人絲氨酸蛋白酶抑制因子抗腫瘤作用的研究進展

王雪蕾，倫永志

大連大學 醫(yī)學院，遼寧省高校生物物理學重點實驗室，遼寧 大連 116622

絲氨酸蛋白酶抑制因子（serine protease inhibitor，Serpin）具有保守的核心結構，由包含3 個β折疊（A、B、C）和7～9 個α螺旋的370～390 個氨基酸殘基組成，因而被定義為Serpin 蛋白超家族。該蛋白家族成員在細菌、植物、多細胞生物組織及某些病毒中均有發(fā)現(xiàn)。Serpin 可在胞內(nèi)、胞外，甚至細胞核內(nèi)發(fā)揮生物學活性。在人體內(nèi)，血漿Serpin 占血循環(huán)總蛋白的2%～10%，在凝血-抗凝作用、免疫炎癥反應、激素轉運、神經(jīng)生長及血藥調節(jié)方面起重要作用[1]。Serpin 的其他功能包括抗多蛋白激活的組織保護作用、調節(jié)血管生成反應、影響細胞或組織的增殖和凋亡及調節(jié)細胞外基質的重塑，還有很重要的功能就是本文所述與腫瘤生長、侵襲和擴散有關的功能。部分Serpin的功能與蛋白酶抑制相關，而某些Serpin只保持了其基本結構，如卵白蛋白和血管緊張素原，它們的抑制作用與蛋白活性無關。

1 絲氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制因子在腫瘤生長和代謝中的作用

Serpin 的蛋白酶抑制作用依賴于它本身的獨特結構，即反應活性部位環(huán)（RSL），它含有選擇性蛋白酶識別位點。RSL 是由約17 個氨基酸殘基在β折疊A 與C 之間形成的環(huán)，RSL 暴露在Serpin 的表面，可以與目標蛋白酶以非共價鍵的結合形成Serpin-蛋白酶中間體，從而抑制蛋白酶的活性。目標絲氨酸蛋白酶在Serpin 上P1-P1'鍵間切割RSL，同時絲氨酸蛋白酶與P1 殘端共價結合，而切割后RSL 插入β折疊A，同時攜帶絲氨酸蛋白酶到Serpin 的另一端。RSL 的構型變化改變了絲氨酸蛋白酶的活性位點，導致絲氨酸蛋白酶受限，從而失去了蛋白酶水解活性。

惡性腫瘤的發(fā)生是由于多種生物活動失調導致的。腫瘤細胞及其周圍間質細胞的多種生物活動均可促進原發(fā)性腫瘤的生長，該過程包括了絲氨酸蛋白酶及其抑制因子的參與。其中一種絲氨酸蛋白酶是尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA），它可以激活纖溶酶原轉化為有活性的蛋白，即纖溶酶。uPA和組織型纖溶酶原激活劑（tPA）伴有纖溶酶，可活化基質金屬蛋白酶（MMP），繼而激活MMP，使膠原蛋白和彈性蛋白降解酶。尿激酶型纖溶酶原受體（uPAR）表達在遷移細胞的前緣，uPA 與受體結合后誘導細胞外基質（ECM）發(fā)生局灶性蛋白水解，促進腫瘤細胞、免疫細胞及血管內(nèi)皮細胞的遷移。同時，uPAuPAR 復合物通過整合素和其他胞膜受體間的相互作用發(fā)出胞內(nèi)信號，與脂筏復合物uPAR 連接，調節(jié)細胞粘連、遷移和增殖作用。由于uPA-uPAR 復合物的作用多樣化，該復合物與多種人類癌癥疾病相關，且Serpin 可調節(jié)uPA-uPAR 系統(tǒng)，所以該過程可以影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。非抑制性Serpin 可能通過其他不同機制，對腫瘤生長、凋亡、侵襲和血管再生也有一定影響。下面將對各種與腫瘤相關聯(lián)的人Serpin進行更深入的闡述。

2 纖溶酶原激活劑抑制因子1（PAI-1，Serpine-1）

PAI-1 是抑制性Serpin，可以抑制uPA和tPA 的活性。PAI-1 在血循環(huán)中的主要調節(jié)纖溶作用，當玻連蛋白和肝素同時存在時，PAI-1 可以抑制凝血酶的活性。當出現(xiàn)血管損傷和/或多種炎性細胞因子時，血液中PAI-1 水平會有所提高。在血栓形成過程中，PAI-1 從血小板中釋放，與tPA 結合并抑制其作用，阻止血栓中纖維蛋白溶解。然而在血管外，PAI-1 具有通過抑制tPA 調節(jié)基質重塑和細胞黏附的作用。

基于uPA-uPAR 復合物對癌癥進展具有明確生物作用，有人提出預測，像PAI-1 的uPA 抑制因子具有抗腫瘤活性。然而，循環(huán)血液中PAI-1 水平的提高與幾種人類惡性腫瘤的不良預后成正相關[3]。雖然這一結論暫時尚未有明確解釋，但可以推測，PAI-1 可能促進某種促進腫瘤生長的介質的釋放，如促腫瘤介質；也可能提高某種阻止腫瘤進展的天然宿主水平。據(jù)稱，PAI-1 在低濃度時可以促進血管再生，而在較高水平則體現(xiàn)抑制血管再生的作用，因此可以得出PAI-1具有一個潛在的抗腫瘤生長或促腫瘤生長的作用。多方數(shù)據(jù)顯示，PAI-1 在調節(jié)惡性腫瘤細胞遷移、血管再生、惡性腫瘤細胞凋亡和增殖的作用中，最后的效應可能是促進腫瘤生長，也可能是抑制腫瘤生長。

細胞遷移需要“黏附-脫離-再黏附”的循環(huán)過程，該過程由uPAR-整合素共受體控制[4]。PAI-1 與uPAR和整合素競爭性結合玻連蛋白誘導細胞脫離。PAI-1 與uPA-uPAR 復合物結合，通過低密度脂蛋白受體相關蛋白-1（LRP1）介導的內(nèi)吞作用，引發(fā)uPA-uPAR 復合物內(nèi)化，從而去黏附[5]。PAI-1 也可以通過LRP1 介導整合素的內(nèi)化，使整合素從ECM 脫離。內(nèi)化后的整合素和uPAR 再次分布在遷移細胞的前緣，為細胞的再黏附和遷移提供支持。此外，不同形式的PAI-1，包括活化的、潛伏期的以及裂解的，均可與LRP1 直接作用，通過酪氨酸激酶信號傳導途徑及轉錄激活分子通路的激活，增強細胞運動。在人結直腸腺癌細胞系SW620 的體外實驗中，基質限制性PAI-1 對該細胞的變形遷移有至關重要的作用[6]。

被細胞外基質彈性蛋白裂解的PAI-1、纖溶酶及MMP3均可直接與LRP1結合，通過絲裂原活化蛋白激酶（MAP）途徑誘導產(chǎn)生胞內(nèi)信號，同樣可以促進細胞增殖。

最新實驗數(shù)據(jù)也表明，PAI-1 在部分人惡性腫瘤細胞，如纖維肉瘤細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞及早幼粒細胞性白血病細胞中，具有抗凋亡作用[7-9]。實驗中將PAI-1 缺陷的小鼠纖維肉瘤細胞與野生型纖維肉瘤進行對比，發(fā)現(xiàn)缺陷組細胞對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和廣譜化療藥物具有更高的敏感性[9]。

Bajou 等通過PAI-1 缺陷小鼠實驗證明，PAI-1在移植惡性角質細胞的侵襲和血管再生過程中起關鍵作用[10]。如前所述，在腫瘤生長的微環(huán)境中，PAI-1 在生理（低）濃度下促進血管再生，而在高濃度則抑制血管再生[11]。有研究認為PAI-1 的促血管再生作用與纖溶酶介導的Fas 配體裂解有關。Fas 配體裂解引起PAI-1 抑制，從而阻止上皮細胞凋亡[12]。在Nishioka 等的實驗性治療研究中，利用RNAi 技術敲除人胃癌細胞株的PAI-1 基因，建立一個PAI-1缺陷人胃癌細胞株，移植到小鼠腹腔后，缺陷組腫瘤生長大幅降低，且血性腹水明顯減少，提示PAI-1的潛在作用可能是拮抗抑制惡性腫瘤細胞的轉移[13]。

3 乳腺絲抑酶（Maspin，Serpinb-5）

Maspin 是一種非抑制性Serpin，具有重要的生理功能和腫瘤抑制作用。Maspin在發(fā)育早期的作用尤為重要，通過基因敲除該基因的小鼠可致胚胎死亡[14]。Maspin 在早期發(fā)揮作用主要是通過調節(jié)滋養(yǎng)層細胞入侵。成年后，Maspin在多組織中表達，包括上皮細胞、乳腺上皮細胞、內(nèi)皮細胞及眼角膜基質細胞。有研究發(fā)現(xiàn)，Maspin 在孕期和哺乳期乳腺形態(tài)形成過程中有重要作用，且可以調節(jié)角膜傷痕愈合過程[15-16]。

Maspin 在很多類型的惡性腫瘤中表達增強，而且與好的預后相關，這一發(fā)現(xiàn)體現(xiàn)該Serpin 具有腫瘤抑制作用，且與PAI-1 不同[17]。但是，同樣也有大量臨床數(shù)據(jù)顯示Maspin 在部分惡性腫瘤中有促腫瘤生長的功能。該領域的研究人員表示，Maspin 在功能上的差異是因為Maspin 在不同惡性腫瘤細胞中定位不同[18]。例如，定位在細胞核的Maspin 具有抑腫瘤作用，而胞質內(nèi)的Maspin 則體現(xiàn)促腫瘤轉移作用。因此，Maspin在惡性腫瘤中的作用，必須在特定組織中對Maspin 定位及其他相關因素進行測定才能有結論。

Maspin的腫瘤抑制作用與腫瘤細胞遷移和侵襲的抑制、血管再生的抑制，以及腫瘤細胞對凋亡的高敏感性密切聯(lián)系。Maspin 處理后的乳腺癌細胞中，Rac1 蛋白和細胞分裂周期蛋白Cdc42 活性降低，引起受損的細胞骨架重排并發(fā)生細胞遷移[19]。Maspin調節(jié)細胞遷移的作用機制可能是改變整合素的表達模式和功能，人乳腺癌細胞經(jīng)重組Maspin（rMaspin）處理后，α5β1和α3β1整合素表達上調，α2β1整合素表達減少。整合素表達模式的這一改變，可能提高細胞對纖連蛋白的黏附作用，使基質富含纖連蛋白，從而減少細胞侵襲[20]。

內(nèi)源性及轉染的Maspin 基因表達后，均能提高乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肺癌細胞及骨肉瘤細胞對星狀孢菌素的敏感性。但是，經(jīng)rMaspin處理的惡性腫瘤細胞沒有這種效果[21]。

Maspin的腫瘤抑制作用同樣源于其抗血管再生作用。在前列腺癌體內(nèi)模型中，不論是經(jīng)rMaspin處理，還是內(nèi)源性Maspin 表達，均能有效抑制新血管形成。大量臨床數(shù)據(jù)也顯示，Maspin在結腸癌、膀胱癌、乳腺癌、喉癌、頭頸部鱗狀細胞癌及黑色素瘤中，具有抑制新血管形成的作用。Maspin的抗新血管形成作用與其促進細胞凋亡，同時抑制內(nèi)皮細胞遷移有關。Li 等研究發(fā)現(xiàn)，當腺病毒工程菌在血管內(nèi)皮細胞靶向表達Maspin 時，腫瘤內(nèi)血管將變成疏松多孔結構，且易滲透，而血管的滲透性增加極有可能是由血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡引起的[22]。血管內(nèi)皮細胞Maspin 過表達，將提高Bax 水平，同時降低Bcl-2 水平。rMaspin 可增強內(nèi)皮細胞黏附作用，同時通過整合素信號傳導途徑抑制內(nèi)皮細胞遷移。人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）經(jīng)rMaspin 處理后，可提高整合素連接酶活性，并提高黏著斑激酶（FAK）的磷酸化作用。rMaspin 作用后的HUVEC 在堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）刺激培養(yǎng)下，Rac1 蛋白和Cdc42 活性水平急劇下降，引起黏著斑分離減少，內(nèi)皮細胞遷移受到抑制。

綜上Maspin 的抗腫瘤作用，不論是單獨用藥還是聯(lián)合用藥，Maspin 具有發(fā)展為可行性抗癌藥物的潛力。但Maspin 在不同腫瘤類型和不同分期，以及在細胞中定位不同時，其抗腫瘤效果不盡相同，因此，Maspin作為治療藥物的前提是，必須根據(jù)腫瘤類型及腫瘤分期具體分析后選用藥物。

4 色素上皮細胞衍生因子（PEDF，Serpin-f1）

色素上皮細胞衍生因子（PEDF）的相對分子質量約為50×103，是在人體內(nèi)廣泛表達的分泌性非抑制性Serpin。PEDF 最早于人類胎兒的視網(wǎng)膜色素上皮細胞中被發(fā)現(xiàn)。PDEF具有廣泛的生物學活性，包括免疫調節(jié)、細胞保護、細胞分化和腫瘤抑制。體外實驗表明，在大多數(shù)腫瘤和腫瘤細胞中，PEDF 有不同程度的表達缺失或下調[23]。此外，動物體內(nèi)模型實驗及大量臨床數(shù)據(jù)顯示，低PEDF 表達水平與腫瘤侵襲性增加和癌癥的不良預后有關，如前列腺腫瘤、胰腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、肝細胞癌及腎母細胞瘤，提示PEDF具有腫瘤抑制作用。

PEDF 的抗腫瘤活性，是因為其具有抗增殖、促分化、促凋亡及抗血管生成作用。體外組織培養(yǎng)的幾種人惡性腫瘤細胞經(jīng)PEDF 處理后，表現(xiàn)為增殖減少。體外培養(yǎng)的人肺癌細胞株A549，通過核酶將其PEDF 表達下調后，A549 增殖速度急劇上升[24]。此外，PDEF 引起神經(jīng)母細胞瘤分化，使其向低惡性表型發(fā)展[25]。

PEDF 可以通過促進腫瘤細胞凋亡而抑制腫瘤生長。PEDF 過表達時，可誘導黑色素瘤細胞G361凋亡增加，該凋亡作用可通過中和Fas 配體阻斷，以此說明PEDF 誘導凋亡至少有一部分是通過Fas/FasL 信號途徑?？梢钥隙ǖ氖?，PEDF 可以上調Fas配體的表達，從而誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡[26]。此外，PEDF 也可能通過調節(jié)Bcl-2 蛋白家族誘導產(chǎn)生凋亡作用。Zhang 等發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質瘤細胞A172和U87在經(jīng)PEDF 處理后均有細胞凋亡發(fā)生，該促凋亡作用與p53和Bax上調，以及Bcl-2下調有關。PEDF的促凋亡作用還有可能是通過下調細胞FLICE 抑制蛋白（cFLIP）表達而體現(xiàn)的，cFLIP 能禁止caspase-8的作用，從而阻止細胞凋亡的啟動[27]。

PEDF 是迄今發(fā)現(xiàn)的作用效果最明顯的內(nèi)源性血管形成抑制因子。在很多人類惡性腫瘤，包括前列腺癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質瘤、淋巴血管瘤及非小細胞肺癌等中，PEDF 水平下降，同時可見腫瘤內(nèi)具有更高的瘤內(nèi)血管密度（MVD）及更強的侵襲性。PEDF 主要通過以下2 種方式體現(xiàn)其抗血管形成作用。第一，PEDF通過激活FasR/FasL途徑，誘導新生血管的內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡[28]；第二，PEDF 通過中和作用，抵消血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的作用。例如，VEGF和bFGF 引起活化T 淋巴細胞核因子（NFAT）的去磷酸化，激活促新血管形成的轉錄；而PEDF 可以通過c-Jun 氨基端激酶（JNK）依賴途徑對NFAT 重新磷酸化，失活其血管再生作用。PEDF 的抗血管再生活性只靶向作用于新生血管系統(tǒng)，而對已存在的血管無作用[29]，因此，PEDF 具有潛在抗癌價值，阻止有利于腫瘤生長的新血管再生，達到靶向治療癌癥效果。研究證實，黑色素瘤異種移植動物模型中PEDF 過表達，可以明顯減少瘤內(nèi)新生血管密度，有效抑制腫瘤生長和轉移。

PEDF 具有多個受體，其中一個（PEDF-R）已確定是PNPLA2 蛋白家族成員。該跨膜蛋白對PEDF具有高特異性和高親和力，與PEDF 結合后，PEDFR 體現(xiàn)出有效的磷酸酶A2 活性，從胞膜釋放脂肪酸，隨后啟動包括p53 途徑在內(nèi)的信號傳導通路。但是，PEDF在生理條件和惡性腫瘤情況下行使功能的分子通路和機制在很多方面仍有待進一步闡明。

PEDF 的多靶點抗腫瘤作用使其極有可能成為優(yōu)選的抗腫瘤藥物。在不同腫瘤模型中，如前列腺癌、結腸癌、肺癌、肝癌及黑色素瘤等，已有PEDF 的實驗性治療。該實驗的前期研究證實，PEDF過表達可顯著抑制腫瘤生長、侵襲和/或血管再生。

5 神經(jīng)源性絲氨酸蛋白酶抑制因子（neuroserpin，Serpini1）

神經(jīng)源性絲氨酸蛋白酶（neuroserpin，NSP）是在雞神經(jīng)軸突培養(yǎng)中首次發(fā)現(xiàn)的一種分泌性蛋白，隨后在人和鼠分離出的腦、胰、心、腎、睪丸和腎上腺組織中也被發(fā)現(xiàn)。哺乳類動物的NSP是相對分子質量為46×103～55×103的糖蛋白，可以抑制tPA分泌，同時在一定程度上抑制uPA和纖溶酶的活性。腦缺血實驗中，腦內(nèi)tPA 表達上調，增加血管通透性。NSP 也可以一過性上調平衡tPA 的活性[30]。NSP 過表達或顱內(nèi)給藥時，可減低小鼠大腦中動脈閉塞及小鼠腦卒中時的腦損傷。

最新研究顯示了NSP 與腫瘤發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系。Hasumi等發(fā)現(xiàn)，NSP在高惡性前列腺癌中表達上調，且NSP 與更短的存活時間相關。然而，NSP 具體如何作用于前列腺癌的發(fā)展尚不清楚。胃癌細胞株MKN28 體外轉染NSP，可致細胞G1/S 周期阻滯和生長遲緩，該結果顯示NSP 可能具有腫瘤抑制作用。胃癌亞群的瘤原性miRNA-21 可引起NSP 的表達下調，使腫瘤增殖增加[31]。進一步研究將闡明NSP 在惡性腫瘤發(fā)展中的確切作用機制，并開發(fā)其對腫瘤進行干預治療的潛力。

6 結語

Serpin 具有靶向生物學活性功能，現(xiàn)已證明其對惡性腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移及血管形成均有影響。不同Serpin 的表達與惡性腫瘤的生長具有一定的臨床相關性，這些Serpin 可以發(fā)展為有效診斷惡性腫瘤和判斷惡性腫瘤預后的生物學標記物。Serpin具有抗腫瘤活性，且已經(jīng)在多種惡性腫瘤模型中得到驗證。所以說，不論是單獨用藥還是輔助治療，Sepin 具有可觀的成為抗腫瘤藥物的潛力。盡管迄今尚未報道Serpin 治療所出現(xiàn)的副作用，但更全面深入的抗腫瘤機制研究可以進一步減少Serpin 治療所帶來的風險。

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