金結合多肽及其在生物傳感領域的應用

余濤，郭磊，應天翼，宋云揚，吳方暉

1.防化研究院，北京 102205；2.國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京 102205；3.軍事醫(yī)學科學院 毒物藥物研究所，北京 100850

金單質(zhì)（即零價態(tài)的金）是一種非常重要的傳感材料，因其良好的延展性、成膜性和生物相容性，常用于電化學、壓電晶體微天平、表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）等傳感器的基底，及基于金納米粒子（gold nanoparticles，AuNP）的傳感器件等[1]。生物功能分子與傳感器金基底或金納米粒子的偶聯(lián)效果直接決定了生物傳感體系的性能，物理吸附法和化學共價法是目前廣泛使用的偶聯(lián)方法，但這2 種方法都存在著生物活性分子無法實現(xiàn)定向有序排列、偶聯(lián)步驟較為復雜、對實驗條件要求較高等技術屏障。隨著生物技術的迅猛發(fā)展，將肽作為一種生物自組裝材料，引導生物功能分子進行金表面固定化的方法日益受到重視，這種方法具有易于定向自組裝、易修飾、成膜方法簡單、綠色等技術優(yōu)勢，因而，金結合多肽及以其為核心的表面固定化技術無疑是當前傳感領域研究的熱點之一。

1 主要的金結合多肽序列

現(xiàn)階段，已有多條金結合多肽被用于實際傳感體系中，這些多肽的獲得來自2 條技術途徑，一是通過生物展示技術篩選獲得，另一條途徑是利用半胱氨酸的巰基與金之間特殊的反應特性，人工設計含半胱氨酸的肽段獲得。其中，前者的研究成果現(xiàn)階段報道較多。

生物展示技術是一種新的基因工程技術，其篩選過程是將外源蛋白或肽以融合蛋白的形式展示表達在噬菌體或微生物的表面，再與配體分子進行親合結合，達到篩選具有親合能力的蛋白或多肽的目的。自1992年Brown等通過細胞展示技術篩選到可結合氧化鐵的多肽以來[2]，這種篩選技術得到長足發(fā)展，已獲得用于結合不同無機/有機材料的多肽或蛋白分子[3-5]，所結合的對象包括無機硅、金屬、氧化物、半導體、碳酸鹽、高聚物等不同性質(zhì)的材料[2,6-8]。這些蛋白或多肽分子均表現(xiàn)出特異性強、親和力高、易于修飾、生物相容性好、適用范圍廣泛、結合過程綠色及使用條件溫和等技術優(yōu)點，其應用范圍已逐步拓展到生物傳感、生物納米材料（診斷和藥物遞送）、組織工程和生物治療等諸多領域[4,7,9]。

最先報道的可以識別金的多肽是Brown 于1997年通過細胞展示技術篩選獲得的，其在篩選過程中以帶有雙酶切位點的質(zhì)粒為載體，在酶切位點之間設計引物并構建文庫，將此帶有文庫的載體導入選擇的宿主細胞后進行誘導培養(yǎng)，進入對數(shù)生長期后，在菌液中加入金單質(zhì)，再結合離心的方法加以富集，收集結合在金表面的具有結合能力的細胞，再通過幾輪重復篩選過程，最終從這些細胞中篩選到一組具有較高結合能力的多肽，再從中選擇活性最強的一條多肽，此肽由14 個氨基酸殘基組成，命名為GBP1，該序列對金、銀、鉑均有結合能力，但對金的結合能力遠超過其他2種金屬[10]。

迄今，通過展示技術已發(fā)現(xiàn)多條具有金結合能力的多肽，均具有特異性結合到金表面并自組裝的能力。如Naik 等于2005 年篩選到一組對銀具有良好結合能力的多肽，其中命名為A3的多肽同樣具有很好的金結合能力[11]；2008年，Sarikaya等也報道了2條序列AuBP1和AuBP2[12]。

需要強調(diào)的是，單條金結合多肽和串聯(lián)后的多條金結合多肽在與金結合能力方面存在差異，而相關研究正在進行中，尚無定論，但并不妨礙金結合多肽在多個領域中的應用[13-21]，這一點在生物傳感領域尤為突出。隨著技術的發(fā)展，通過展示技術也獲得了具有金結合能力的蛋白[22]，但相關應用工作剛起步[23]。相關金結合多肽序列見表1。

2 金結合多肽與金的親和識別機理

金結合多肽與金的親和識別機理的研究，對于金結合多肽的應用至關重要。體外篩選和人工設計2 條途徑所獲得的金結合多肽與金的親和識別機理的研究過程不盡相同。

眾所周知，半胱氨酸的巰基具有與金結合的能力，但值得注意的是，在上述這些經(jīng)生物篩選方法所得到的，具有較好應用前景的序列中均未發(fā)現(xiàn)半胱氨酸殘基的存在。實驗表明，單純地增加半胱氨酸的數(shù)量，并不能觀察到明顯的金結合能力提高[27]，將半胱氨酸的位置經(jīng)過特殊設計后，可以獲得具有較好結合活性的的多肽。曾有國外學者設計了一段用于偶聯(lián)2種蛋白的多肽[28]，但后來發(fā)現(xiàn)其具有金定位結合能力，該序列僅由6 個氨基酸殘基構成，中間2個殘基為非半胱氨酸，Metallo 等證明這條多肽與其他蛋白融合表達后，可以將不同類型的蛋白偶聯(lián)至不同粒徑的金納米表面[26]。

雖歷經(jīng)十余載，但體外篩選獲得的金結合多肽與金單質(zhì)間的識別機理仍未有定論，目前的機理研究工作大多遵循自金結合多肽與金結合的相關影響因素進行分析的模式。從序列組成來講，目前報道的金結合多肽序列多數(shù)不含半胱氨酸，表明其與金間的特異性識別并非通過末端巰基與金間的作用來進行[29-30]。研究認為，物理構象（構象變化、大小和拓撲）和化學作用（靜電、極性、氫鍵）在金結合多肽與金之間的結合過程中同時存在[31]。一方面，與特定的氨基酸殘基相關，如堿性氨基酸、芳香族氨基酸等。Liu等證明，組氨酸的咪唑基團具有較好的金結合能力[32]；Knecht 等指出，賴氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸也具有金結合能力[3]；Sarikaya 等分析篩選的多條序列后指出，半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸在高結合能力的肽段中比例較高[12]；Ohuchi 等利用質(zhì)譜技術研究表明，金結合肽中部分序列在結合過程中始終與金保持緊密連接[33]。另一方面，多肽的高級結構在識別過程中發(fā)揮了更重要的作用。Sarikaya等認為，GBP1序列中存在的反式β折疊二級結構對結合能力貢獻更高[34]；Maranas 等研究表明，由于金結合多肽中的二級結構單元短，且彼此之間由柔性較大的氨基酸連接，因此，在溶液狀態(tài)時，其構象具有高靈活性，當其在金表面結合時，易因構象變化推斥金表面的水分子[35]；Sarikaya 等通過分析解離常數(shù)和結合能發(fā)現(xiàn)，成環(huán)后的AuBP2 由于構象變化，其與金結合的能力高于GBP1、線性的AuBP1和AuBP2 及環(huán)狀的AuBP1[12]。對于多肽在金表面的結合過程，Carri 認為分為三步：首先，多肽擴散到金表面的水層；然后，多肽中的一個氨基酸殘基穿透水層，在金表面上形成一個錨定位點；最后，則是形成特定的結構或構象與金結合[36]。此外，金結合多肽序列重復次數(shù)的增加不一定有助于提高其與金的結合能力，如GBP1 序列在重復數(shù)為3 時結合能力最好，再增加數(shù)量結合能力反而下降[24,34,37-38]，這與巰基-金的識別類似[30]。

表1 金結合多肽的序列及主要性質(zhì)

對人工設計的多肽，因在設計之初就已有一定規(guī)矩，且肽段較短，組成相對單一，其與金親和過程較為清楚。如對CCPGCC這條序列來說，所包含的4個半胱氨酸殘基在空間上形成了一個反式β折疊的桶狀結構，4 個巰基均暴露在桶外側，因而具有良好的金結合特性[26,39]。

3 金結合多肽在生物傳感中的應用

自1998年以來，F(xiàn)urlong、Tamerler、Lee和Metallo等先后開展了金結合多肽親和力、結合特異性、穩(wěn)定性、融合蛋白表達，以及用于蛋白、DNA 檢測等方面的基礎工作，顯示了金結合多肽在生物傳感中具有廣泛的應用前景[26,40-42]。從目前的報道來分析，這類多肽的應用集中在兩方面：其一是用于在傳感器的金基底表面制備傳感器敏感膜，其成膜方法可以分為化學偶聯(lián)成膜法和基于基因工程的融合蛋白成膜法兩種；其二則為引導制備金納米粒子。

3.1 基于金結合多肽的化學偶聯(lián)成膜法

化學偶聯(lián)成膜法研究較早，其成膜原理是，利用金結合多肽與金的特異性親合特性，先將多肽分子自組裝在傳感器表面，再將抗體、酶等生物識別分子共價偶聯(lián)到多肽分子上。與基底上直接共價偶聯(lián)生物識別分子相比，經(jīng)由金結合多肽的表面改性方法更為簡單有效，在提高金表面生物相容性的同時，有利于偶聯(lián)效率和檢測靈敏度的提高。多經(jīng)1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙基］碳化二亞胺鹽酸化物（1-ethyl-3-［3-dimethylaminopropyl］carbodiimide hydrochloride，EDC）/N-羥基硫代琥珀酰亞胺（N-hydroxysulfosuccinimide，sulfo-NHS）偶聯(lián)步驟。Furlong 等利用該法制備了SPR 傳感器的敏感膜，檢測了多種敏感物分子，如將B 型金黃色葡萄球菌腸毒素（Staphylococcus aureusenterotoxin B，SEB）的抗體固定于GBP1 基底層上，對SEB 的檢測限（limit of detection，LOD）達到fmol/L 級（約10μg/mL）[43]；同樣，以固定抗體到GBP1 層的方法，將SPR 傳感器安置于飛機表面，對空氣中呈氣溶膠態(tài)的卵清蛋白和辣根過氧化物酶實現(xiàn)了靈敏檢測[44]；這種免疫檢測策略亦可應用于蟹肉樣品中小分子藻類毒素軟藻酸（domoic acid）的檢測，其LOD 達到3 ppb（約3 ng/mL）[45]。Itamo 等先通過EDC 反應將對抗體非識別區(qū)Fc 片段有特異結合能力的蛋白A 固定于金結合多肽的基底膜上，再利用蛋白A 來結合抗體，上述方法雖然增加了反應步驟，但可以有效降低對抗體活性的影響，對二噁英的LOD可達20 ng/mL[46]。

3.2 基于基因工程的融合蛋白成膜法

融合蛋白成膜法，指在成膜前，先通過基因工程技術，將金結合多肽和生物識別蛋白（酶、抗體及其他蛋白）融合表達，制備兼具金表面結合能力和目標分子識別能力的雙功能蛋白，成膜過程僅須將這種雙功能蛋白配于溶液中，滴加于金表面，靜置幾十分鐘即可。此種成膜方法與傳統(tǒng)的物理吸附和化學共價偶聯(lián)法，以及間接成膜法相比，具有三方面的技術優(yōu)勢[23,26,40,47-49]：①通過金結合多肽的結合過程，實現(xiàn)了生物識別分子在傳感器基質(zhì)表面的定向、有序排列，克服了傳統(tǒng)成膜方法所造成的部分識別位點被遮蔽，無法參與識別反應的缺點；②反應條件簡單、溫和、快速、步驟少，成膜過程不影響生物分子的生物活性，避免了偶聯(lián)反應對識別分子生物功能的破壞；③制備所得膜的穩(wěn)定性優(yōu)于傳統(tǒng)方法。由于上述優(yōu)點，使得基于這種新方法制備的傳感器敏感膜可以保護生物識別分子活性，其檢測靈敏度較之以往方法有顯著提高[23,26,40,42,49,50]。Metallo 等利用基因工程技術表達了帶有CCPGCC 序列的綠色熒光蛋白和不帶此序列的對照綠色熒光蛋白，偶聯(lián)結果表明，帶有金結合多肽的樣品組對金納米粒子表面的包覆率比對照組高出2 倍[26]；Park 等表達了鈣調(diào)蛋白與GBP1連接的融合蛋白，將此蛋白分別通過共價偶聯(lián)法固定在玻璃表面和金識別法固定在金表面，結果表明后者的生物活性較前者高出近1 倍[50]；Ko 等將GBP1 序列與一種傳染病的膜表面識別肽段融合表達后，通過GBP1 的識別作用與傳感器的金基底結合，加入抗體所形成的響應信號比直接將表面識別肽段共價偶聯(lián)到金基底增加了1 倍[49]；在另一報道中，將GBP1 序列與蛋白A 融合表達，利用蛋白A 與抗體之間的特異識別將抗體固定在傳感器基底膜上，其檢測限比直接將抗體固定在基底膜上高了10倍[51]。目前，利用基因工程技術表達含有金結合多肽的融合蛋白，再行制備傳感器敏感膜的方式已得到廣泛應用，從含有金結合多肽的融合蛋白構成來區(qū)分，可以分為2類。

其一，融合表達可適應免疫識別反應的通用型金結合多肽融合蛋白。由于蛋白A 具有特異識別抗體Fc 片段的功能，因此，將金結合多肽與蛋白A 的抗體識別亞基融合表達，即可結合各種抗體，從而設計發(fā)展出針對各種不同對象的通用型免疫傳感平臺。如Ko 等融合表達了GBP1-蛋白A 亞基，并利用此蛋白修飾了金納米粒子的SPR 傳感器表面，成膜后結合上特異性識別沙門菌的抗體，用于鼠傷寒沙門菌的檢測，LOD可達104細胞/mL[51]；Hong等在電極上修飾碳納米管-金納米粒子的復合材料，再利用GBP1-蛋白A 亞基結合識別C 反應蛋白的抗體，制得的電化學傳感器對C 反應蛋白的LOD 達到了100 ng/mL[52]；Lechuga 等在融合蛋白的克隆策略上進行了改進，設計了2 個連續(xù)的蛋白A 識別亞基，兼顧反應活性和空間位阻，克服了傳統(tǒng)傳感器基質(zhì)表面蛋白A 的4 個亞基的空間位阻較大的缺點，利用此種融合蛋白構建的SPR 傳感器對人生長激素的LOD達到了90 ng/mL[47]。

其二，針對靶分子特性，特異性地表達含有金結合多肽的融合蛋白。Kang 等將禽流感特征表面抗原肽段（CRDNWKGSNRPI）與GBP1 片段融合表達，用于制備傳感器敏感膜，對目標物的LOD 可分別達到1 pg/mL和10 fg/mL[53-54]；Park 等將可以識別乙肝表面抗原的單鏈抗體、乙肝表面抗原的特征序列分別與GBP1 融合表達，利用這2 種蛋白構建了可以同時分析樣品中乙肝表面抗原和抗體的傳感體系，LOD 均可達到ng/mL 量級，可用于乙肝的早期發(fā)現(xiàn)和確診[55]。SCVme 片段是嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）病毒感染機體后，所表達的一種特征蛋白的膜外區(qū)，Park和Lee等構建了一個同時編碼SCVme 膜外區(qū)序列、綠色熒光蛋白和GBP1序列的質(zhì)粒，將表達后的融合蛋白分別用于研制檢測體內(nèi)相應抗體的SPR傳感器和微流控生物芯片，有望用于對SARS 患者的篩查[49,56]。相似的工作還包括：Park 等將一段鈣調(diào)蛋白的底物多肽序列與連接蛋白和GBP1融合表達，組裝在生物芯片上，用于監(jiān)測鈣調(diào)蛋白的生物活性[48,50]；Gralnick等直接將GBP1 序列與來自大腸桿菌的膜蛋白Lam 融合后轉入斯瓦尼菌中，通過展示技術表達在斯瓦尼菌的細胞膜上，使得細胞可以直接固定在電極表面，用于檢測這種細菌的電化學生物特性[57]；Lee 等在大腸桿菌細胞表面，通過展示技術同時表達了GBP1序列與親合素蛋白，通過GBP1序列使細胞結合在生物芯片表面，再利用親合素與生物素化的其他分子結合，用于制備全細胞生物傳感器[58]。

對含有金結合多肽序列的融合蛋白而言，多肽功能區(qū)保持對金表面的定向自組裝能力，且對生物識別蛋白的功能不產(chǎn)生干擾，是其直接制備敏感膜的關鍵。分析已有的研究報道不難得出，不同的金結合多肽（GBP1和GGPGCC 序列）與多種不同蛋白融合表達后，均保持了金結合活性，其傳感效果均優(yōu)于化學修飾法[26,40,49-50]，表明此類多肽在表達過程中未參與蛋白質(zhì)的折疊過程，有較好的結構獨立性；從另一方面分析，在不同的融合蛋白中，盡管功能蛋白來自不同種屬，如病毒[40,55]、細菌[40,51,57]、動物[26,40,42]，分子大小差異明顯，但表達后其識別目標分子活性均未受到影響，這意味著金結合多肽在表達過程中，同樣不會影響其他蛋白的正確折疊。由此可以判斷，目前報道的這些多肽適合于基因工程表達。

從具體蛋白克隆策略來分析，無論是將金結合多肽序列設計在融合表達蛋白的N 端[13,40,48-50,52-56]還是C端[26,47,51,57-58]，融合蛋白的2種功能均可有效實現(xiàn)，因此推測金結合多肽對于N 端或C 端可能不具備明顯選擇性。在融合蛋白表達中，為了純化方便，通常要設計一些用于親合純化的蛋白或多肽標簽，Park等以可被鈣調(diào)蛋白識別的多肽與鈣調(diào)蛋白之間的磷酸化反應活性為標準，分別考察了與GBP1序列融合表達時，谷胱甘肽S 轉移酶、麥芽糖結合蛋白和精脒合酶等3 種常用的蛋白類親合純化標簽對應蛋白的活性，結果表明GST 標簽的活性較好[50]。更廣泛的是以多聚組氨酸（poly-His）作為多肽純化標簽，此類標簽分子小，一般不涉及三級結構，在純化中應用較廣[42,48-49,51-56]；類似的多肽純化標簽還有LYTAG 系統(tǒng)[47]。盡管許多研究工作指出，金結合多肽的適當多次重復有助于提高與金的結合能力，但在融合表達中對該問題沒有定論，Kang[53]、Park[48,50,56]、Hong和Park[52]、Park和Lee[42,54,55,58]、Ko 等[51]在融合表達中沒有選擇GBP1 重復表達；Lechuga[47]、Ko[49]等將GBP1 的重復數(shù)設置為3；Gralnick 選擇的重復數(shù)為5[57]；Ibii等比較了分別選擇GBP1、3GBP1和7GBP1與蛋白融合后所形成敏感膜的解離常數(shù)，結果表明GBP1序列的重復數(shù)量設計為7 時效果更好[23]；而Tameler 等將GBP1 與堿性磷酸酶融合表達時發(fā)現(xiàn)，重復數(shù)為5 時的效果比7和9好[40]。

3.3 金結合多肽制備具有響應能力的金納米粒子

金納米粒子是近年來深受重視的一種納米材料，在傳感領域已得到廣泛應用。金結合多肽與金納米粒子可以成為完美搭檔，主要表現(xiàn)在利用金結合多肽引導制備金納米粒子，同時賦予其識別功能方面。Naik 等合成了一段多肽，其C 端序列為可以識別金的A3 序列，N 端序列為可以識別金屬離子的標簽序列，將此肽與氯金酸混合后，A3 直接誘導氯金酸生成金納米粒子，并包被在金納米粒子的表面，標簽序列參與識別金屬離子，該傳感體系對Co2+、Hg2+、Pb2+、Pd2+和Pt2+均有良好的響應[59]。另一代表性范例為，Metallo 等利用基因工程技術，將CCPGCC序列分別與綠色熒光蛋白、泛素蛋白融合表達，再與已合成的不同粒徑的金納米粒子反應，結果表明這些蛋白都可以結合在金納米粒子的表面，用于進一步的傳感，當然，不同蛋白與金納米粒子結合的能力與后者的粒徑直接相關[26]。

4 結語

金結合多肽自身的特性決定了其在傳感領域中有較好的應用前景和發(fā)展空間。目前，基于該原理發(fā)展起來的生物傳感器敏感膜制備方法已經(jīng)體現(xiàn)出明顯的技術優(yōu)勢。當然，我們應該看到這方面研究及應用剛剛起步，仍有諸多有待深入探討的空間，如新的金結合多肽肽段的篩選、不同基因工程表達體系（如真核表達體系、昆蟲表達體系及動物表達體系等）的應用、具有復雜功能及復雜結構（如糖修飾、多亞基蛋白、膜蛋白）的融合蛋白的獲得等。現(xiàn)階段，金結合多肽的研究更多地集中于敏感膜的制備，而將這種多肽與金納米粒子為代表的新型納米材料相結合，直接構建高靈敏度、高選擇性傳感響應體系的研究工作，必將是另一重要發(fā)展方向。

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