PEG化重組尿酸氧化酶蛋白含量測(cè)定方法研究

李晶，苑方園，程速遠(yuǎn)，張慧，梁成罡

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.昆明理工大學(xué)，云南 昆明 650504

尿酸氧化酶（urate oxidase，UOX）是生物體內(nèi)嘌呤代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，能將難以溶解的尿酸氧化為尿囊素、過(guò)氧化氫和二氧化碳[1-2]，尿囊素的溶解度是尿酸的5～10 倍，易于排出體外，從而緩解痛風(fēng)病人的痛苦。UOX 由4 個(gè)相同的亞基組成，每個(gè)亞基由302 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，整個(gè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為145 000～150 000，分子較大[3]。UOX 廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)，但在人類(lèi)及某些靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物（如狒狒和猿）的進(jìn)化過(guò)程中，其第33和187 位的2 個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了無(wú)義突變，導(dǎo)致編碼提前終止，使人類(lèi)不能產(chǎn)生有生物活性的UOX[4-5]。因此，UOX 進(jìn)入人體后，極易被免疫系統(tǒng)識(shí)別為外源蛋白，從而引發(fā)嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)甚至引起過(guò)敏性休克。

聚乙二醇（PEG）化重組尿酸氧化酶（PEGrUOX）通過(guò)將水溶性大分子聚合物PEG 與rUOX 共價(jià)結(jié)合成新的修飾藥物，降低了其免疫原性，并延長(zhǎng)了rUOX在體內(nèi)的半衰期[6-8]。2010年9月，Savient公司的PEG 化重組豬尿酸氧化酶（pegloticase）在美國(guó)上市銷(xiāo)售。臨床數(shù)據(jù)表明，PEG 化重組豬尿酸氧化酶每2 周注射1 次，在人體內(nèi)的半衰期為10.5～19.9 d[9-10]，而未修飾的rUOX 在體內(nèi)的半衰期僅為19 h；同時(shí)該藥可以消除已形成的痛風(fēng)石，從而達(dá)到根治石性痛風(fēng)的作用[11]。目前，國(guó)內(nèi)PEG-rUOX 已進(jìn)入臨床前研究階段，各廠家的rUOX的一級(jí)序列均有所不同，其中一家企業(yè)的PEG-rUOX 正在申請(qǐng)臨床試驗(yàn)。由于rUOX 本身分子較大，每個(gè)亞基上均有20多個(gè)PEG 修飾位點(diǎn)，因此修飾后的產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子大為增加。與原型蛋白相比，其理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的巨大變化，為質(zhì)量控制尤其是修飾產(chǎn)物的蛋白含量測(cè)定帶來(lái)較大的難度。常規(guī)的蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法如凱式定氮法靈敏度較低，操作繁瑣，無(wú)法將其應(yīng)用于常規(guī)檢測(cè)中；而一些基于生化反應(yīng)的蛋白含量測(cè)定方法如Lowry 法、考染法等，受PEG 的干擾較大，PEG 修飾蛋白往往在反應(yīng)中發(fā)生沉淀，PEG 修飾對(duì)照品的蛋白含量也因此難以準(zhǔn)確賦值。我們以原型蛋白rUOX 作為PEG-rUOX 含量測(cè)定的對(duì)照品，采用凝膠色譜法，通過(guò)詳細(xì)的方法學(xué)考察，建立了較為通用的蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，可同時(shí)對(duì)2種不同的PEG-rUOX進(jìn)行準(zhǔn)確的含量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

2種rUOX 及其PEG-rUOX 原液分別由國(guó)內(nèi)J、M廠家提供；濃鹽酸、氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）購(gòu)自Amresco 公司；其他試劑非特殊說(shuō)明均為分析純級(jí)。

pH 酸度計(jì)METTLER MP230K、電子天平Mettler Toledo xs205PV（瑞士Mettler 公司）；電子天平AND-HF400（日本AND 公司）；島津20AT 高效液相泵、島津SPD20A 檢測(cè)器、島津GIL20AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、島津LTO10AS柱溫箱、Solustion 島津色譜工作站（日本島津貿(mào)易有限公司）；TSK Gel 5000PWxl凝膠色譜柱（日本東洋曹達(dá)TOSOH）；XW-80A 渦旋振蕩儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 紫外吸收波長(zhǎng)掃描

將2 種PEG-rUOX 原液及rUOX 自制對(duì)照品用超純水稀釋至0.5 mg/mL 左右，置于紫外分光光度計(jì)中，700～200 nm掃描。

1.3 流動(dòng)相和色譜條件

1.3.1 流動(dòng)相的配制 稱(chēng)取Tris 6.06 g，氯化鈉8.77 g，加超純水800 mL 溶解，用濃鹽酸調(diào)至pH9.0，定容至1000 mL，抽濾，脫氣備用。

1.3.2 色譜條件 用TSK Gel 5000PWxl 凝膠色譜柱，柱溫25℃，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.4 專(zhuān)屬性及系統(tǒng)適用性

分別將2 種rUOX 自制對(duì)照品和PEG-rUOX 原液用流動(dòng)相稀釋至約1 mg/mL，等體積混合，各取10μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算rUOX和PEG-rUOX 的分離度。另取10μL 流動(dòng)相注入液相色譜儀，作為空白對(duì)照。

1.5 線性

分別取2 種rUOX 自制對(duì)照品適量，用流動(dòng)相稀釋至每1 mL 含rUOX 1.0 mg，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取該溶液200、160、120、80、40μL，分別置于EP 管中，加入流動(dòng)相至終體積為200μL，搖勻，制成濃度為1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL 的系列對(duì)照品溶液。按上述色譜條件，各取10μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.6 定量限與檢測(cè)限

取1.5 項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋至0.2 mg/mL。取5μL 該溶液加入495μL 流動(dòng)相，得到0.002 mg/mL 的rUOX 溶液，分別取100、50、40、30、20、15、10、7、5、3、1μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。記錄信噪比S/N 分別為10∶1（定量限）和3∶1（檢測(cè)限）時(shí)的進(jìn)樣量。

1.7 精密度與穩(wěn)定性

取2 種濃度為0.6 mg/mL 的rUOX 對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5 次，進(jìn)樣量10μL，記錄rUOX對(duì)照品峰面積及保留時(shí)間，計(jì)算RSD%。

取2 種濃度為0.6 mg/mL 的rUOX 對(duì)照品溶液，放置于4℃溫控進(jìn)樣器中，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣10μL，記錄rUOX 的峰面積及保留時(shí)間，計(jì)算RSD%。

1.8 回收率

1.8.1 含量測(cè)定 將2 種PEG-rUOX 原液分別用流動(dòng)相稀釋至0.4～0.8 mg/mL，進(jìn)樣10μL，根據(jù)相應(yīng)rUOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其蛋白含量。

1.8.2 回收率考察 將2 種PEG-rUOX 原液稀釋至0.6 mg/mL，取100μL，分別加入0.6 mg/mL 的rUOX對(duì)照品70、100、130μL，制備成低、中、高3 個(gè)濃度的供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，根據(jù)相應(yīng)rUOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算加樣回收率。

1.9 重現(xiàn)性

2 種PEG-rUOX 注射液各取1 批，分別用流動(dòng)相稀釋至0.6 mg/mL，平行制備6 份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定含量，計(jì)算RSD%（n=6）。

2 結(jié)果

2.1 紫外吸收波長(zhǎng)

經(jīng)波長(zhǎng)掃描，2 種PEG-rUOX 原液與rUOX 除214 nm的末端吸收外，在280 nm處存在最大吸收。

2.2 專(zhuān)屬性及系統(tǒng)適用性

在建立的色譜條件下，2 種rUOX 與2 種PEGrUOX 均能達(dá)到基線分離，2 個(gè)廠家的rUOX 與PEGrUOX 在色譜圖上的位置相似，典型色譜圖見(jiàn)圖1。rUOX 與PEG-rUOX 的分離度、二者的理論塔板數(shù)及拖尾因子均能滿(mǎn)足要求，見(jiàn)表1。

2.3 線性

分別以rUOX峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行直線回歸，結(jié)果表明在280 nm 下，rUOX 在200～1000μg/mL 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖2、3。

2.4 定量限及檢測(cè)限

J 廠家rUOX 濃度為0.002 mg/mL，進(jìn)樣10μL時(shí)S/N 為10∶1，進(jìn)樣5μL 時(shí)S/N 為3∶1，即M 廠家rUOX的定量限為20 ng，檢測(cè)限為10 ng。

M 廠家rUOX 濃度為0.002 mg/mL，進(jìn)樣15μL時(shí)S/N 為10∶1，進(jìn)樣7μL 時(shí)S/N 為3∶1，即J 廠家rUOX的定量限為30 ng，檢測(cè)限為14 ng。

2.5 精密度與穩(wěn)定性

2 種rUOX 的5 次進(jìn)樣峰面積的RSD%分別為0.06%和0.2%（n=5），保留時(shí)間RSD%均為0.02%（n=5），方法精密度良好。樣品12 h 內(nèi)峰面積RSD%為0.46%，表明rUOX在12 h內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性。

2.6 回收率

2.6.1 含量測(cè)定 M 廠家PEG-rUOX 含量測(cè)定結(jié)果為0.65 mg/mL，乘以稀釋率即得PEG-rUOX 的原液濃度為1.95 mg/mL；J廠家PEG-rUOX含量測(cè)定結(jié)果為0.62 mg/mL，乘以稀釋率即得PEG-rUOX 原液濃度為6.2 mg/mL。

表1 專(zhuān)屬性及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6.2 回收率考察 將PEG-rUOX 峰面積與rUOX峰面積之和帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得總的含量值，計(jì)算回收率：

中濃度回收率=（總的含量值-0.3）÷0.3×100%；

低濃度回收率=（總的含量值-0.353）÷0.247×100%；

高濃度回收率=（總的含量值-0.261）÷0.339×100%。

2 種rUOX 平均加樣回收率為98.33%～99.96%，表明該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于PEG-rUOX原液的準(zhǔn)確定量。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.7 樣品測(cè)定及重現(xiàn)性

制備多份樣品平行測(cè)定，J廠家含量測(cè)定結(jié)果的RSD%為0.40%（n=6），M 廠家為0.48%（n=6）。結(jié)果表明，本方法的重現(xiàn)性良好。

3 討論

3.1 分離方式的選擇

一般來(lái)說(shuō)，含量測(cè)定首先考慮分辨率較高的反相液相色譜法，但該方法對(duì)于PEG-rUOX 而言并沒(méi)有較大優(yōu)勢(shì)。由于PEG 本身為混合物，使得修飾產(chǎn)物在反相色譜上很難以一個(gè)對(duì)稱(chēng)性很好的色譜峰洗脫出來(lái)，連接不同PEG 數(shù)量的修飾產(chǎn)物或修飾個(gè)數(shù)相同的位點(diǎn)異構(gòu)體往往以肩峰或分叉峰形式洗脫，給準(zhǔn)確積分造成較大困難。同時(shí)，原型蛋白rUOX本身為含有4 個(gè)相同亞基的分子較大的蛋白質(zhì)，每個(gè)亞基中又含有1 個(gè)游離的巰基，因此，在以有機(jī)相為流動(dòng)相的反相色譜中難以得到對(duì)稱(chēng)性良好、巰基不發(fā)生錯(cuò)配的色譜峰?？紤]到方法的通用性和積分的準(zhǔn)確性，我們選擇了凝膠色譜法進(jìn)行方法優(yōu)化。

圖1 系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖

圖2 M廠家rUOX標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖3 J廠家rUOX標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表2 280 nm波長(zhǎng)下PEG-rUOX的回收率

3.2 流動(dòng)相的選擇

本研究分別選用了超純水、50 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）、50 mmol/L Tris-HCl 含150 mmol/L 氯化鈉共3 種流動(dòng)相。用超純水做流動(dòng)相時(shí)，主峰出峰時(shí)間很早，但PEG-rUOX和rUOX對(duì)照品的峰型均拖尾嚴(yán)重。以50 mmol/L Tris-HCl 作為流動(dòng)相時(shí)，由于Tris-HCl 的緩沖能力，使體系穩(wěn)定性增強(qiáng)，rUOX 色譜峰峰型較好，但PEG-rUOX 色譜峰的拖尾卻較嚴(yán)重。分析原因，可能是流動(dòng)相體系的離子強(qiáng)度不夠，使分子很大的PEG-rUOX 在色譜柱中與填料的吸附作用較明顯而造成拖尾。流動(dòng)相中加入150 mmol/L 氯化鈉后離子強(qiáng)度大為提高，PEGrUOX 的峰型得到明顯改善。但由于PEG-rUOX 是不同PEG 修飾個(gè)數(shù)的混合物，分子有所不同，使得PEG-rUOX 的峰型較寬，而rUOX 的峰型較為尖銳。在此條件下，PEG-rUOX和rUOX 的分離度均大于1.5，可用于PEG-UOX的定量測(cè)定。

3.3 柱溫的選擇

我們分別選用了25℃和30℃柱溫。柱溫為30℃時(shí)，M 廠家的PEG-rUOX 主峰發(fā)生分叉，可能是由于溫度升高使PEG-rUOX 不同修飾產(chǎn)物之間的分離度變大，但又不能達(dá)到基線分離度，因此造成色譜峰分叉，不適合定量分析。25℃時(shí)，PEG-rUOX 為單一峰型，對(duì)稱(chēng)性良好，可用于定量分析。

3.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

2 種rUOX 的氨基酸一級(jí)序列有所不同，但每個(gè)亞基上可以發(fā)生PEG 修飾的位點(diǎn)均有20 多個(gè)。J廠家與M 廠家所使用的PEG 相對(duì)分子質(zhì)量均為5000，活化基團(tuán)均為琥珀酰亞胺酯基，通過(guò)與rUOX上的游離氨基（N端的α氨基及Lys的ε氨基）發(fā)生反應(yīng)，生成酰胺鍵對(duì)rUOX進(jìn)行共價(jià)修飾。因此，由于修飾后的分子在PEG 與rUOX 的連接位置處存在羰基等雙鍵，在214 nm 進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)PEG-rUOX 與rUOX的響應(yīng)因子必然不同。如果以rUOX 為對(duì)照品對(duì)PEG-rUOX 進(jìn)行賦值，如果不采用相對(duì)響應(yīng)因子進(jìn)行校正，則與真實(shí)值相比測(cè)定結(jié)果勢(shì)必偏大，從而造成回收率結(jié)果偏高。然而，如果在280 nm進(jìn)行測(cè)定則情況完全不同。因?yàn)?80 nm 為典型的共軛π鍵吸收，PEG 與rUOX 連接點(diǎn)以及PEG 本身可能的羰基并不對(duì)大π鍵有所貢獻(xiàn)。此時(shí)再以rUOX 為對(duì)照品對(duì)PEG-rUOX 中的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，則2 個(gè)物質(zhì)的響應(yīng)因子應(yīng)基本一致，回收率結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

[1]da Silva Freitasa D,Spencerb P J,Vass?o R C，et al.Biochemical and biopharmaceutical properties of PEGylated uricase[J].Int J Pharm,2010,387(1-2):215-222.

[2]Yang X,Yuan Y,Zhan C G,et al.Uricases as therapeutic agents to treat refractory gout:Current states and future directions[J].Drug Dev Res,2012,73(2):66-72.

[3]Colloc'h N,Poupon A,Mornon J P.Sequence and structural features of the T-fold,an original tunnelling building unit[J].Proteins,2000,39(2):142-154.

[4]Wu X W,Muzny D M,Lee C C,et al.Two independent mutational events in the loss of urate oxidase during hominoid evolution[J].J Mol Evol,1992,34(1):78-84.

[5]Oda M,Satta Y,Takenaka O,et al.Loss of urate oxidase activity in hominoids and its evolutionary implications[J].Mol Biol Evol,2002,19(5):640-653.

[6]Jain A,Jain S K.PEGylation:an approach for drug delivery[J].Crit Rev Ther Drug Carrier Syst,2008,25(5):403-447.

[7]Touraine P,D'souza G A,Kourides I,et al.Lipoatrophy in GH deficient patients treated with a long-acting pegylated GH[J].Eur J Endocrinol,2009,161:533-540.

[8]Ganson N J,Kelly S J,Scarlett E,et al.Control of hyperuricemia in subjects with refractory gout,and induction of antibody against poly(ethylene glycol)(PEG),in a phase I trial of subcutaneous PEGylated urate oxidase[J].Arthritis Res Ther,2006,8(1):R12.

[9]Baraf H S,Matsumoto A K,Maroli A N,et al.Resolution of gouty tophi after twelve weeks of pegloticase treatment[J].Arthritis Rheum,2008,58(11):3632-3634.

[10]Reinders M K,Jansen T L.New advances in the treatment of gout:review of pegloticase[J].Ther Clin Risk Manag,2010,6:543-550.

[11]Lipsky P E,Calabrese L H,Kavanaugh A,et al.Pegloticase immunogenicity:the relationship between efficacy and antibody development in patients treated for refractory chronic gout[J].Arthritis Res Ther,2014,16(2):R60.