產(chǎn)；HRP標(biāo)記羊抗人IgG，IgM為華美公司產(chǎn)品；其它試劑為國產(chǎn)。含pET-28a/rSAGl,pET-28a/HXGPRT和pET-28a/AK原核表達(dá)載體的菌株為安徽醫(yī)科大學(xué)安徽病原生物學(xué)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室保種，保存條件為-80℃。

1.1.2樣本來源 陽性血清由安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科留取。共收集陽性血清132例，其中：4例IgG和IgM均陽性，62例IgM陽性IgG陰性，66例IgG陽性IgM陰性，所以實(shí)際66例IgM陽性，70例IgG陽性，兩種抗體陽性血清共136例。男31例，女101例，年齡1～88歲，這些病人血清經(jīng)Toxo-ELISA試劑盒篩選。陰性血清30例，取自體檢人群中的正常人，經(jīng)Toxo-ELISA試劑盒篩選結(jié)果為陰性。所有血清均-80℃保存?zhèn)溆?，陽性和陰性?duì)照均由進(jìn)口試劑盒所配帶。

1.2方法

1.2.1重組抗原的制備 將-80℃保存的含有弓形蟲pET-28a/rSAG1，pET-28a/HXGPRT和pET-28a/AK表達(dá)載體的菌種復(fù)蘇活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白rSAG1，rHXGPRT和rAK。按His·Band Purification Kit說明書，用6×His親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物：38.5 kDa的重組蛋白rSAG1，30 kDa的重組蛋白rHXGPRT和43 kDa的重組蛋白rAK。用SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物的純度，Western-blot驗(yàn)證重組蛋白的免疫特異性[9-11]，改良的Bradford法(考馬斯亮藍(lán)法)測(cè)定所得蛋白濃度。

1.2.2最佳檢測(cè)條件的建立 取弓形蟲IgM，IgG陽性和陰性血清各20份，每份50 μL，混勻成陽性和陰性的混合血清，進(jìn)行如下正交叉試驗(yàn)：分別將rSAGl、rHXGPRT和rAK稀釋成10、5、2.5、1.25 μg/mL四種濃度，再將相同濃度的3種重組抗原按1∶1∶1比例等體積混合，用含有不同濃度混合抗原的pH 9.6碳酸鹽緩沖液100 μL/孔包被聚苯乙烯酶標(biāo)板。陽性和陰性混合血清分別按1∶50、1∶100、1∶200進(jìn)行稀釋，加樣100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBS洗板5次。再分別加1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000稀釋度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgM，IgG抗體，37 ℃孵育30 min，PBS洗板5次， 37 ℃避光TMB顯色底物顯色10 min， 2 mol/L H2SO4終止顯色，15 min內(nèi)全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。

1.2.3精密度試驗(yàn) 按上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳檢測(cè)條件對(duì)同一份IgM，IgG陽性及以陰性混合血清重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算A450值的變異系數(shù)(CV 值) ，CV 值等于A450值的標(biāo)準(zhǔn)差除以均值。

1.2.4靈敏度試驗(yàn) 按上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳抗原濃度和最佳酶標(biāo)記羊抗人IgM和IgG抗體稀釋度為檢測(cè)檢測(cè)條件分別對(duì)IgM陽性和IgG混合血清各一份作1∶50、1∶100、1∶200、1∶400倍比稀釋進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5抑制試驗(yàn) 采用抗體抑制試驗(yàn)：取IgM和IgG陽性混合血清各20 μL，加5 μL rSAG1 (0.5 mg/ mL) 5 μL rHXGPRT(0.5 mg/ mL)和5 μL rAK(0.5 mg/ mL)，另取20 μL 的陽性混合血清，加15 μL 的PBS 作為對(duì)照，37 ℃孵育1 h后，按上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳檢測(cè)條件對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。抑制率= (對(duì)照A450值- 抑制后A450值) /對(duì)照。

1.2.6臨界值的計(jì)算 臨界值(cut off value)：按上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳檢測(cè)條件檢測(cè)30例弓形蟲抗體陰性的正常血清樣本，以正常血清OD450nm值的均數(shù)加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差為正常值上限，OD值高于上限為陽性，OD值低于上限為陰性。

1.2.7(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA法血清抗體的檢測(cè) 按上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳檢測(cè)條件分別檢測(cè)經(jīng)Zeus Toxo-ELISA試劑盒篩選的66例弓形蟲IgM陽性血清、70例弓形蟲IgG陽性血清和30例弓形蟲抗體陰性血清，設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照各兩孔。

1.2.8分析指標(biāo)χ2檢驗(yàn)結(jié)果；敏感性(%)為對(duì)Zeus Toxo-ELISA試劑盒篩選出的弓形蟲抗體陽性血清的檢出率；特異性(%)為正常人的陰性率；總符合率為兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致的標(biāo)本數(shù)/檢測(cè)標(biāo)本總數(shù)×100。

2 結(jié) 果

2.1重組抗原的純度及濃度 弓形蟲SAG1，HXGPRT和AK三種融合基因表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+親和層析法純化后，我們獲得了較純的重組融合蛋白：rSAG1，rHXGPRT和rAK。用捷達(dá)凝膠成像系統(tǒng)軟件分析SDS-PAGE電泳結(jié)果，表明3種重組蛋白抗原純度均可達(dá)90%以上；改良的Bradford法測(cè)定重組蛋白含量分別為rSAGl：1.83 mg/mL ；rHXGPRT：3.51 mg/mL；rAK：2.16 mg/mL。各重組蛋白抗原均與陽性抗血清有免疫反應(yīng)性，已經(jīng)Western-blot試驗(yàn)得到驗(yàn)證[9-11]。

2.2最佳條件 正交叉試驗(yàn)結(jié)果顯示間接ELISA法3種重組抗原混合(rSAG1+rHXGPRT+rAK)檢測(cè)弓形蟲IgM最佳條件：各單一抗原濃度分別為5 μg/mL ；血清稀釋度為1∶100；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgM抗體的稀釋度為1∶4 000；正交叉試驗(yàn)結(jié)果顯示間接ELISA法3種重組抗原混合(rSAG1+rHXGPRT+rAK)檢測(cè)弓形蟲IgG最佳條件：各單一抗原濃度分別為5 μg/mL；血清稀釋度為1∶50；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體的稀釋度為1∶4 000。

2.3精密度試驗(yàn) 同一份弓形蟲IgM陽性及陰性混合血清重復(fù)檢測(cè)20次，陽性血清A450值的變異系數(shù)(CV) 值為12.3%，陰性血清A450值的變異系數(shù)(CV) 值為10.2%。同一份弓形蟲IgG陽性及陰性混合血清重復(fù)檢測(cè)20次，陽性血清A450值的變異系數(shù)(CV) 值為14.5%，陰性血清A450值的變異系數(shù)(CV) 值為11.9%。

2.4靈敏度試驗(yàn) 弓形蟲混合血清陽性結(jié)果稀釋度：IgM為1∶50至1∶200。IgG在1∶50至1∶400之間。

2.5抑制試驗(yàn) IgM：對(duì)照組A450均值為0.86，抑制組A450均值為0.23，特異性抑制率為73.3%。IgG：對(duì)照組A450均值為1.25，抑制組A450均值為0.33，特異性抑制率為73.6%。

2.6Cut off值的確定 30例進(jìn)口試劑盒檢測(cè)IgM為陰性的人血清OD450nm平均值為0.23，標(biāo)準(zhǔn)差為0.11，臨界值為0.45，測(cè)定血清OD450nm值≥0.45，判斷為陽性，測(cè)定血清OD450nm值<0.45為陰性。30例進(jìn)口試劑盒檢測(cè)IgG為陰性的人血清OD450nm平均值為0.31，標(biāo)準(zhǔn)差為0.10，臨界值為0.51，測(cè)定血清OD450nm值≥0.51，判斷為陽性，測(cè)定血清OD450nm值<0.51為陰性。

2.8IgM檢測(cè)結(jié)果比較 (rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA與Zeus Toxo-ELISA試劑盒檢測(cè)IgM結(jié)果比較：66例IgM陽性血清中，59例陽性，7例假陰性。30例陰性血清中29例為陰性，有1例假陽性。χ2值為3.12，P>0.05，兩法檢測(cè)結(jié)果差異無顯著性，見表1。

表1(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA法與ZeusToxo-ELISA試劑檢測(cè)IgM結(jié)果比較

Tab.1Comparisonof(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISAandZeusToxo-ELISAindetectionofIgMantibodiestoT.gondii

(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISAZeus Toxo-ELISAPositiveNegativeTotalPositive59160Negative72936Total663096

2.9IgG檢測(cè)結(jié)果比較 (rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA法與Zeus Toxo- ELISA試劑盒檢測(cè)IgG比較結(jié)果：70例IgG陽性血清中，68例為陽性，2例為假陰性。30例陰性樣本中28例為陰性，2例假陽性。χ2值為0.25，P>0.05，兩法檢測(cè)方法結(jié)果無顯著性差異，見表2。

表2(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA法與ZeusToxo-ELISA試劑檢測(cè)IgG結(jié)果比較

Tab.2Comparisonof(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISAandZeusToxo-ELISAindetectionofIgGantibodiestoT.gondii

(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISAZeus Toxo-ELISAPositiveNegativeTotalPositive68270Negative22830Total7030100

2.10敏感性、特異性、總符合率和約登指數(shù) 以Toxo-ELISA試劑檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，(rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA法檢測(cè)66例IgM陽性、30例陰性、70例IgG陽性血清結(jié)果：66例IgM陽性血清，出現(xiàn)7例假陰性，敏感性為89.4%；30例陰性血清，出現(xiàn)1例假陽性，特異性為96.7%，總符合率為91.7%，約登指數(shù)為0.861；70例IgG陽性血清，結(jié)果出現(xiàn)2例假陰性，敏感性為97.1%；30例陰性血清，出現(xiàn)2例假陽性，特異性為93.3%，總符合率為96.0%，約登指數(shù)為0.904。結(jié)果見表3。

3 討 論

臨床上客觀評(píng)價(jià)弓形蟲免疫學(xué)診斷試劑較為困難，原因是缺少病原體檢測(cè)陽性的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前弓形蟲感染的診斷主要采用ELISA法檢測(cè)病人血清中的特異性IgM和IgG抗體，以及DNA診斷。前者的市售試劑盒主要分為國產(chǎn)和進(jìn)口兩類。一般認(rèn)為進(jìn)口試劑質(zhì)量較好，但價(jià)格昂貴、成本較高，增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。國產(chǎn)試劑質(zhì)量尚缺少全面的評(píng)價(jià)[8,17-19]。據(jù)報(bào)道國產(chǎn)試劑ELISA法所用抗原大都是全蟲蛋白的粗制抗原[20-21]，粗制抗原的制備多采用弓形蟲RH株速殖子全蟲抗原，在制備過程中需要利用動(dòng)物傳代或細(xì)胞培養(yǎng)，不僅成本較高，實(shí)驗(yàn)要求條件嚴(yán)格，而且有實(shí)驗(yàn)室感染的危險(xiǎn)。另外，制備的抗原室間和批間差異較大，難以標(biāo)準(zhǔn)化，所以不同商家不同批號(hào)試劑檢測(cè)結(jié)果的符合率不盡人意。

表3 (rSAG1+rHXGPRT+rAK)-ELISA檢測(cè)166例血清結(jié)果

SAG1是弓形蟲的表面抗原，其氨基酸序列相對(duì)保守，幾乎存在于所有的弓形蟲蟲株中，對(duì)應(yīng)的IgG抗體在急性期和慢性期都有較高的滴度，但不適于緩殖子引起的隱性感染檢測(cè)，也難以區(qū)分急、慢性弓形蟲病[22]。HXGPRT(次黃嘌呤-黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)和AK(腺苷激酶)是弓形蟲核苷酸補(bǔ)救合成途徑的關(guān)鍵酶，這兩種酶存在于弓形蟲生活史的各個(gè)時(shí)期，包括隱性感染的緩殖子階段和顯性感染的速殖子階段。以往的研究中已證明了rHXGPRT和rAK的抗原性和免疫特異性[10-11]， rHXGPRT和rAK作為弓形蟲免疫診斷抗原有較高的價(jià)值。本次研究采用弓形蟲rSAG1 rHXGPRT和rAK 3種重組蛋白作為抗原的“雞尾酒”式組合檢測(cè)，并用進(jìn)口試劑篩查的同一批次血清，對(duì)弓形蟲IgM和IgG抗體進(jìn)行了平行檢測(cè)。結(jié)果，檢測(cè)IgM的敏感性和特異性分別為89.4%和96.7%，高于Jalallou N[23]和談?dòng)里w[24]等只用rSAG1一種抗原的檢測(cè)；檢測(cè)IgG敏感性和特異性分別97.1%和93.3%，與進(jìn)口試劑盒總符合率為96.0%，高于司進(jìn)等[25]只用rSAG1一種抗原的檢測(cè)結(jié)果。組合檢測(cè)試劑彌補(bǔ)了單一rSAG1抗原漏檢抗緩殖子抗體的不足。由于三種重組抗原提高了抗原純度，因此也增強(qiáng)了檢測(cè)的敏感性和特異性。本研究的間接ELISA法rSAG1、rHXGPRT和rAK 3種抗原混合對(duì)IgM和IgG兩種抗體的檢測(cè)結(jié)果和Aubert D等[26]用多個(gè)重組抗原混合效果相符，均表明混合重組抗原比單一重組抗原檢測(cè)弓形蟲IgM和IgG效果更好。

本次研究顯示3種重組抗原rSAG1、rHXGPRT和rAK混合的間接ELISA法檢測(cè)弓形蟲IgM和IgG抗體具有較高的敏感性、特異性，與進(jìn)口Toxo-ELISA試劑的檢測(cè)結(jié)果相比較總符合率高，試劑易于標(biāo)準(zhǔn)化，減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，為臨床弓形蟲病的檢測(cè)試劑的國產(chǎn)化奠定基礎(chǔ)。

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