可視安全標(biāo)記花青素合成途徑相關(guān)基因在植物轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用進(jìn)展

杜建中， 趙欣梅， 王長(zhǎng)彪， 郝曜山， 王亦學(xué)， 張歡歡， 孫 毅

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原030031

自20世紀(jì)80年代植物基因工程誕生以來，人們一直將標(biāo)記基因與目的基因共同導(dǎo)入轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株，其中標(biāo)記基因(marker gene)在植物的遺傳轉(zhuǎn)化過程中的作用是區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞(植株)，一旦轉(zhuǎn)基因植株再生成功，標(biāo)記基因便失去作用［1］。目前使用較為廣泛的標(biāo)記基因有兩類:除草劑抗性基因和抗生素抗性基因。隨著轉(zhuǎn)基因作物的商品化以及種植面積的逐年擴(kuò)大，人們擔(dān)心轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中的除草劑抗性基因可能會(huì)隨花粉漂移而傳遞至雜草，從而使這些雜草對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性，產(chǎn)生所謂的“超級(jí)雜草”而難以清除;另外轉(zhuǎn)基因食品中的抗生素抗性基因可能通過轉(zhuǎn)染腸道細(xì)菌從而造成人體內(nèi)的病菌對(duì)這些抗生素產(chǎn)生耐藥性，而產(chǎn)生出一些難以控制的超級(jí)細(xì)菌［2］。目前還沒有確鑿可信的證據(jù)證明這些擔(dān)憂是多余的，但抗性標(biāo)記基因(resistant marker gene)潛在的生態(tài)環(huán)境和食用安全性的爭(zhēng)議卻越來越多。因此，從科學(xué)的態(tài)度出發(fā)，尋找適用于植物轉(zhuǎn)化的安全標(biāo)記基因無疑會(huì)是解決這一問題的最佳途徑。

目前所發(fā)現(xiàn)的安全標(biāo)記基因有以下幾類:①代謝產(chǎn)物選擇標(biāo)記，如6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因［3～7］、花青素合成酶(ANS)基因［8，9］、木糖異構(gòu)酶基因(xylA)［10～13］等;②耐脅迫基因，如山菠菜膽堿單氧化物酶(CMO)基因［14～16］、甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因［17～22］;③代謝產(chǎn)物合成途徑中調(diào)控因子基因，如玉米花青素合成途徑中的r/b調(diào)控基因家族和c1/p1調(diào)控基因家族［23，24］;④綠色熒光蛋白(GFP)基因［25～30］等。這些較安全的標(biāo)記基因中，花青素合成酶類基因由于可以產(chǎn)生可視的轉(zhuǎn)化體表型變化，因而作為標(biāo)記用于篩選轉(zhuǎn)化體具有其他安全標(biāo)記基因所不具備的優(yōu)勢(shì)。

花青素是一類在植物體內(nèi)合成的水溶性天然色素，屬類黃酮化合物，很少以游離狀態(tài)存在，通常是與一個(gè)或多個(gè)單糖或多糖結(jié)合形成花色苷，其群體較大，大約有250 多種［31～34］，而且這些花青素類物質(zhì)的顏色還會(huì)隨所處環(huán)境pH的變化而變化，pH＜7呈紅色，pH在7～8時(shí)呈紫色，pH ＞11時(shí)呈藍(lán)色［31］，鄭智［35］還發(fā)現(xiàn)，木芙蓉在離體培養(yǎng)條件下，溫度、光照和金屬離子對(duì)植株的著色有顯著影響。結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控基因?qū)ㄇ嗨氐暮铣善鹫{(diào)節(jié)作用，這些基因表達(dá)水平的變化決定了花青素在植物細(xì)胞內(nèi)積累量的改變，從而使植物表型產(chǎn)生不同的色彩變化［36］。這種顏色變化很容易用肉眼分辨，有利于作為對(duì)轉(zhuǎn)化體選擇的依據(jù)，因此控制花青素合成的酶類和調(diào)控因子基因可作為報(bào)告基因用于轉(zhuǎn)基因植物研究［37］。目前用于此類轉(zhuǎn)化研究所涉及的植物包括小麥、煙草、水稻、馬鈴薯、草莓和花卉等。有關(guān)花青素相關(guān)基因的研究，包括研究花青素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的作用、轉(zhuǎn)化體表型的變化、花青素生物合成途徑中各種酶的活性以及這些基因作為標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化植物的可行性等，均涉及到根據(jù)轉(zhuǎn)化體顏色變化來篩選得到轉(zhuǎn)化體，因而這些研究進(jìn)展從不同角度為可視安全標(biāo)記花青素合成酶類基因及調(diào)控基因在植物轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 與花青素合成酶類有關(guān)的轉(zhuǎn)化研究

1.1 查爾酮合成酶

花青素生物合成代謝過程十分復(fù)雜，僅參與合成的主要催化酶類就有多個(gè)，其中查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是植物花青素合成途徑中類黃酮物質(zhì)合成的第一個(gè)酶。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國內(nèi)外科學(xué)家已經(jīng)從不同植物中克隆得到一百多個(gè)CHS基因的序列［38～40］。許多研究證明查爾酮合成酶基因的表達(dá)對(duì)紫外光照射、真菌侵染等外界刺激敏感，而且具有花特異性部位表達(dá)的特性，其表達(dá)量的高低可引起植物花色的深淺變化［41～43］。因此查爾酮合成酶合成產(chǎn)物顏色的變化能作為可視化標(biāo)記基因來研究植物的遺傳轉(zhuǎn)化。

在轉(zhuǎn)化研究方面，Jez等［39］將用紫外照射的來自歐芹(Petroselinum hortense)的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的DNA片段(與CHS mRNA互補(bǔ))插入質(zhì)粒pBR322，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株RR1，發(fā)現(xiàn)在照射的細(xì)胞中，CHS mRNA含量發(fā)生劇烈變化。Elomaa等［44］將含有編碼非洲菊CHS的全長(zhǎng)反義cDNA連接到卸甲農(nóng)桿菌，再將非洲菊葉柄切片與上述農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)子CaMV 35S驅(qū)動(dòng)下，反義cDNA抑制了轉(zhuǎn)化體中花青素苷的合成，一些轉(zhuǎn)化體的花色發(fā)生了顯著變化。由于花青素衍生物的積累，百合科油點(diǎn)草屬觀賞植物的花被上有許多微紅色斑點(diǎn)，Kamiishi等［45］從這類植物的花被中分離到CHS的全長(zhǎng)cDNA克隆，并定名為TrCHS1，接著他將以TrCHS1為靶標(biāo)的一個(gè)RNA干擾子載體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到油點(diǎn)草植株中，旨在使油點(diǎn)草的花色發(fā)生變化。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化體依據(jù)花被顏色可分成3類，第一類，花被的微紅斑點(diǎn)數(shù)與非轉(zhuǎn)化植株相同;第二類，微紅斑點(diǎn)數(shù)比非轉(zhuǎn)化植株少;第三類，花被完全呈白色，沒有斑點(diǎn)出現(xiàn)。

1.2 查爾酮異構(gòu)酶

查爾酮異構(gòu)酶(CHI，chalcone isomerase)是花青素合成途徑中的另一個(gè)關(guān)鍵酶，產(chǎn)物為二羥基黃烷酮。Mehdy等［46］用真菌誘導(dǎo)子處理菜豆(Phaseolus vulgaris L.)的細(xì)胞培養(yǎng)物，并提取其mRNA構(gòu)建了11個(gè)基因文庫，用菜豆CHI基因產(chǎn)物的抗血清篩選到兩個(gè)陽性克隆，這是最早利用抗體技術(shù)從法國菜豆中分離到的CHI基因。之后，vanTunen等［47］在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)CHI基因，基因A和基因B，并證明基因A在花冠和成熟的雄蕊中都可表達(dá)，而基因B僅在未成熟的花藥中表達(dá)，屬于位點(diǎn)特異表達(dá)差異。2003年，Norimoto等［48］根據(jù)酶功能將植物CHI蛋白基因家族分成兩大類，一類酶只能將查爾酮異構(gòu)化為(2S)-黃烷酮，另一類酶可將查爾酮或6'-脫氧查爾酮都異構(gòu)化為(2S)-5-脫氧黃烷酮。

將CHI基因作為標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化研究方面，Muir等［49］用來自牽?；ǖ?CHI基因構(gòu)建了pBBC50和 pSJ89兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌菌株LBA4404，轉(zhuǎn)化番茄(var.FM6203)，經(jīng)分子檢測(cè)得到轉(zhuǎn)化植株，對(duì)后代植株的研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄株系的果皮中黃酮醇比對(duì)照增加78倍，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株的表型間沒有明顯差異。Nishihara等［50］從煙草中分離到編碼CHI基因的cDNA，根據(jù)序列分析，將可干擾其轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的RNA干擾子用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入煙草植株，研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化植株的花瓣中色素沉積減少，黃酮醇類的組分也發(fā)生了變化，花粉中積累大量查爾酮，呈黃色，證實(shí)通過遺傳轉(zhuǎn)化方法抑制CHI基因可產(chǎn)生明顯的表型差異。Li等［51］從風(fēng)毛菊屬植物的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離到CHI基因，并轉(zhuǎn)化煙草植株，采用正反雙向35S啟動(dòng)子調(diào)控對(duì)CHI基因進(jìn)行調(diào)控，引入正向35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化植株中黃酮類物質(zhì)積累是對(duì)照植株的5倍，主要是由于蕓香苷的積累。而由于反向啟動(dòng)子抑制了內(nèi)源CHI基因的表達(dá)，引入反向35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化植株中只積累較少量的黃酮類物質(zhì)。Zhou等［52］從牡丹花中分離到CHI基因并轉(zhuǎn)化煙草植株，獲得了T1轉(zhuǎn)基因植株，表型和色素分子檢測(cè)證明，轉(zhuǎn)化植株體內(nèi)黃酮醇和黃酮的積累量是對(duì)照植株的3倍，花青素苷和花的顏色強(qiáng)度均有顯著減少。

1.3 黃烷酮3-羥化酶

黃烷酮3-羥化酶(F3H，flavanone 3-hydroxylase)催化黃烷酮脫羥基生成黃酮醇。Martin等［53］最早從金魚草中分離到這個(gè)酶，在大豆、玉米、茄子、苜蓿、蘋果、康乃馨等不同植物中，黃烷酮3-羥化酶多以單拷貝形式存在［54］。

Amir等［55］研究發(fā)現(xiàn)，康乃馨品種(Eilat)由于缺少黃烷酮3-羥化酶和類黃酮-3'，5'-羥化酶，致使花卉只有橙色表型。它們將F3H的反義cDNA導(dǎo)入康乃馨品種Eilat，試圖阻止編碼F3H的基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)化體中發(fā)現(xiàn)，一些花朵原有的橙色或微紅色變淡，一些花朵失去原有顏色，只有一些色素痕跡存在，轉(zhuǎn)化體比對(duì)照香味更濃。Takashi等［56］利用兩個(gè)不同的異源表達(dá)系統(tǒng)，釀酒酵母的微粒體部分和轉(zhuǎn)基因煙草植株，研究從龍膽植物花瓣中分離的F3H和黃酮合成酶Ⅱ(GtFSⅡ)的酶活性。在酵母中表達(dá)的重組體GtF3'H對(duì)幾個(gè)黃酮類底物在3'位置顯示羥基化活性，而表達(dá)GtF3'H的轉(zhuǎn)基因煙草植株中花青素濃度略有增加，花的顏色也加深;酵母中，GtFSⅡ重組體能夠從黃烷酮合成黃酮，而在轉(zhuǎn)基因煙草植株中，花色素苷和花的顏色明顯減少。Jiang等［57］構(gòu)建了一個(gè)可編碼一個(gè)發(fā)夾F3H RNA的RNAi基因沉默載體，將攜帶F3H RNAi載體的農(nóng)桿菌菌株GV3101注射到已開花授粉仍在植株上的草莓里，注射10 d后觀察草莓的表型，同時(shí)進(jìn)行RT-PCR和Northern雜交分析，結(jié)果證明，同未注射的對(duì)照相比，轉(zhuǎn)化果中F3H減少了70%，HPLC-MS分析證明，果中花青素含量劇烈減少，黃酮類物質(zhì)也減少了。

1.4 二氫黃酮醇4-還原酶

二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)在花青素合成途徑中催化二氫黃酮醇類底物發(fā)生還原反應(yīng)，生成無色的原花色素。Heller等［58］研究發(fā)現(xiàn)DFR基因在植物中多以單拷貝形式存在，而Shimada等［59］證明在有些植物中存在多個(gè)拷貝的DFR基因，不同拷貝間表現(xiàn)出各自的組織特異性表達(dá)特征。例如在百脈根植物中，DFR1在結(jié)節(jié)、根、莖、葉、花和豆莢中都可表達(dá)，而DFR2在除了葉以外的其他組織中表達(dá)，DFR4和DFR5在除了結(jié)節(jié)以外的其他組織中能表達(dá)，但是DFR3只在莖和葉中表達(dá)。

Rosati等［60］采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來自金魚草(Antirrhinum majus)的DFR基因和紫羅蘭(Matthiola incana)的花青素合成酶基因(MiANS)順序轉(zhuǎn)化到連翹(Forsythiax intermedia cv‘Spring Glory’)植株中，兩個(gè)基因共轉(zhuǎn)化的植株的花瓣呈現(xiàn)一種古銅色+橙色的新顏色，這是因?yàn)榛ㄇ嗨匮苌?花青素苷在野生的胡蘿卜素黃色的背景基礎(chǔ)上重新積累的結(jié)果。單個(gè)基因轉(zhuǎn)化的個(gè)體中花瓣的顏色沒有改變，證明連翹花瓣中花青素苷合成的后面幾個(gè)步驟是受多級(jí)控制的。Mori等［61］認(rèn)為，DFR是藍(lán)色或紫色花色表達(dá)的關(guān)鍵酶，他們從蔓長(zhǎng)春花的花瓣中克隆得到DFR基因的全長(zhǎng)cDNA，并定名為VmFH1，當(dāng)將其轉(zhuǎn)化到矮牽?；ㄖ仓曛袝r(shí)，一些轉(zhuǎn)化體的花色發(fā)生了顯著變化，花色由紅色變成含深紫色部分的深紅色，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植株的花瓣中積累了3'，5'-羥基花青素苷的緣故，證明蔓長(zhǎng)春花的DFR在其他植物中仍具有活性。

1.5 花青素合成酶

花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)因其可催化原花色素底物產(chǎn)生氧化反應(yīng)而生成花青素苷，故又稱作無色花色素雙加氧酶，是花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶之一［62～64］。Menssen 等［65］最初是從玉米的一個(gè)突變體A2中克隆到花青素合成酶的。截至目前所得到的ANS基因序列大多數(shù)包含有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子。

此外，ANS基因在植物體內(nèi)的表達(dá)具有組織特異性，Rosati等［66］研究證明，金鐘連翹中的花青素合成酶只在金鐘連翹的萼片中表達(dá)，而在花藥花瓣中卻沒有ANS的表達(dá)。Noriko等［67］采用RNAi技術(shù)，將RNA片段導(dǎo)入夏堇植物體，以抑制夏堇體內(nèi)ANS的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株由于缺少花青素合成，其花色整體由藍(lán)紫色變成了白色。Reddy等［68］克隆得到一個(gè)水稻 ANS cDNA，并用于轉(zhuǎn)化一種水稻突變體植株，這種突變體只在其果皮中積累原花青素，但所有組織中都沒有花青素苷的存在。轉(zhuǎn)基因突變體植株中類黃酮和花青素苷積累增加，而原花青素相應(yīng)減少，種皮呈現(xiàn)出紫紅色。祝欽龍［69］克隆到彩葉草花色素合成酶基因家族(SsANS)并用于轉(zhuǎn)化煙草W38植株，發(fā)現(xiàn)該基因在花中表達(dá)最強(qiáng)，在葉片中的表達(dá)較弱，在莖和根中不表達(dá)。導(dǎo)入外源基因使煙草植株的花色和葉色都發(fā)生了不同的變化。

2 與花青素合成途徑有關(guān)的調(diào)控因子的轉(zhuǎn)化研究

隨著社會(huì)發(fā)展，人們對(duì)日常生活環(huán)境美化的要求不斷提高，特別是對(duì)花卉植物鑒賞能力的變化促使花卉市場(chǎng)的擴(kuò)大和花卉植物研究的日益深入，加之對(duì)花青素次生代謝產(chǎn)物在人類健康方面有益影響的進(jìn)一步了解，一些與花青素的代謝合成途徑及其相關(guān)的基因調(diào)控的研究越來越引起科學(xué)界的興趣［70］。許志茹等［71］在總結(jié)前人的研究時(shí)，將已知的花青素合成調(diào)控因子分成三類:bHLH、MYB 和 WD40。夏玉鳳等［72］研究認(rèn)為，大多數(shù)物種中，其花青素的合成都是由上述三類轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合體調(diào)控的，但也有個(gè)別植物其花青素合成僅需要一個(gè)調(diào)控因子就能激活，如在玉米中，鞣紅的生物合成只要調(diào)控因子MYBP1存在就能被激活。

2.1 調(diào)控因子共轉(zhuǎn)化

所有已知的花青素合成調(diào)節(jié)因子中，以對(duì)玉米(Zea mays L.)花青素苷合成調(diào)節(jié)基因的研究相對(duì)較為詳細(xì)。在玉米中，根據(jù)編碼花色素苷基因的轉(zhuǎn)錄因子的不同，可將玉米中這類調(diào)節(jié)基因分為r/b基因家族和 cl/pl基因家族［73］。Maike等［74］研究證明，r/b基因家族編碼的是bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，組成龐大，成員眾多，包含有R-sc、Lc、Sn和B等100多個(gè)基因。而編碼MYB類轉(zhuǎn)錄因子的cl/pl基因家族只包含包括Cl和Pl兩個(gè)基因。如上所述，這兩個(gè)基因家族的基因都不能單獨(dú)地行使調(diào)節(jié)功能，通常是幾個(gè)基因結(jié)合在一起共同作用來調(diào)控花青素的生物合成［75］。Doshi等［76］將玉米花青素調(diào)控基因C1和B-Peru基因同時(shí)導(dǎo)入大麥植株，并在大麥的不同組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下來研究大麥體內(nèi)花青素的合成，試圖通過大麥幼胚等器官或組織的顏色變化來判斷這些啟動(dòng)子的組織特異性表達(dá)和驅(qū)動(dòng)能力。Doshi等［77］進(jìn)一步采用基因槍法將花青素苷合成調(diào)控基因C1和B-Peru導(dǎo)入小麥和黑小麥植株中，兩個(gè)基因受胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子Ltp1的控制，在沒有選擇壓時(shí)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，小麥和黑小麥中可選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化率分別為0.93%和1.55%。但只在3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系和1個(gè)轉(zhuǎn)基因黑小麥株系的T1代成熟種子中觀察到有花青素苷沉積的胚，可能的原因是多位點(diǎn)插入或轉(zhuǎn)基因重組影響了花青素苷合成基因的表達(dá)。C1和B-Peru基因可以作為小麥和黑小麥的可視化標(biāo)記。在研究調(diào)節(jié)因子的協(xié)同作用方面，Han等［23］利用玉米花青素合成的調(diào)控基因Pl和Lc分別或共同轉(zhuǎn)化匍匐剪股穎植物時(shí)發(fā)現(xiàn)，分別轉(zhuǎn)化時(shí)，兩個(gè)基因單獨(dú)調(diào)控花青素的合成，所以轉(zhuǎn)基因植株上出現(xiàn)紫色的位置不確定，色強(qiáng)也有差異;若用兩個(gè)因子共同轉(zhuǎn)化時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株全身都呈現(xiàn)出紫色。

2.2 花青素合成基因表達(dá)的組織特異性調(diào)控

van de Meer等［78］為了研究涉及參與指導(dǎo)花特異性和可紫外誘導(dǎo)表達(dá)的查爾酮合成酶的5'側(cè)鏈調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)序列，構(gòu)建了一個(gè)嵌合基因，包含來自矮牽牛(Petunia hybrida)的 chs A啟動(dòng)子(V30)、作為報(bào)告基因的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)基因序列(cat)以及來自矮牽?；ǖ腸hs A終止子區(qū)(V30)。將這個(gè)嵌合基因和啟動(dòng)子5'末端缺失的嵌合基因構(gòu)建到帶有Ti質(zhì)粒的載體上，并用于轉(zhuǎn)化矮牽牛植株，隨后測(cè)定CAT活性。結(jié)果表明含有順式作用元素的長(zhǎng)220 bp的chs A啟動(dòng)子片段的導(dǎo)入，賦予轉(zhuǎn)基因植株花特異性和可紫外誘導(dǎo)的表達(dá);當(dāng)啟動(dòng)子為-67～+1的片段時(shí)，轉(zhuǎn)基因矮牽?；ㄈ阅芴禺愋员磉_(dá)，但可紫外誘導(dǎo)部分不表達(dá)。與其他植物品種的chs基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行比較，結(jié)合缺失分析和凝膠阻滯鑒定的結(jié)果，強(qiáng)烈證明矮牽牛中TACPyAT重復(fù)(-59和-52)參與了chs A基因的器官特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)。楊翅春等［79］將油菜的花瓣特異性啟動(dòng)子XY355與玉米花青素調(diào)節(jié)基因Lc共同構(gòu)建的植物表達(dá)載體pXY60，以根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum)和矮牽牛植株，觀察轉(zhuǎn)基因植株后代的花色發(fā)現(xiàn)，與非轉(zhuǎn)化植株的花色比較，轉(zhuǎn)基因植株花色都有所加深，轉(zhuǎn)基因煙草的花色由淡紅色變成了紅色，轉(zhuǎn)基因矮牽牛的花色由白色變化為淺紫色。趙欣梅等［80］利用花青素合成調(diào)控因子C1/B-Peru構(gòu)建了兩個(gè)植物轉(zhuǎn)化載體，一個(gè)載體中調(diào)控因子受胚特異性啟動(dòng)子控制，另一個(gè)載體中調(diào)控因子受到CaMV35S啟動(dòng)子控制。分別轉(zhuǎn)化玉米幼胚，證明兩個(gè)載體都能在玉米幼胚細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。黃艷嵐等［81］克隆到馬鈴薯花青素轉(zhuǎn)錄激活基因(stmyc)，并證明該基因在馬鈴薯中呈組成型表達(dá)。Kortstee等［82］研究發(fā)現(xiàn)來自蘋果的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因MYB10的突變體等位基因可以誘導(dǎo)植株全身的花青素苷合成，將該基因(包括其上游的啟動(dòng)子、基因編碼區(qū)和終止子序列)導(dǎo)入蘋果、草莓和馬鈴薯植株，檢測(cè)其是否能夠用作一個(gè)可視的選擇標(biāo)記基因以替代化學(xué)合成的標(biāo)記基因，如卡那霉素抗性標(biāo)記基因。轉(zhuǎn)化后，他們標(biāo)記紅色愈傷、紅色嫩枝和紅色的生長(zhǎng)良好的植株，從蘋果外植體上取樣綠色和紅色的枝條，用PCR法檢測(cè)MYB10基因的存在。結(jié)果證明蘋果外植體的紅色枝條總是含有MYB10基因，但含有MYB10基因的枝條不都是紅色的。轉(zhuǎn)化的草莓植株顯示在葉片和根部有花青素苷的積累，但在馬鈴薯中沒有觀察到花青素苷的積累，即使它帶有MYB10基因也是如此。不過馬鈴薯的葉片和根部含有比對(duì)照高4倍的花青素苷，因此MYB10基因可以在蘋果、草莓和馬鈴薯中用作選擇標(biāo)記基因來替代卡那霉素抗性標(biāo)記基因。

2.3 色素含量和植株表型的調(diào)控

Pandey等［83］開發(fā)了一種轉(zhuǎn)化煙草植株愈傷培養(yǎng)方法以表達(dá)黃酮醇特異性轉(zhuǎn)錄因子At-MYB12，目標(biāo)是得到一個(gè)可用的蕓香苷資源。轉(zhuǎn)基因愈傷表現(xiàn)為提高了生物合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致黃酮醇的積累增加，尤其是蕓香苷。在愈傷生長(zhǎng)的每一個(gè)點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因愈傷中蕓香苷含量都比野生型對(duì)照高幾倍。Butelli等［84］以Delila和Roseal基因?yàn)楣w，轉(zhuǎn)化番茄植株，得到了轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化體中兩個(gè)調(diào)節(jié)基因在果實(shí)特異E8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，花青素合成水平提高，使番茄果實(shí)的顏色加深，成為紫色果實(shí)。Lloyd等［85］用玉米的花青素合成調(diào)節(jié)基因Lc來轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株的花色發(fā)生了變化，由最初的淡紅色變成轉(zhuǎn)化后的深紅色。與此相反，Kim等［86］將來自玉米的調(diào)節(jié)基因C1用于轉(zhuǎn)化煙草，證明轉(zhuǎn)化植株的形態(tài)表型不僅發(fā)生了變化，而且轉(zhuǎn)化體的花瓣顏色變得更淡了。早在1990年，Napoli等［87］報(bào)道在將查爾酮合成酶基因?qū)胱仙珷颗Ｖ?，轉(zhuǎn)化后代中約有42%的轉(zhuǎn)化植株的花色是白色，或是紫白嵌合花色，與Kim等的研究結(jié)果接近。Napoli等還認(rèn)為發(fā)生這種現(xiàn)象的可能原因是導(dǎo)入外源CHS基因后，牽?；ㄖ仓陜?nèi)源CHS基因的表達(dá)受到了抑制，并將這種由于外源基因轉(zhuǎn)入而導(dǎo)致內(nèi)源同源基因以及外源基因共同受到抑制的現(xiàn)象稱為共抑制。Shimada等［88］利用Hf1和Hf2調(diào)控因子基因轉(zhuǎn)化矮牽牛，原本粉紅色的牽?；ǖ霓D(zhuǎn)化植株中出現(xiàn)了紫、粉紅色的嵌合花色;Liu等［89］將來自擬南芥的轉(zhuǎn)座子Tag1序列插入到啟動(dòng)子CaMV 35S和玉米調(diào)節(jié)基因R中間，并用于轉(zhuǎn)化煙草植株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體中出現(xiàn)多種嵌合花色，但都未說明出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因。

2.4 與其他性狀基因連鎖轉(zhuǎn)化

Liu等［90］認(rèn)為，將可視標(biāo)記基因與有關(guān)性狀連鎖，就能夠明確分辨出含有這個(gè)性狀的轉(zhuǎn)基因種子，遺傳修飾材料很容易與非轉(zhuǎn)基因材料區(qū)分開來。來自玉米的調(diào)控花青素苷生物合成途徑的基因負(fù)責(zé)指導(dǎo)紫色色素合成，能用于產(chǎn)生具有獨(dú)特的、易于識(shí)別表型的轉(zhuǎn)基因植株。因此用一個(gè)種子特異性玉米球蛋白啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因(Bp和C1)的表達(dá)，這兩個(gè)因子在胚和糊粉層組織中調(diào)節(jié)花青素苷生物合成途徑，使玉米種子具有明顯的紫色色素沉積。將這兩個(gè)基因與除草劑抗性標(biāo)記基因一起構(gòu)建載體并轉(zhuǎn)化玉米植株，結(jié)果證明體細(xì)胞胚得到了色素沉積，再生的轉(zhuǎn)基因植株帶有色素沉積種子，而且整合的DNA與除草劑抗性發(fā)生共分離，說明這兩個(gè)調(diào)節(jié)因子基因可用作玉米轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因。宮硤等［24］以含有報(bào)告基因Bi和C1以及篩選標(biāo)記基因epsp的植物表達(dá)載體pBAC9009為供體，以玉米自交系501的幼胚為受體，用基因槍法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，幼胚分化再生植株經(jīng)草甘膦抗性篩選，獲得了75株抗性植株，其中43株結(jié)實(shí)獲得種子，T0代植株有18株在苗期或生長(zhǎng)階段表現(xiàn)局部或全紫色，8個(gè)結(jié)實(shí)果穗有零星的紫色種子，從外觀上可直接確認(rèn)為轉(zhuǎn)化植株。PCR和RT-PCR的分子檢測(cè)及花青素含量分析表明，葉片和籽粒為紫色的玉米植株中外源目的基因已整合并且高效表達(dá)，即紫色表型與分子檢測(cè)的結(jié)果高度一致。巴超杰等［91］以草甘膦抗性基因epsps為標(biāo)記基因，在原核Kanr基因兩側(cè)引入Cre(環(huán)化重組酶)基因識(shí)別的Lox-P位點(diǎn)，同時(shí)以編碼花青素合成轉(zhuǎn)錄因子的Bi和Cl基因?yàn)榭梢暬x擇報(bào)告基因，構(gòu)建了Bt殺蟲蛋白基因Cry1Ab/c的可視化跟蹤表達(dá)載體pBAC9017。用PDS1000/He基因槍轉(zhuǎn)化玉米(Zea mays)自交系501的幼胚和胚性愈傷組織，獲得147個(gè)草甘膦抗性的玉米再生植株。Qiu等［92］為了增加產(chǎn)橡膠蒲公英植株的價(jià)值，通過讓來自擬南芥植物的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花青素苷色素1(AtPAP1)的異源表達(dá)來開發(fā)生產(chǎn)橡膠蒲公英品種的紅色/紫色植株。轉(zhuǎn)基因植株的營養(yǎng)組織中總的花青素苷含量比對(duì)照平均高48倍，但色素沉淀是一個(gè)例外，轉(zhuǎn)基因植株的表型與對(duì)照不相上下，生長(zhǎng)活力也差不多。在5個(gè)轉(zhuǎn)基因系中，AtPAP1基因的表達(dá)水平與總花青素苷含量高度相關(guān)，而此時(shí)天然橡膠仍正常存在，轉(zhuǎn)基因并未影響天然橡膠的生產(chǎn)。

3 討論

花青素的生物合成在自然界有著豐富的功能，其中重要的一點(diǎn)是構(gòu)成多彩的花色，蟲媒植物依賴其自身的花色吸引昆蟲為其傳花授粉。此外，花青素合成的各級(jí)產(chǎn)物對(duì)人類來說，不僅是無毒無害，而且還具有許多重要的生理功能。Halliwell［93］認(rèn)為花色苷具有清除氧自由基的作用，因此在一些疾病的預(yù)防方面具有重要功能［94～96］。用花青素合成酶類基因或調(diào)控因子基因作為標(biāo)記基因進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因研究，能夠減少人們對(duì)使用抗生素抗性基因或抗除草劑基因作為標(biāo)記基因所產(chǎn)生的擔(dān)憂。大量的研究結(jié)果證明，植物導(dǎo)入花青素合成酶或合成調(diào)節(jié)因子可引起轉(zhuǎn)化體著色發(fā)生改變，從而使人們無需借助任何設(shè)備就很容易方便地區(qū)分轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體，因此花青素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因用于轉(zhuǎn)化植物具有如下優(yōu)勢(shì):①無毒無害且有利于人類健康，屬安全標(biāo)記基因;②可以直觀地從轉(zhuǎn)化群體中通過轉(zhuǎn)化體顏色的改變篩選到轉(zhuǎn)化事件，從而使繁瑣重復(fù)的轉(zhuǎn)基因個(gè)體篩選工作變得方便快捷，大大縮減傳統(tǒng)篩選方法所需的人力和物力，同時(shí)有效降低檢測(cè)成本［97］。此外，一些研究還表明，調(diào)節(jié)色素類基因的表達(dá)，積累的色素不僅使轉(zhuǎn)基因植株生產(chǎn)產(chǎn)品附加值增加［92］，還能起到防治植物病蟲害的效果，Pandey等［83］發(fā)現(xiàn) AtMYB12轉(zhuǎn)基因植株積累增加的蕓香苷，對(duì)斜紋夜蛾和棉鈴蟲幼蟲來說是致死的或抑制其生長(zhǎng)，用該轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化植株，生成的蕓香苷可防治蟲害。

雖然用花青素合成酶類轉(zhuǎn)化植物安全、省力，但也有其不足之處，如，花青素合成酶類或控制花青素合成基因的啟動(dòng)子大多是組織或器官特異性的，因此其轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建需要針對(duì)轉(zhuǎn)化研究的目的做合理調(diào)配，即花卉植物多選用花特異性啟動(dòng)子調(diào)控，大作物多選用種子或果實(shí)特異性轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。若選用35S啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)化體的表型將發(fā)生巨大變化，如綠色植物體可能會(huì)變成紫色、深紅色、甚至是黃色或無色，其結(jié)果是轉(zhuǎn)化體無法正常進(jìn)行光合作用;在作物上，若選用種子特異性啟動(dòng)子調(diào)控，會(huì)使得對(duì)轉(zhuǎn)化體的篩選延遲到成熟期或收獲期，無法早期做出合理判斷，這將無形中延長(zhǎng)研究周期等。然而，這些缺點(diǎn)可以通過精確的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加以彌補(bǔ)。綜合考慮其利弊，以花青素基因作為報(bào)告基因的應(yīng)用可以大大提高工作效率，節(jié)約檢測(cè)成本，對(duì)于植物轉(zhuǎn)基因研究具有重要意義。因此用花青素合成酶類基因轉(zhuǎn)化植物是一種可視、安全和有效的標(biāo)記基因，其應(yīng)用前景十分廣闊。

［1］Puchta H.Removing selectable marker genes:taking the shortcut［J］.Trends Plant Sci.，2000，5(7):273-274.

［2］Zubko E，Scutt C，Meyer P.Intrachromosomal recombination between attP regions as a tool to remove selectable marker genes from tobacco transgenes［J］.Nat.Biotechnol.，2000，18(4):442-445.

［3］Negrotto D， Jolley M， Beer S， et al.. The use of phosphomannose isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize (Zea mays L.)via Agrobacterium transformation［J］.Plant Cell Rep.，2000，19(8):798-803.

［4］Wright M，Dawson J，Dunder E，et al..Efficient blolistic transformation of maize(Zea mays L.)and wheat using the phosphomannose isomerase gene，pmi as the seleetable marker［J］.Plant Cell Rep.，2001，20(5):429-436.

［5］Todd R，Tague B W.Phosphomannose isomerase:a versatile selectable marker for Arobidopsis thaliana germ-line transformation［J］.Plant Mol.Biol.Rep.，2001，19(4):307-319.

［6］張啟軍，尹福強(qiáng)，王世全，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)gna基因?qū)λ镜霓D(zhuǎn)化［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22(6):40-44.

［7］王彩芬，付永彩，朱作峰，等.水稻遺傳轉(zhuǎn)化甘露糖安全篩選體系的建立［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16(2):41-45.

［8］Kim S H，Lee J R，Kim S R.Characterization of an apple anthocyanidin synthase gene in transgenic tobacco plants［J］.J.Plant Biol.，2006，49(4):326-330.

［9］邵莉，李毅，楊美珠，等.查爾酮合酶基因?qū)D(zhuǎn)基因植物花色和育性的影響［J］.植物學(xué)報(bào)，1996，38(7):517-524.

［10］Haldrup A，Petersen S G，Okkels F T.The xylose isomerase gene from Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes allows effective selection of transgenic plant cells using D-xylose as the selection agent［J］.Plant Mol.Biol.，1998，37(2):287-296.

［11］Haldrup A，Petterson S G，Okkels F T.Positive selection:a plant selection principle based on xylose isomerase，an enzyme used in the food industry［J］.Plant Cell Rep.，1998，18(1-2):76-81.

［12］閻淑滑，周波，趙霞，等.以木糖異構(gòu)酶基因xylA為選擇標(biāo)記的Gateway系統(tǒng)植物表達(dá)載體的構(gòu)建［J］.生物技術(shù)通訊，2010，21(1):35-38.

［13］丁霄，隋炯明，王晶珊，等.以木糖異構(gòu)酶基因作為選擇標(biāo)記的花生遺傳轉(zhuǎn)化［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，26(3):444-448.

［14］徐冰，韓烈保，姚娜，等.草地早熟禾轉(zhuǎn)CMO-BADH雙基因和轉(zhuǎn)CMO基因耐鹽性分析［J］.草地學(xué)報(bào)，2008，16(4):353-358.

［15］信金娜，韓烈保，劉君，等.基因槍轉(zhuǎn)化法獲得草地早熟禾(Poa pratensis L1)轉(zhuǎn)基因植株［J］.中國生物工程雜志，2006，26(8):10-14.

［16］張守攻，韓素英，汪 泉，等.小葉楊膽堿單氧化物酶(CMO)基因的克隆與轉(zhuǎn)化雜種落葉松及表達(dá)［J］.分子植物育種，2006，4(4):483-488.

［17］Kishitani S，Takanami T，Suzuki M，et al..Compatability of glycinebetaine in rice plants:evalutat ion using transgenic rice plants with a gene for peroxisomal betaine aldehyde dehydrogenase from barley［J］.Plant Cell Eviron.，2000，23(1):107-114.

［18］Ishitani M，Nakamura M，Han S Y，et al..Expression of the betaine aldehyde dehydrogenase gene in barley in respones to osmotic stress［J］.Plant Mol.Biol.，1995，27(2):307-315.

［19］Nakamura T，Yokota S，Muramoto Y，et al..Expression of a Betaine aldehyde dehydrogenase gene in rice，a glycinebetaine nonaccumulator，and possible localization of its protein in peroxisomes［J］.Plant J.，1997，11(5):1115-1120

［20］Hibino T，Meng Y L，Kawamitsu Y，et al..Molecular cloning and functional characterization of two kinds of betaine aldehyde dehydrogenase in betaine-accumulating mangroveAvicennia marina(Forsk.)Vierh［J］.Plant Mol.Biol.，2001，45(3):353-363.

［21］楊曉玲，東方陽，孫耀中，等.轉(zhuǎn)BADH基因水稻幼苗抗鹽性研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2006，26(8):1627-1632.

［22］陳傳芳，李義文，陳豫，等.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得耐鹽轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶基因白三葉草［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2004，31(1):97-101.

［23］Han Y J，Kim Y M，Lee J Y，et al..Production of purplecolored creeping bentgrass using maize transcription factor genes Pl and Lc through Agrobacterium-mediated transformation［J］.Plant Cell Rep.，2009，28(3):397-406.

［24］宮硤，楊鳳萍，薛靜，等.花青素合成轉(zhuǎn)錄因子基因在玉米中的表達(dá)研究:一種新型基因可視化跟蹤表達(dá)系統(tǒng)［J］.科學(xué)通報(bào)，2012，57(24):2285-2291.

［25］Kim C K，Chung J D，Park S H ，et al..Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Rosa hybrida using the green fluorescent protein(GFP)gene［J］.Plant Cell Tissue Organ Cult.，2004，78(2):107-111.

［26］Kanamoto H，Yamashita A，Asao H，et al..Efficient and stable transformation of Lactuca sativa L.cv.Cisco(lettuce)plastids［J］.Transgenic Res.，2006，15(2):205-217.

［27］Nguyen T T，Nugent G， Cardi T， et al.. Generation of homoplasmic plastid transformants of a commercial cultivar of potato(Solanum tuberosum L.)［J］.Plant Sci.，2005，168(6):1495-1500.

［28］Malig A P.Engineering the plastid genome of higher plants［J］.Curr.Opin.Plant Biol.，2002，5(2):164-172.

［29］杜麗，曾曉慧，周索，等.基因轉(zhuǎn)化香樟胚性愈傷組織的研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2008，28(3):465-469.

［30］楊正安，丁玉梅，許彬，等.GFP基因甘藍(lán)質(zhì)體表達(dá)載體構(gòu)建及原核表達(dá)分析［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2008，28(1):12-17.

［31］Petroni K，Tonelli C.Recent advances on the regulation of anthocyanin synthesis in reproductive organs［J］.Plant Sci.，2011，181(3):219-229.

［32］趙宇瑛，張漢鋒.花青素的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33(5):904-905，907.

［33］侯夫云，王慶美，李愛賢，等.植物花青素合成酶的研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(21):188-190.

［34］宮硤，薛靜，張曉東.植物花青素合成途徑中的調(diào)控基因研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)進(jìn)展，2011，1(6):381-390.

［35］鄭 智.木芙蓉花色形成的表型研究［D］.長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，碩士學(xué)位論文，2009.

［36］Zhang B，Hu Z L，Zhang Y J，et al..A putative functional MYB transcription factor inducedby low temperature regulates anthocyanin biosynthesisin purple kale(Brassica oleracea var.acephala f.tricolor)［J］.Plant Cell Rep.，2012，31(2)，281-289.

［37］趙昶靈，郭維明，陳俊愉.植物花色呈現(xiàn)的生物化學(xué)、分子生物學(xué)機(jī)制及其基因工程改良［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2003，23(6):1024-1035.

［38］Ferrer J L，Jez J M，Bowman M E，et al..Structure of chalcone synthase and the molecular basis of plant polyketide biosynthesis［J］.Nat.Struct.Biol.，1999，6(8):775-784.

［39］Jez J M，Noel J P.Mechanism of chalcone synthase.pKaof the catalytic cysteine and the role of the conserved histidine in a plant polyketide synthase［J］.J.Biol.Chem.，2000，275(50):39640-39646.

［40］王燕，許峰，程水源.植物查爾酮合成酶分子生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，(8):5-9.

［41］Kreuzaler F，Ragg H，F(xiàn)autz E，et al..UV-induction of chalcone synthase mRNA in cellsuspension culturesof Petroselinum hortense［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80(9):2591-2593.

［42］Lamb C J，LawtonM A， DronM， et al.. Signaland transduction mechanisms for activation of plant defenses against microbial attack［J］.Cell，1989，56(2):215-224.

［43］Morita Y， SaitoR， BanY， et al.. Tandemlyarranged chalcone synthase a genes contribute to the spatially regulated expression of siRNA and the natural bicolor floral phenotype in Petunia hybrida［J］.Plant J.，2012，70(5):739-749.

［44］Elomaa P，Honkanen J，Puska R，et al..Agrobacteriummediated transfer of antisense chalcone synthase cDNA to Gerbera hybrida inhibitsflowerpigmentation ［J］. Nat.Biotechnol.，1993，11(4):508-511.

［45］Kamiishi Y，Otani M，Takagi H，et al..Flower color alteration in the liliaceous ornamental Tricyrtis sp.by RNA interference-mediated suppression of the chalcone synthase gene［J］.Mol.Breed.，2012，30(2):671-680.

［46］Mehdy M C，Lamb C J.Chalcone isomerase cDNA cloning and mRNA induction by fungal elicitor，wounding and infection［J］.EMBO J.，1987，6(6):1527-1533.

［47］van Tunen A J，Koes R E，Speit C E，et al..Cloning of two chalcone flavone isomerase genesfrom Petunia hybrida:coordinate light-regulated and differential expression of flavonoid genes［J］.EMBO J.，1988，7(5):1257-1262.

［48］Norimoto S，Toshio A，Shusei S，et al..A cluster of genes encodes the two types of chalcone isomerase involved in the biosynthesis of general falavonoids and legume specific 5-deoxy(iso)flavonoid in Lotus japonicu［J］.Plant Physiol.，2003，131(3):941-951.

［49］Muir S R，Collins G J，Robinson S，et al..Overexpression of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols［J］.Nat.Biotechnol.，2001，19(5):470-474.

［50］Nishihara M， Nakatsuka T， Yamamura S. Flavonoid components and flower color change in transgenic tobacco plants by suppression of chalcone isomerase gene［J］.FEBS Lett.，2005，579(27):6074-6078.

［51］Li F X，Jin Z P，Qu W Q，et al..Cloning of a cDNA encoding the Saussurea medusa chalcone isomerase and its expression in transgenic tobacco［J］.Plant Physiol.Biochem.，2006，44(7-9):455-461.

［52］Zhou L，Wang Y，Ren L，et al..Overexpression of Ps-CHI1，a homologue of the chalcone isomerase gene from tree peony(Paeonia suffruticosa)，reducesthe intensity offlower pigmentation in transgenic tobacco［J］.Plant Cell Tissue Organ Cult.，2014，116(3):285-295.

［53］Martin C， Prescott A， Mackay S， et al.. Control of anthocyanin biosynthesis in flowers of Antirrhinum majus［J］.Plant J.，1991，1(1):37-49.

［54］Deboo G B，Albertsen M C，Taylor L P.Flavanone-3-betahydroxylase transcripts and flavonol accumulations are temporally coordinate in maize anthers［J］.Plant J.，1995，7(5):703-713.

［55］Amir Z，Tzvi T，Hagit B M，et al..Modification of flower color and fragrance by antisense suppression of the flavanone 3-hydroxylase gene［J］.Mol.Breed.，2002，9(1):33-41.

［56］Takashi N，Masahiro N，Keiichiro M，et al..Heterologous expression of two gentian cytochrome P450 genes can modulate the intensity of flower pigmentation in transgenic tobacco plants［J］.Mol.Breed.，2006，17(2):91-99.

［57］Jiang F，Wang J Y，Jia H F，et al..RNAi-mediated silencing of the flavanone 3-hydroxylase gene and its effect on flavonoid biosynthesis in strawberry fruit［J］.J.Plant Growth Regul.，2013，32(1):182-190.

［58］Heller W，F(xiàn)orkmann G，Britsch L，et al..Enzymatic reduction of(+)-dihydroflavonols to favan-3，4-cisddiols with flower extracts from Matthiola incana and its role in anthocyanin biosynthesis［J］.Planta，1985，165(2):284-287.

［59］Shimada N，Sasaki R，Sato S， et al.. A comprehensive analysis of six dihydroflavonol 4-reductases encoded by a gene cluster of the Lotus japonicus genome［J］.J.Exp.Bot.，2005，56(419):2573-2585.

［60］Rosati C，Simoneau P，Treutter D，et al..Engineering of flower color in forsythia by expression of two independentlytransformed dihydroflavonol4-reductase and anthocyanidin synthase genes of flavonoid pathway［J］.Mol.Breed.，2003，12(3):197-208.

［61］Mori S，Kobayashi H， Hoshi Y， et al.. . Heterologous expression of the flavonoid 3'，5'-hydroxylase gene of Vinca major alters flower color in transgenic Petunia hybrida［J］.Plant Cell Rep.，2004，22(6):415-421.

［62］Xie D Y，Sharma S B，Dixon R A.Anthocyanidin reductases from Medicago truncatula and Arabidopsis thaliana［J］.Arch.Biochem.Biophys.，2004，422(1):91-102.

［63］Chung S J，Lee G J， Lee H J， et al.. Isolation of a leucoanthocyanidin dioxygenase(LDOX)gene from a spray-type chrysanthemum(Dendranthema×grandiflorum)and its colored mutants［J］.Korean J.Hortic.Sci.，2010，28:818-827.

［64］Appelhagen I， Jahns O， Bartelniewoehner L， et al..Leucoanthocyanidin Dioxygenase in Arabidopsis thaliana:Characterization of mutant alleles and regulation by MYBBHLH-TTG1 transcription factor complexes［J］.Gene，2011，484(1-2):61-68.

［65］Menssen A，H?hmann S，Martin W，et al..The En Spm transposable element of Zea mays contains splice sites at the temin generating a novel intron from sSpm element in the A2 gene［J］.EMBO J.，1990，9(10):3051-3057.

［66］Rosati C， Cadic A， Duron M， et al.. Molecular characterization of the anthocyanidin synthase gene in Forsythia intermedia revealsorgan-specific expression during flower development［J］.Plant Sci.，1999，149(1):73-79.

［67］Noriko N，Masako F M，Kiyoshi M，et al..RNAi suppression of the anthocyanin synthase gene in Torenia hybrida yields white flowers with higher frequency and better stability than antisense and sense suppression［J］.Plant Biotechnol.，2006，23(1):13-18.

［68］Reddy A M，Reddy V S，Scheffler B E， et al.. Novel transgenic rice overexpressing anthocyanidin synthase accumulates a mixture of flaconoids leading to an increased antioxidant potential［J］.Metab.Eng.，2007，9(1):95-111.

［69］祝欽龍.彩葉草(Solenostemon scutellarioides)葉色形成相關(guān)的花色素苷生物合成途徑的分子調(diào)控研究［D］.重慶:西南大學(xué)，博士學(xué)位論文，2007.

［70］周惠，文錦芬，鄧明華，等.植物花青素生物合成相關(guān)基因研究進(jìn)展［J］.辣椒雜志，2011，(4):1-7.

［71］許志茹，李春雷，崔國新，等.植物花青素合成中的MYB蛋白［J］.植物生理學(xué)通訊，2008，44(3):597-604.

［72］夏玉鳳，耿曉娜，王萬雙，等.植物花色素代謝途徑改變機(jī)理及應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2009，10:26-33.

［73］Michael L R，Rajandeep S S，Robert M，et al..A mutator transposon insertion is associated with ectopic expression of a tenderly repeated multistory Myb gene pericarp color1 of maize［J］.Genetics，2008，178(4):1859-1874.

［74］Maike S，Christiane B，Wusirika R，et al..The regulatory regions required for B'paramutation and expression are located far upstream of the maize b1 transcribed sequences［J］.Genetics，2002，162(2):917-930.

［75］Goff S A，Cone K C，F(xiàn)romm M E.Identification of functional domains in the maize transcriptional activator CI:Comparison of wild-type and dominant inhibitor proteins［J］.Genes Dev.，1991，5(2):298-309.

［76］Doshi K M，Eudes F，Laroche A，et al..Transient embryospecific expression of anthocyanin in wheat［J］.In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant，2006，42(5):432-438.

［77］Doshi K M， EudesF， LarocheA， et al.. Anthocyanin expression in marker free transgenic wheat andtriticale embryos［J］.In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant，2007，43(5)，429-435.

［78］van der Meer I M，Spelt C E，Mol J N，et al..Promoter analysis of the chalcone synthase(chsA)gene of Petunia hybrida:a 67 bp promoterregion directsflower-specific expression［J］.Plant Mol.Biol.，1990，15(1):95-109.

［79］楊翅春，于靜娟，趙倩，等.玉米花青素調(diào)節(jié)基因Lc對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和矮牽?；ㄉ挠绊懀跩］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，15(1):85-89.

［80］趙欣梅，吳樹彪，王亦學(xué)，等.花青素合成調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄因子作為直觀標(biāo)記的載體構(gòu)建及其在玉米幼胚中的瞬間表達(dá)［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2014，(4):77-82.

［81］黃艷嵐，劉仕蕓，張樹珍，等.馬鈴薯花青素轉(zhuǎn)錄激活基因(stmyc)的克隆及表達(dá)分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，17(5):941-942.

［82］Kortstee A J，Khan SA，Helderman C，et al..Anthocyanin production as a potentialvisual selection marker during plant transformation［J］.Transgenic Rep.，2011，20(6):1253-1264.

［83］Pandey A，Misra P，Chandrashekar K，et al...Development of AtMYB12-expressing transgenic tobacco callus culture for production of rutin with biopesticidal potential［J］.Plant Cell Rep.，2012，31(10):1867-1876.

［84］Butelli E， Titta L，Giorgio M，et al.. Enrichment of tomatofruit with health-promoting anthocyanins by expression of select transcripation factors［J］.Nat.Biotechnol.，2008，26(11):1301-1308.

［85］Lloyd A M，Walbot V，Davis R W.Arabidopsis and Nicotiana anthocyanin production activated by maize regulators R and Cl［J］.Science，1992，258(5089):1773-1775.

［86］Kim Y.Expression analysis of maize C1 regulatory gene in transgenic tobacco plants(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)［J］.J.Korean Soc.Hortic.，2001，42(5):487-491.

［87］Napoli C，Lemieux C，Jorgensen R.Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans［J］.Plant Cell，1990，2(4):279-289.

［88］Shimada Y，Ohbayashi M，Nakano-Shimada R，et al..Genetic engineering of the anthocyanin biosynthetic pathway with flavonoid-3'，5'-hydroxylase:Specific switching of the pathway in petunia［J］.Plant Cell Rep.，2001，20(5):456-462.

［89］Liu D，Galli M，Crawford N M.Engineering variegated floral patterns in tobacco plants using the Arabiodopsis transposable element Tag1 ［J］.Plant Cell Physiol.，2001，42(4):419-423.

［90］Liu Y S，Petolino J F.Pigmented maize seed viatissue-specific expression of anthocyanin pathway genetranscription factors［J］.Mol.Breed.，2006，18(1):57-67.

［91］巴超杰，薛靜，陳緒清，等.利用花青素可視化跟蹤表達(dá)系統(tǒng)快速篩選表達(dá)Cry1Ab/c基因的轉(zhuǎn)基因玉米［J］.植物學(xué)報(bào)，2013，48(1):59-64.

［92］Qiu J，Sun S Q， Luo S Q，et al.. Arabidopsis AtPAP1 transcription factor induces anthocyanin production in transgenic Taraxacum brevicorniculatum［J］.Plant Cell Rep.，2014，33(4):669-680.

［93］Halliwell B.Free radicals and antioxidants:An personal view［J］.Nutr.Rev.，1994，52(8):253-265.

［94］方忠祥，倪元穎.花青素生理功能研究進(jìn)展［J］.廣州食品工業(yè)科技，2001，17(3):60-62.

［95］趙德永.植物花青素生物合成途徑相關(guān)基因研究進(jìn)展及其基因工程修飾［J］.熱帶生物學(xué)報(bào)，2012，3(1):92-98.

［96］龍剛，曾佑煒，徐良雄，等.若干因子對(duì)唐菖蒲花瓣提取物DPPH清除率的影響［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2005，34(1):18-20.

［97］石少川，高亦珂，張秀海，等.植物花青素生物合成相關(guān)基因的研究及應(yīng)用［J］.植物研究，2011，31(5):633-640.