• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大腸桿菌菌蛻裝載質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化

    2014-11-29 04:16:04胡岸吳婷陳翀檀英霞張士坤冷泠李素波高紅偉季守平
    生物技術(shù)通訊 2014年4期
    關(guān)鍵詞:核酸抗原質(zhì)粒

    胡岸 ,吳婷,陳翀,檀英霞,張士坤,冷泠,李素波,高紅偉,季守平

    1.中南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410012;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所,北京 100850

    核酸疫苗是一種新型疫苗,與傳統(tǒng)疫苗相比,其具有成本低廉、易于構(gòu)建和改造、導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞后可持續(xù)表達(dá)產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答等顯著優(yōu)勢(shì),自1990 年被偶然發(fā)現(xiàn)以來(lái)發(fā)展迅速,成為當(dāng)前分子生物學(xué)和免疫學(xué)中新的研究熱點(diǎn)[1]。但核酸疫苗的免疫原性低下、誘發(fā)的免疫效果不佳,一直制約著其臨床應(yīng)用[2]。因此,核酸疫苗研究領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是如何提高核酸疫苗的免疫原性及其誘發(fā)的免疫反應(yīng)效果。研究者們使用各種方式以提高核酸疫苗對(duì)疾病的免疫保護(hù)能力,比如改變接種部位,使用脂多糖、分支桿菌等佐劑,結(jié)合電傳轉(zhuǎn)染技術(shù)等[3],但增效作用都有限。鑒于抗原提呈細(xì)胞在核酸疫苗免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,因而提高核酸疫苗活性的根本途徑在于高效、特異地將核酸疫苗導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞,并使它得到高效表達(dá)[4]。這個(gè)過(guò)程中運(yùn)載核酸的載體非常關(guān)鍵,制備合適的DNA 導(dǎo)入載體成了研究者試圖提高核酸疫苗活性的重要策略。

    近年來(lái),菌蛻(bacterial ghosts,BG)被認(rèn)為是極具潛力的核酸疫苗載體[4]。菌蛻是將細(xì)菌細(xì)胞壁裂解、去除細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物之后形成的細(xì)菌空殼。菌蛻保留了較為完整的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和免疫原性,因而其表面結(jié)構(gòu)可以有效地與抗原提呈細(xì)胞相互作用,誘發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。同時(shí),菌蛻可以裝載核酸疫苗,將其導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞中。當(dāng)裝載核酸疫苗的菌蛻進(jìn)入體內(nèi)時(shí),宿主的抗原提呈細(xì)胞就會(huì)主動(dòng)識(shí)別菌蛻,從而提高菌蛻裝載的核酸疫苗在抗原提呈細(xì)胞中的表達(dá)水平,進(jìn)而增加抗原提呈及免疫應(yīng)答水平。菌蛻的發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用,為研究核酸疫苗載體提供了一個(gè)全新的技術(shù)平臺(tái)[5]。

    在以往的研究中,我們初步建立了菌蛻的制備及裝載核酸疫苗的方法,發(fā)現(xiàn)菌蛻確有靶向運(yùn)載核酸疫苗的作用。但菌蛻裝載DNA 的效率不穩(wěn)定,且裝載質(zhì)粒DNA 后的菌蛻轉(zhuǎn)染抗原提呈細(xì)胞的效率也有待提高[6]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們以大腸桿菌DH5α制備菌蛻,在文獻(xiàn)報(bào)道及前期工作基礎(chǔ)上,優(yōu)化菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 的條件,以獲得更高且更穩(wěn)定的裝載效果。鑒于破碎大腸桿菌后的細(xì)胞膜(即膜囊)能影響裝載效率,其濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致裝載效率低下,我們摸索并優(yōu)化了菌蛻、質(zhì)粒和膜囊三者的最佳濃度比例。檢測(cè)裝載效率后,使用裝載質(zhì)粒DNA的菌蛻轉(zhuǎn)染抗原提呈細(xì)胞RAW264.7(巨噬細(xì)胞系)和DC2.4(樹(shù)突狀細(xì)胞系),優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,進(jìn)一步分析菌蛻作為DNA 疫苗載體裝載質(zhì)粒DNA 并將其導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞的能力。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    RAW264.7 巨噬細(xì)胞株和DC2.4 樹(shù)突狀細(xì)胞為本室保存;大腸桿菌DH5α購(gòu)于全式金公司;pHH43質(zhì)粒為德國(guó)Rainer Hass 教授惠贈(zèng);質(zhì)粒pDSred-N1購(gòu)于BD Clontech 公司;pVAXI-mIi-TM 為本室構(gòu)建;胎牛血清、胰酶、DMEM 培養(yǎng)基和1640 培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco 公司;PI 購(gòu)于Sigma 公司;HEPES 購(gòu)于Amresco 公司;Mito Tracker 購(gòu)于Invitrogen 公司;氯霉素、青霉素、鏈霉素購(gòu)于華北制藥有限公司;質(zhì)粒大量抽提試劑盒購(gòu)于威格拉斯公司;DNA marker DL2000購(gòu)于TaKaRa公司。

    1.2 菌蛻的制備

    轉(zhuǎn)化pHH43 質(zhì)粒至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中,在氯霉素抗性LB 固體培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑出單克隆菌落轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中,恒溫?fù)u床過(guò)夜培養(yǎng),隨后以1∶100 擴(kuò)大培養(yǎng),待D600nm為0.5 時(shí)于42℃誘導(dǎo),當(dāng)D600nm值降到0.3 以下時(shí)離心收集菌體,加入50 mL 無(wú)菌水重懸,并加入200 U/μL 青霉素、鏈霉素各100μL,4℃靜置過(guò)夜,取上清離心,沉淀懸浮,4℃靜置過(guò)夜,小心取出上清,離心,棄除上清,用無(wú)菌水重懸沉淀,此時(shí)溶液均勻,無(wú)絮狀不溶物,再次離心,收集的沉淀即為菌蛻,用無(wú)菌PBS重懸,混勻,測(cè)定菌蛻濃度。

    1.3 膜囊的制備

    以1∶1000 將大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)入LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng),再以1∶100 將大腸桿菌轉(zhuǎn)入LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜,離心收集菌體,棄上清,沉淀稱重,用20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0,含20%蔗糖)重懸(每克菌體加入4 mL),每克菌體加入600μg 溶菌酶,依次加入0.1 mol/L EDTA、0.5 mol/L MgCl2,離心收集菌體,沉淀重懸于冰冷的10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)中,超聲波破碎,離心收集上清,40 000 r/min 離心1 h,沉淀重懸于2 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)中。

    1.4 菌蛻裝載質(zhì)粒

    參照威格拉斯大提質(zhì)粒試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒pDSred-N1和pVAXI-mIi-TM,測(cè)定DNA 濃度。取質(zhì)粒pDSred-N1和pVAXI-mIi 質(zhì)粒各1 mg,加入400μL 冰冷的無(wú)水乙醇,充分混勻,室溫靜置10 min,12 000 r/min 離心10 min,棄上清,沉淀溶于50μL HBS 中,測(cè)定質(zhì)粒DNA 的濃度;取菌蛻,6000 r/min 離心10 min,棄上清,用冰冷的CaCl2反復(fù)洗滌菌蛻(6000 r/min 離心10 min),棄上清,向菌蛻中加入10μL HBS,混勻;按菌蛻140μg/質(zhì)粒200μg 的比例向菌蛻中加入質(zhì)粒,加入HBS 定容至20μL,輕輕混勻,28℃水浴1 h;取出膜囊,按200μg 質(zhì)粒/80μg 膜囊的比例加入,加入13μL 0.1 mol/L CaCl2,輕輕混勻后于37℃過(guò)夜。

    取出-20℃凍存的Mito Tracker染料,融后混勻,取0.5μL 稀釋至500μL PBS 中,混勻,取出37℃孵育的裝載混合液,每管加入35μL 染料,37℃靜置15 min,2000 r/min 離心10 min,加入PBS 定容至500μL,加入細(xì)胞核熒光染色劑PI 2μg/mL,混勻,用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定裝載效率。

    取制備的菌蛻和裝載質(zhì)粒pDSred-N1 的菌蛻,分別用掃描電鏡(HITACHI S-4500)和透射電鏡(Philps-EM 400T)觀察菌蛻的外膜結(jié)構(gòu),以及菌蛻裝載質(zhì)粒前后的結(jié)構(gòu)變化。

    1.5 抗原提呈細(xì)胞吞噬菌蛻

    37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7和樹(shù)突狀細(xì)胞DC2.4;取菌蛻裝載的質(zhì)粒pDSred-N1 1 mg(菌蛻用Mito Tracker 染色),與2 mL 無(wú)血清的Opti-MEM 培養(yǎng)基混勻,分別與RAW264.7細(xì)胞和DC2.4 細(xì)胞孵育過(guò)夜,用PBS 洗滌1 次,激光掃描共聚焦顯微鏡(Bio-Rad Radiance2100)觀察抗原提呈細(xì)胞吞噬菌蛻的效果。按上述方法取1×106細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定抗原提呈細(xì)胞吞噬菌蛻的效率。

    2 結(jié)果

    2.1 菌蛻的制備

    質(zhì)粒pHH43 為溫控型表達(dá)載體,可在42℃誘導(dǎo)表達(dá)φX174 噬菌體的裂解蛋白(E 蛋白),裂解革蘭陰性菌。結(jié)果表明,在誘導(dǎo)過(guò)程中D600nm值明顯下降并維持在0.3 以下,提示大腸桿菌得到了有效裂解。將裂解細(xì)菌洗滌、離心,獲得菌蛻。將大腸桿菌在堿裂解液中超聲波破碎,獲得裂解的大腸桿菌。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,與大腸桿菌及其裂解液相比,菌蛻內(nèi)DNA已隨著細(xì)胞內(nèi)容物被洗去(圖1)。

    2.2 菌蛻裝載質(zhì)粒的效率

    本研究采用的裝載方法是在本研究室前期工作基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。分別用PI 將質(zhì)粒pDSred-N1和pVAXI-mIi-TM 染色,菌蛻用Mito Tracker 標(biāo)記;將不同比例的質(zhì)粒DNA 與菌蛻混合孵育后,用膜囊將菌蛻封閉,以優(yōu)化裝載條件。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(圖2)表明,當(dāng)質(zhì)粒DNA、菌蛻、膜囊混合的比例為10∶7∶4 時(shí)裝載效率達(dá)到最高,2 種質(zhì)粒的裝載效率都達(dá)到了98%以上,其中片段較長(zhǎng)的質(zhì)粒pVAXImIi-TM 的裝載效率幾乎為100%。以上結(jié)果說(shuō)明菌蛻可以有效裝載質(zhì)粒DNA,且裝載效率不會(huì)受DNA片段大小的影響。

    2.3 掃描電鏡和透射電鏡觀察菌蛻和裝載質(zhì)粒的菌蛻

    為了檢測(cè)大腸桿菌是否得到了有效裂解,以及菌蛻是否能夠有效裝載質(zhì)粒DNA,我們將制備得到的菌蛻和裝載質(zhì)粒的菌蛻在掃描電鏡和透射電鏡下進(jìn)行觀察。掃描電鏡結(jié)果顯示(圖3A),在菌蛻的兩端出現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu),提示大腸桿菌被成功地誘導(dǎo)裂解,在菌體兩端形成了非常明顯的裂解通道。透射電鏡的結(jié)構(gòu)顯示,制備的菌蛻內(nèi)部基本不著色,提示其DNA 等內(nèi)容物基本洗滌干凈(圖3B);反之,裝載質(zhì)粒DNA 的菌蛻內(nèi)部有有較多的高密度物質(zhì)(黑色絮狀物)(圖3C),提示菌蛻裝載質(zhì)粒DNA的效率較高,可以作為很好的質(zhì)粒DNA載體。

    2.4 抗原提呈細(xì)胞吞噬菌蛻的效率

    為了檢測(cè)菌蛻是否能有效導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞,增強(qiáng)質(zhì)粒DNA 的提呈效率,我們用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)了裝載質(zhì)粒DNA 的菌蛻(Mito Tracker 標(biāo)記)轉(zhuǎn)染抗原提呈細(xì)胞RAW264.7和DC2.4,發(fā)現(xiàn)幾乎所有RAW264.3 細(xì)胞內(nèi)都可以觀察到綠色熒光信號(hào),提示Mito Tracker 標(biāo)記的菌蛻被巨噬細(xì)胞吞噬到胞內(nèi)(圖4)。

    圖1 大腸桿菌和菌蛻的DNA電泳圖

    圖2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定菌蛻裝載質(zhì)粒的效率

    圖3 掃描電鏡和透射電鏡觀察裝載質(zhì)粒DNA前后的菌蛻

    進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)定量分析轉(zhuǎn)染效果,結(jié)果見(jiàn)圖5,RAW264.7和DC2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染菌蛻后,Mito Tracker 的綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),將轉(zhuǎn)染前后的峰圖擬合,轉(zhuǎn)染后的峰明顯右移,且峰形較好,說(shuō)明基本上所有細(xì)胞均有吞噬現(xiàn)象,效率幾乎高達(dá)100%,從而顯示出標(biāo)記在菌蛻表面的綠色熒光。部分細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度較弱,提示其吞噬菌蛻的量較少。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,菌蛻能夠高效導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞,這對(duì)增加DNA 疫苗在抗原提呈細(xì)胞中的表達(dá)水平是非常有益的。

    3 討論

    φX174噬菌體的裂解基因E編碼一個(gè)含91個(gè)氨基酸殘基的膜蛋白,該蛋白能夠融合革蘭陰性菌的內(nèi)外膜,并在菌膜上形成一個(gè)直徑為40~200 nm 的特異性跨膜孔道??缒た椎赖男纬墒沟酶锾m陰性菌內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變,細(xì)胞內(nèi)容物由裂解孔道排出,生成菌蛻。采用這種方法已成功地制備了大腸桿菌、霍亂弧菌和幽門(mén)螺桿菌等的細(xì)菌菌蛻[7-8]。在菌蛻制備過(guò)程中,細(xì)菌表面的抗原結(jié)構(gòu)沒(méi)有受到任何化學(xué)和物理作用的損傷,保留了活菌樣的完好形態(tài)結(jié)構(gòu),如脂多糖、肽聚糖和包膜特異性受體等免疫刺激成分,因而能夠被巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞主動(dòng)攝取,具有免疫系統(tǒng)靶向性質(zhì)[9]。故而裝載核酸的菌蛻能夠靶向性地將DNA 導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞,是良好的DNA 疫苗遞送載體。菌蛻可經(jīng)口服、皮下、肌肉注射等途徑使用,可操作性極強(qiáng)[10]。此外,作為細(xì)菌空殼,菌蛻沒(méi)有感染能力,具有安全性好,易于制備、保存等優(yōu)點(diǎn),有望成為安全有效的核酸疫苗遞送載體,被廣泛開(kāi)發(fā)用于各個(gè)領(lǐng)域,如腫瘤疫苗的設(shè)計(jì)和發(fā)展、靶標(biāo)藥物和微酶反應(yīng)等[11]。

    圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記菌蛻被巨噬細(xì)胞RAW264.3吞噬

    圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗原提呈細(xì)胞

    高效地將質(zhì)粒DNA 裝載到菌蛻中,是菌蛻介導(dǎo)的核酸疫苗遞送能否成功的關(guān)鍵步驟。Pauker等發(fā)現(xiàn)每個(gè)菌蛻可以裝載6000 個(gè)質(zhì)粒DNA,容量很大,且裝載質(zhì)粒的菌蛻能靶向到小鼠巨噬細(xì)胞,表達(dá)率為60%[12]。但我們參照他們的方法裝載質(zhì)粒DNA 卻一直沒(méi)有成功。究其原因,Pauker 等直接將DNA 與菌蛻混合,以包被質(zhì)粒,但他們提供的實(shí)驗(yàn)方法中缺少將裝載的DNA 封閉在菌蛻中的關(guān)鍵步驟,導(dǎo)致裝載在菌蛻中的DNA 在洗滌過(guò)程中丟失。在前期研究中,我們用大腸桿菌菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 之后,用大腸桿菌膜囊封閉菌蛻,成功地將質(zhì)粒DNA 裝載在菌蛻內(nèi)[13],使用裝載質(zhì)粒DNA 的菌蛻轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞Raw264.7,報(bào)告基因的表達(dá)效率可超過(guò)50%。但前期研究的裝載效率偏低,且不穩(wěn)定,原因可能是只對(duì)菌蛻和質(zhì)粒的濃度比例進(jìn)行了探索,沒(méi)有優(yōu)化膜囊濃度。在本研究中,我們將大腸桿菌DH5α超聲波破碎后,離心收集破碎的細(xì)胞膜成分,即膜囊。我們發(fā)現(xiàn)膜囊能影響菌蛻裝載效率。膜囊濃度過(guò)低,裝載質(zhì)粒的菌蛻不能完全封閉;膜囊濃度過(guò)高,會(huì)影響菌蛻裝載質(zhì)粒效率。我們對(duì)菌蛻、質(zhì)粒和膜囊三者的最佳濃度進(jìn)行了摸索和優(yōu)化,彌補(bǔ)了之前研究的空缺。結(jié)果表明,質(zhì)粒、菌蛻、膜囊三者的濃度比為10∶7∶4 時(shí)可達(dá)到最高裝載效率,效率穩(wěn)定維持在98%以上,多數(shù)情況可高達(dá)100%。

    為了測(cè)定菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 的效率,我們按照之前的方法將DNA 用PI 染色,菌蛻包被質(zhì)粒,隨后菌蛻用Mito Tracker 標(biāo)記,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)裝載。然而在檢測(cè)過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)PI 染色效果不好,同樣裝載方法的所獲得產(chǎn)物的檢測(cè)值波動(dòng)較大。這可能是由于用PI 染色后,菌蛻包被過(guò)夜處理、Mito Tracker 標(biāo)記菌蛻等步驟對(duì)熒光染料PI 產(chǎn)生了不利影響。于是我們嘗試菌蛻包被質(zhì)粒后,用Mito Tracker 標(biāo)記菌蛻,再用PI 將質(zhì)粒染色,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。這樣改進(jìn)后,PI 濃度僅為2μg/mL 即可成功染色,而且染色效果比改進(jìn)前要好。PI 對(duì)質(zhì)粒DNA 的染色效果非常穩(wěn)定,同種裝載條件所獲得的檢測(cè)結(jié)果也非常穩(wěn)定。

    最后,我們優(yōu)化了菌蛻介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染程序,發(fā)現(xiàn)裝載DNA 的菌蛻濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響很大。當(dāng)菌蛻濃度為0.5 mg/mL 時(shí),可獲得良好的轉(zhuǎn)染效率。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示,幾乎所有細(xì)胞內(nèi)部均可看見(jiàn)綠色熒光,提示RAW264.7 及DC 等抗原提呈細(xì)胞能夠高效吞噬菌蛻。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示2種細(xì)胞對(duì)菌蛻的吞噬效率均為100%。

    綜上所述,我們成功地制備了菌蛻,優(yōu)化了菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 的條件,建立了穩(wěn)定的裝載方法及裝載效率的檢測(cè)方法,提高了菌蛻裝載DNA 的裝載效率,使菌蛻裝載幾乎達(dá)到100%。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中,幾乎在100%的抗原提呈細(xì)胞內(nèi)均可檢測(cè)到菌蛻,提示菌蛻確實(shí)是一種靶向有潛力的高效遞送載體,能高效進(jìn)入巨噬細(xì)胞并使攜帶的質(zhì)粒DNA 獲得高水平表達(dá)。今后我們將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討菌蛻提高DNA 疫苗免疫應(yīng)答水平的可能性。我們相信,隨著對(duì)免疫科學(xué)進(jìn)一步的探索,菌蛻高效運(yùn)載核酸的潛力將進(jìn)一步被挖掘,成為治療疾病的強(qiáng)有力工具。

    [1]Kudela P,Koller V J,Lubitz W,et al.Bacterial ghosts(BGs)—advanced antigen and drug delivery system[J].Vaccine,2010,28(36):5760-5767.

    [2]Eko F O,Talin B A,Lubitz W,et al.Development of a Chlamydia trachomatis bacterial ghost vaccine to fight human blindness[J].Hum Vaccines,2008,4(3):176-183.

    [3]Jechlinger W.Optimization and delivery of plasmid DNA for vaccination[J].Expert Rev Vaccines,2006,5(6):803-825.

    [4]Reddy S T,Swartz M A,Hubbell J A.Targeting dendritic cells with biomaterials:developing the next generation of vaccines[J].Trends Immunol,27(12):573-579.

    [5]Mayrhofer P,Tabrizi C A,Walcher P,et al.Immobilization of plasmid DNA in bacterial ghosts[J].J Control Release,2005,102(3):725-735.

    [6]Muhammad A,Champeimont J,Mayr U B,et al.Bacterial ghosts as carriers of protein subunit and DNA-encoded antigens for vaccine applications[J].Expert Rev Vaccines,2012,11(1):97-116.

    [7]Panthel K,Jechlinger W,Matis A,et al.Generation of Helicobacter pylori ghosts by PhiX protein E-mediated inactivation and their evaluation as vaccine candidates[J].Infect Immun,2003,71:109-116.

    [8]Eko F O,Hensel A,Bunka S,et al.Immunogenicity of Vibrio cholerae ghosts following intra-peritoneal immunization of mice[J].Vaccine,1994,12:1330-1334.

    [9]Felnerova D,Kudela P.T cell-specific response induced by bacterial ghosts[J].Med Sci Monit,2004,10:362-370.

    [10]Mayr U B,Walcher P,Azimpour C,et al.Bacterial ghosts as antigen delivery vehicles[J].Adv Drug Deliv Rev,2005,57(9):1381-1391.

    [11]Walcher P,Cui X,Arrow J A,et al.Bacterial ghosts as a delivery system for zona pellucida-2 fertility control vaccines for brushtail possums(Trichosurus vulpecula)[J].Vaccine,2008,26(52):6832-6838.

    [12]Pauker S,Kudela P,Kobl G,et al.DNA-loaded bacterial ghosts efficiently mediate reporter gene transfer and expression in macrophages[J].Mol Thera,2005,11:215-223.

    [13]靳小攀,檀英霞,李素波,等.大腸桿菌菌蛻作為核酸疫苗載體的實(shí)驗(yàn)方法研究[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2010,34:171-174.

    猜你喜歡
    核酸抗原質(zhì)粒
    測(cè)核酸
    全員核酸
    第一次做核酸檢測(cè)
    核酸檢測(cè)
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類(lèi)
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    梅毒螺旋體TpN17抗原的表達(dá)及純化
    結(jié)核分枝桿菌抗原Lppx和MT0322人T細(xì)胞抗原表位的多態(tài)性研究
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    APOBEC-3F和APOBEC-3G與乙肝核心抗原的相互作用研究
    成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久精品国产综合久久久| 十八禁人妻一区二区| 国产男女超爽视频在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲第一青青草原| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲av片天天在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲伊人久久精品综合| 十八禁人妻一区二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 色网站视频免费| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲图色成人| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩免费高清中文字幕av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲成人手机| 丁香六月欧美| 日日夜夜操网爽| 丁香六月欧美| 丰满迷人的少妇在线观看| 免费av中文字幕在线| 久久久精品94久久精品| 国产精品 欧美亚洲| 少妇的丰满在线观看| av片东京热男人的天堂| 操美女的视频在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久这里只有精品19| 国产黄色免费在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 欧美精品一区二区大全| 久久99一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 午夜福利在线免费观看网站| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产一区二区三区av在线| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜av观看不卡| 观看av在线不卡| 日韩伦理黄色片| 日韩伦理黄色片| 两人在一起打扑克的视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 日本av免费视频播放| 又大又黄又爽视频免费| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 女人精品久久久久毛片| 一本色道久久久久久精品综合| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 黑人猛操日本美女一级片| 久久久久久久精品精品| 午夜免费鲁丝| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲,一卡二卡三卡| 伦理电影免费视频| 制服人妻中文乱码| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产1区2区3区精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲欧美一区二区三区久久| 超碰成人久久| 超碰成人久久| 一级a爱视频在线免费观看| 老司机影院成人| 亚洲国产日韩一区二区| 蜜桃在线观看..| kizo精华| 男女床上黄色一级片免费看| 国产91精品成人一区二区三区 | 亚洲欧美成人综合另类久久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产一区亚洲一区在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲国产精品成人久久小说| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 热re99久久精品国产66热6| 成人国产一区最新在线观看 | 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美日韩成人在线一区二区| av福利片在线| 成年女人毛片免费观看观看9 | 人人妻人人澡人人看| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一本色道久久久久久精品综合| 777米奇影视久久| 国产成人免费观看mmmm| 成人三级做爰电影| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美国产精品一级二级三级| 国产人伦9x9x在线观看| 看免费av毛片| av国产久精品久网站免费入址| 欧美国产精品va在线观看不卡| 丝袜脚勾引网站| 丝袜在线中文字幕| 十八禁高潮呻吟视频| 国产精品久久久av美女十八| 国产淫语在线视频| av视频免费观看在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 久久久国产精品麻豆| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 美女视频免费永久观看网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 乱人伦中国视频| 成年动漫av网址| 日本五十路高清| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲国产成人一精品久久久| 999久久久国产精品视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 在线观看人妻少妇| 久久亚洲精品不卡| 1024香蕉在线观看| 国产精品二区激情视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产免费现黄频在线看| 欧美在线一区亚洲| 成年人黄色毛片网站| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲国产欧美在线一区| 久久久久久久精品精品| 亚洲欧美清纯卡通| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品一二三区在线看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品久久久av美女十八| 国产不卡av网站在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 国产有黄有色有爽视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 99热网站在线观看| av天堂久久9| 亚洲欧美清纯卡通| 韩国高清视频一区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 国产91精品成人一区二区三区 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲伊人久久精品综合| 制服诱惑二区| 又大又黄又爽视频免费| 在线av久久热| 女警被强在线播放| 操美女的视频在线观看| av福利片在线| 久久99精品国语久久久| 日本一区二区免费在线视频| av网站在线播放免费| 亚洲成人免费av在线播放| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产色视频综合| 精品国产一区二区久久| 国产高清videossex| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产日韩欧美视频二区| av在线老鸭窝| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 久久久久精品人妻al黑| 国产精品一区二区在线观看99| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 多毛熟女@视频| 丰满少妇做爰视频| 亚洲专区国产一区二区| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲三区欧美一区| 美女主播在线视频| 国产av精品麻豆| 午夜福利免费观看在线| 亚洲av电影在线进入| 精品福利永久在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | h视频一区二区三区| 成人午夜精彩视频在线观看| 大香蕉久久网| 大型av网站在线播放| 一区二区三区精品91| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 91精品伊人久久大香线蕉| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 天天影视国产精品| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲av电影在线进入| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美中文综合在线视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 老汉色∧v一级毛片| 久久久精品免费免费高清| 亚洲成色77777| 青草久久国产| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产亚洲一区二区精品| 午夜影院在线不卡| 看十八女毛片水多多多| 视频在线观看一区二区三区| 一本色道久久久久久精品综合| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲五月色婷婷综合| 丝袜喷水一区| 黄色一级大片看看| 超色免费av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 老司机深夜福利视频在线观看 | 秋霞在线观看毛片| av在线老鸭窝| 亚洲中文av在线| 99精品久久久久人妻精品| 国产激情久久老熟女| 一级毛片我不卡| 婷婷色av中文字幕| 久久狼人影院| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 看免费av毛片| 久久人人爽人人片av| 日韩视频在线欧美| 色网站视频免费| 观看av在线不卡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 老司机影院成人| 极品少妇高潮喷水抽搐| 捣出白浆h1v1| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| av电影中文网址| 亚洲国产成人一精品久久久| 蜜桃在线观看..| 在线看a的网站| 最新在线观看一区二区三区 | 超碰97精品在线观看| 一区福利在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 99香蕉大伊视频| www.精华液| 五月天丁香电影| 在线观看人妻少妇| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久久久精品人妻al黑| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产一区二区在线观看av| 国产视频首页在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲av片天天在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品一二三区在线看| 国产精品久久久av美女十八| av欧美777| 国产精品二区激情视频| 看十八女毛片水多多多| 国产男女超爽视频在线观看| 麻豆av在线久日| 亚洲av男天堂| 日日夜夜操网爽| 欧美成人午夜精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久99一区二区三区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久久久久国产电影| kizo精华| 成在线人永久免费视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 免费日韩欧美在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲,欧美精品.| 亚洲精品自拍成人| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 99国产精品一区二区三区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 2018国产大陆天天弄谢| 热re99久久国产66热| 国产日韩欧美视频二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成年女人毛片免费观看观看9 | 99精品久久久久人妻精品| 国产人伦9x9x在线观看| 不卡av一区二区三区| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产成人精品在线电影| 夫妻午夜视频| 美国免费a级毛片| 午夜视频精品福利| 在线天堂中文资源库| 国产精品一国产av| 中文字幕最新亚洲高清| 久久国产精品影院| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 伊人亚洲综合成人网| 大码成人一级视频| 一本久久精品| 97在线人人人人妻| 国产淫语在线视频| 熟女av电影| 一二三四社区在线视频社区8| 九草在线视频观看| 久久国产精品大桥未久av| cao死你这个sao货| 国产一区二区三区av在线| 国产国语露脸激情在线看| 在线av久久热| 国产成人啪精品午夜网站| 制服人妻中文乱码| 看免费av毛片| 美国免费a级毛片| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 午夜福利,免费看| 久久久国产精品麻豆| 日本a在线网址| 国产精品成人在线| 操出白浆在线播放| 两人在一起打扑克的视频| 国产激情久久老熟女| 久久精品久久精品一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 女性被躁到高潮视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲成人免费av在线播放| 国产精品av久久久久免费| 七月丁香在线播放| 91九色精品人成在线观看| 嫩草影视91久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 中文字幕色久视频| 五月天丁香电影| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品福利永久在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 90打野战视频偷拍视频| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品自拍成人| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 热re99久久精品国产66热6| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产麻豆69| 美国免费a级毛片| 国产精品国产av在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 黄片播放在线免费| 999久久久国产精品视频| 90打野战视频偷拍视频| 首页视频小说图片口味搜索 | 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 少妇精品久久久久久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美激情 高清一区二区三区| 最黄视频免费看| 人妻人人澡人人爽人人| 一区福利在线观看| 一区在线观看完整版| 高清不卡的av网站| 丁香六月天网| 这个男人来自地球电影免费观看| 免费在线观看日本一区| 91成人精品电影| 亚洲av国产av综合av卡| 国精品久久久久久国模美| 精品亚洲成国产av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 免费在线观看日本一区| 涩涩av久久男人的天堂| 黄频高清免费视频| 国产高清videossex| 好男人电影高清在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲熟女毛片儿| 女性生殖器流出的白浆| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品免费视频内射| 成年人免费黄色播放视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 9热在线视频观看99| 欧美黑人欧美精品刺激| 黄色片一级片一级黄色片| 女性被躁到高潮视频| 亚洲精品一二三| 人人妻人人澡人人看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 宅男免费午夜| 免费在线观看黄色视频的| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 人妻 亚洲 视频| 欧美成狂野欧美在线观看| netflix在线观看网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产色视频综合| 99国产精品99久久久久| 在线观看人妻少妇| 婷婷色麻豆天堂久久| 91精品国产国语对白视频| 十八禁高潮呻吟视频| 男女免费视频国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 婷婷色麻豆天堂久久| 中文字幕av电影在线播放| 男女午夜视频在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产日韩欧美在线精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美av亚洲av综合av国产av| 女人精品久久久久毛片| 视频在线观看一区二区三区| 我的亚洲天堂| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产亚洲av高清不卡| 啦啦啦 在线观看视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一级黄色大片毛片| 看十八女毛片水多多多| 国产精品三级大全| 亚洲精品中文字幕在线视频| 女人久久www免费人成看片| 久久久久视频综合| 欧美日韩黄片免| 亚洲av日韩在线播放| 久久综合国产亚洲精品| 97在线人人人人妻| 免费人妻精品一区二区三区视频| 精品少妇内射三级| 欧美97在线视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 99国产精品一区二区三区| 国产精品二区激情视频| 亚洲精品乱久久久久久| 999精品在线视频| 男女下面插进去视频免费观看| 丁香六月欧美| 天天影视国产精品| 又大又黄又爽视频免费| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲人成网站在线观看播放| 日本一区二区免费在线视频| 97精品久久久久久久久久精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久久久精品国产欧美久久久 | www.熟女人妻精品国产| 午夜免费成人在线视频| 久久精品成人免费网站| 99九九在线精品视频| 国产精品二区激情视频| 激情五月婷婷亚洲| 欧美av亚洲av综合av国产av| 在线观看免费午夜福利视频| 久久人人爽人人片av| 免费观看av网站的网址| 校园人妻丝袜中文字幕| 热99久久久久精品小说推荐| 各种免费的搞黄视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 精品少妇久久久久久888优播| 欧美在线黄色| bbb黄色大片| 日韩一区二区三区影片| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产视频首页在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 婷婷色麻豆天堂久久| 我要看黄色一级片免费的| 女人久久www免费人成看片| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品久久久av美女十八| 国产极品粉嫩免费观看在线| 一级a爱视频在线免费观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 看免费av毛片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 中文字幕高清在线视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| av网站在线播放免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品av麻豆狂野| www.999成人在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 午夜影院在线不卡| 成人国产av品久久久| 午夜福利免费观看在线| 久久综合国产亚洲精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲国产欧美在线一区| 一个人免费看片子| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 日本wwww免费看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 中文欧美无线码| 国产精品国产三级国产专区5o| 交换朋友夫妻互换小说| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久av网站| 大片电影免费在线观看免费| 久久久国产欧美日韩av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲国产最新在线播放| 国产精品.久久久| 人人澡人人妻人| kizo精华| 欧美国产精品一级二级三级| 男女无遮挡免费网站观看| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美日韩黄片免| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 母亲3免费完整高清在线观看| av不卡在线播放| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲中文av在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 久久久久久久久免费视频了| 国产精品久久久人人做人人爽| 91麻豆av在线| 免费黄频网站在线观看国产| 国产97色在线日韩免费| 亚洲成人免费av在线播放| 69精品国产乱码久久久| 美女视频免费永久观看网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久人人爽人人片av| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 51午夜福利影视在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | av一本久久久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲,一卡二卡三卡| 日本91视频免费播放| 国产免费福利视频在线观看| 久久久国产一区二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产在线一区二区三区精| 国产有黄有色有爽视频| 精品欧美一区二区三区在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久精品国产亚洲av涩爱| 99热网站在线观看| 久久人人爽人人片av| 亚洲av电影在线进入| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| tube8黄色片| 欧美精品一区二区免费开放| 在线 av 中文字幕| 亚洲,欧美精品.| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 看免费av毛片| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产麻豆69| 97精品久久久久久久久久精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品成人在线| 最近手机中文字幕大全| 国产欧美亚洲国产|