云南騰沖縣新分離乙型腦炎和蓋塔病毒的分子生物學(xué)特征

馮 云，李勝國，張海林，付士紅，康顯虎，寸待啟，郭 超，章域震，楊衛(wèi)紅，王環(huán)宇，梁國棟

云南西部騰沖縣自古以來就是中國與緬甸的重要通商口岸，邊境貿(mào)易及人員往來頻繁。近幾年來，中國在“史迪威公路”基礎(chǔ)上建造了“騰-密公路”(中國騰沖至緬甸密支那)，該公路的建成使得中緬邊境貿(mào)易得到迅速發(fā)展，也增加了各種傳染病傳播的風(fēng)險。因此，我們對騰沖縣蚊蟲中新分離的20株流行性乙型腦炎病毒(Janpanese encephalitis virus, JEV)和1株蓋塔病毒(Getah virus, GETV)進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1蚊蟲采集和病毒分離 在騰沖縣人房和畜圈用玻璃吸蚊管和誘蚊燈(“功夫小帥”牌，光催化誘蚊器，武漢市吉星環(huán)保科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品)采集蚊蟲標(biāo)本。誘蚊燈每天采集時間段為19:00至次日7:00共12 h。吸蚊管人工捕蚊法每天采集時間段為19:00至22:30。捕獲蚊蟲經(jīng)分類鑒定，分批放入2 mL凍存管，液氮保存運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，蚊蟲標(biāo)本經(jīng)研磨后，取上清液接種C6/36和BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，連續(xù)3代出現(xiàn)規(guī)律細(xì)胞病變判為陽性。

1.2病毒鑒定 陽性分離物上清液用QIAamp Viral RNA Mini Kit(美國QIAGEN公司)提取病毒RNA，Amersham Bioscience Ready-to-GoTM You First-Strand Beads(美國Amersham Pharmacia Biotech公司)制備cDNA。取2 μL cDNA做反應(yīng)模板。用JEV的PreM、E基因和GETV的E2、Capsid基因特異性引物(表1)[1-2]，TaKaRa LA Taq 試劑盒完成RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。

所有測序在北京博邁德科技發(fā)展有限公司完成。使用DNAstar軟件包中的SeqMan對序列片段進(jìn)行拼接、編輯、校正。Clustal X(1.8)、MEGA3.1和DNAStar軟件包中的MegAlign及GeneDoc等生物學(xué)軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析和核苷酸、氨基酸序列分析。

表1 本研究中病毒鑒定使用的引物信息

Note: F means forward primer; R means reverse primer. Y, C/T; M， C/A.

2 結(jié) 果

2.1病毒分離 在騰沖縣共捕獲蚊蟲4屬25種26 702只，分為310批進(jìn)行研磨。其中有21批蚊蟲標(biāo)本能引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞產(chǎn)生規(guī)律病變。經(jīng)JEV PreM、E基因和GETV E2、Capsid基因特異性引物用RT-PCR方法對陽性分離物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果20株為JEV陽性，其中15株分離自三帶喙庫蚊(Culextritaeniorhynchus)，3株分離自中華按蚊(Anophelessinensis)，2株分離自騷擾阿蚊(Armigeressubalbatus)；另1株為GETV陽性，分離自偽雜鱗庫蚊(Culexpseudovishnui)(表2)。

2.2JEV系統(tǒng)進(jìn)化分析 新分離的20株JEV與來源于GenBank中不同國家、不同年代的4個基因型的56株乙腦病毒PreM基因的240個核苷酸序列構(gòu)建PreM基因核苷酸進(jìn)化樹提示，其中14株(YNTC07008、YNTC07012、YNTC07020、YNTC07028、YNTC07046、YNTC07099、YNTC07109、YNTC07172、YNTC07255、YNTC07257、YNTC07259、YNTC07273、YNTC07290、YNTC07295)與2004年四川省分離株SC04-25、河南省分離株HN04-21的親緣關(guān)系最近；6株(YNTC07011、YNTC07018、YNTC07101、YNTC07111、YNTC07177、YNTC07292)與2001年上海的分離株SH-53處于同一進(jìn)化簇中，親緣關(guān)系更接近(圖1)。新分離的20株JEV與既往5個基因型別的58株乙腦病毒E基因的1500個核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)化樹提示15株(YNTC07008、YNTC07012、YNTC07020、YNTC07028、YNTC07046、YNTC07099、YNTC07101、YNTC07109、YNTC07172、YNTC07255、YNTC07257、YNTC07259、YNTC07273、YNTC07290、YNTC07295)與2004年四川省分離株SC04-25處于同一進(jìn)化簇中；5株(YNTC07011、YNTC07018、YNTC07111、YNTC07177、YNTC07292)與2001年上海的分離株SH-53處于同一進(jìn)化簇中(圖2)。新分離JEV與日本、韓國和越南的JEV在E基因的進(jìn)化關(guān)系上較近，但與泰國分離株的進(jìn)化關(guān)系稍遠(yuǎn)(圖2)。經(jīng)過對新分離的20株JEV的PreM和E基因的系統(tǒng)樹分析表明，本次分離的20株JEV都屬于基因Ⅰ型，與我國其它地區(qū)近年來分離到的Ⅰ型JEV的進(jìn)化關(guān)系很近，20株新分離的JEV又分別處于基因Ⅰ型乙腦病毒的兩個次級分支中，說明它們之間還是存在一定的差異。

表2 蚊蟲標(biāo)本陽性分離物的背景資料

2.3JEV核苷酸同源性和氨基酸位點(diǎn)分析 新分離20株JEV 的PreM基因核苷酸差異度為0.0%～9.2%，其中YNTC07028株與其它分離株的差異度最大，表明當(dāng)?shù)卮嬖诓煌晗档腏EV流行株。這20株JEV與減毒活疫苗(SA14-14-2株)在PreM區(qū)段的共同差異位點(diǎn)位于第64位氨基酸，由T→A。此外，YNTC07011、YNTC07018、YNTC07101、YNTC07111、YNTC07177、YNTC07292株與SA14-14-2株在PreM區(qū)段的共同差異位點(diǎn)位于第2位氨基酸，由I→T；YNTC07046株與SA14-14-2株在PreM區(qū)段的差異位點(diǎn)位于第45位氨基酸，由A→T；YNTC07028株與SA14-14-2株在PreM區(qū)段的差異位點(diǎn)有10個，分別位于第3、4、7、44、45、47、55、57、64、71位氨基酸上。

新分離的20株JEV之間的E基因核苷酸同源性為96.5%～100%，氨基酸的同源性為97.2%～100%，存在一定差異；這20株JEV與SA14-14-2株的核苷酸同源性為87.5%～88.3%，氨基酸同源性為96.4%～97.2%。E蛋白是決定JEV毒力的重要組成[3]，其中有8個位點(diǎn)非常重要[4]，20株新分離株在這8個位點(diǎn)的差異與其它基因Ⅰ型JEV一致，而E138是影響JEV毒力最重要的位點(diǎn)，如果該位點(diǎn)由谷氨酸(E)替換成賴氨酸(K)，則病毒的神經(jīng)毒力就會明顯降低[5]。通過測定新分離株的E138位點(diǎn)都是谷氨酸，說明毒力較疫苗株強(qiáng)。通過對比本研究得到的結(jié)果從分子生物學(xué)的角度證實(shí)了減毒活疫苗SA-14-14-2株能夠有效保護(hù)當(dāng)?shù)匦路蛛x的JEV流行株的感染。

圖1以PreM基因?yàn)榛A(chǔ)的系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig.1PhylogeneticanalysisofJEVisolatesbasedonPreMgenesequence

2.4GETV系統(tǒng)進(jìn)化分析 用新分離的YNTC07180與GenBank中其它地區(qū)和年代的11株GETV的Capsid基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹， YNTC07180株與以往云南分離株YN0540位于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近(圖3)，而1955年分離自馬來西亞的M2021株位于GETV進(jìn)化分支的根部，與YNTC07180株的親緣性較遠(yuǎn)。

2.5GETV核苷酸同源性和氨基酸位點(diǎn)分析 YNTC07180株的Capsid基因與以往云南分離株YN0540的同源性最高，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.2%和99.3%，表明具有明顯地域特征。YNTC07180株與1955年分離自馬來西亞的M2021株的核苷酸序列同源性最低。依據(jù)GETV代表株(M1)的Capsid基因全長為801nt，編碼長267個氨基酸的結(jié)構(gòu)衣殼蛋白進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)分析，將YNTC07180株與來自日本(Sagiyama virus, SAGV)、馬來西亞(M2021株)、韓國(GETV SouthKorea)、俄羅斯(LEIV/16275/Mag)、蒙古(LEIV/17741/MPR)以及中國河北分離株(HB0215-3、HB0234)、云南分離株(YN0540)、海南分離株(Alphavirus M1)等的Capsid基因序列進(jìn)行比對，Capsid基因編碼的267個氨基酸中，YNTC07180與M1有2個氨基酸差異位點(diǎn)，第211位(Q→R)和第231位(L→F)。GETV的E2基因有1 266個核苷酸，編碼422個氨基酸的病毒包膜糖蛋白，E2蛋白是GETV與宿主細(xì)胞受體相互作用的最重要的表面蛋白，也是病毒誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要結(jié)構(gòu)蛋白。新分離株與其它的17株GETV的E2基因的核苷酸同源性在94.8%～99.9%之間，氨基酸同源性在97.6%～100%之間。YNTC07180分離株與M1的氨基酸差異位點(diǎn)是E2-5(H→D)、E2-109(G→D)、E2-368(V→A)和E2-374(C→G)。

圖2以E基因?yàn)榛A(chǔ)的系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig.2PhylogeneticanalysisofJEVisolatesbasedonEgenesequence

圖3云南省GETV分離株Capsid基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig.3PhylogeneticanalysisofGETVisolatesbasedonCapsidgenesequence

3 討 論

近10多年，先后在云南省分離到10余種蟲媒病毒，其中流行性乙型腦炎是云南省分布最廣，發(fā)病最多，危害最大的一種蟲媒病毒病，并證實(shí)云南省JEV宿主動物和傳播媒介種類多，分布廣[6-8]。本次序列分析表明分離自騰沖縣的20株JEV均為基因Ⅰ型。20世紀(jì)80和90年代，我們在云南省分離到的JEV幾乎都是基因Ⅲ型[9-10]，近幾年相繼在云南各地分離到基因Ⅰ型JEV[11-12]。本研究為首次證實(shí)云南省騰沖縣存在基因Ⅰ型JEV流行，提示基因Ⅰ型已逐步取代基因Ⅲ型成為云南省JEV主要流行型，具有重要流行病學(xué)意義。

對新分離的20株JEV的PreM和E基因核苷酸和氨基酸同源性分析表明，它們之間仍然存在一定差異，尤其是PreM基因核苷酸差異度范圍較大，如YNTC07028株與其它病毒株差異度高達(dá)9.2%，提示當(dāng)?shù)卮嬖诓煌晗档腏EV。根據(jù)圖1和圖2系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，無論P(yáng)reM或E基因均可將本次分離的20株JEV區(qū)分為兩個進(jìn)化分支，表明當(dāng)?shù)卮嬖趦蓚€株系的JEV流行。這20株JEV與我國和東南亞國家近幾年分離的基因Ⅰ型JEV相比，雖然它們間的同源性較高，但仍存在一定差異，而這些差異可能與不同地域JEV流行株為了適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境和媒介生物，導(dǎo)致病毒在進(jìn)化中發(fā)生一些細(xì)微的改變。綜合以上分析，我們認(rèn)為，云南JEV與其它省份和國家流行株間雖有一些差異，但它們的抗原和毒力關(guān)鍵位點(diǎn)未發(fā)生明顯變異，表明自然界JEV具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

GETV是披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus, SFV)復(fù)合組中的一個成員，于1955年首次在馬來西亞蚊蟲中分離到，主要分布在亞洲及澳大利亞北部地區(qū)[13-14]。我國于1964年在海南首次分離到GETV(M1株)，時隔38年后又在我國北方的河北省分離到兩株，隨后相繼在我國其它省份分離到該病毒。目前在我國河北、上海、云南、遼寧和甘肅等省市共分離到10余株GETV[2]。提示該病毒在我國分布較廣。GETV在人群中的感染和致病情況尚不清楚，但國外研究已證實(shí)，GETV是馬和豬等家畜疾病的重要病原體[13-14]。因此，我國應(yīng)加強(qiáng)GETV的分布及其與動物疾病關(guān)系的研究，深入開展我國GETV分離株與東南亞國家分離株的分子遺傳研究，評價它們的公共衛(wèi)生意義是當(dāng)前面臨的重要任務(wù)。

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