棉花WRKY基因GhWRKY25的克隆和表達分析

楊淑巧， 王志安， 張安紅， 許 琦， 肖娟麗， 羅曉麗

山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運城044000

棉花是重要的經(jīng)濟作物，其纖維是世界紡織工業(yè)的重要原料。同時棉花還是油料、飼料和其他工業(yè)原料的重要來源之一［1］。然而棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)受到蟲害、病害和各種逆境的影響，每年因為這些不利因素的影響造成棉花的損失在15%以上［2］。同時在我國存在著糧食作物與棉花種植競爭利用土地的問題，為了保證糧食安全，棉花的種植面積和種植地都要相應(yīng)發(fā)生變化。在不利于糧食作物種植的鹽堿地和干旱地種植棉花成為棉花研究的一個方向。目前的研究集中在加強棉花抗逆育種和抗逆栽培上?？鼓婷藁ㄆ贩N培育的研究最大的難點是抗逆資源的挖掘，然而常規(guī)育種的方法很難有效地獲得這些抗逆資源。利用基因工程方法，尤其轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功培育了一些抗性品種，如商業(yè)化推廣的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。因此，抗逆棉花品種培育可應(yīng)用轉(zhuǎn)基因手段，加快抗逆材料的獲得。克隆有效的抗逆基因成為當(dāng)今棉花抗逆育種的基礎(chǔ)和研究熱點。

轉(zhuǎn)錄因子WRKY能夠調(diào)控植物的生長發(fā)育和對周圍逆境的適應(yīng)性［3］，WRKY 基因家族［4，5］在植物中普遍存在，如已報道的甘薯［6］、歐芹［7］、擬南芥［8］、水稻［9］等，并且該基因家族包含基因數(shù)量眾多，擬南芥中有74個 WRKY基因［10］，水稻中有100多個［9］。WRKY基因家族的主要功能是參與植物對鹽堿、干旱和極端溫度等逆境的抗性，這與其蛋白的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。WRKY蛋白一般包括1～2個WRKY結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域由大約60個氨基酸組成。WRKY結(jié)構(gòu)域有一個高度保守的氨基酸序列WRKYGQK，這也是該結(jié)構(gòu)域名稱的來由［11］，在該結(jié)構(gòu)域的C端包含一個鋅指結(jié)構(gòu)。在植物中WRKY基因分為3類，分別為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類，Ⅰ類的 WRKY蛋白包含兩個WRKY結(jié)構(gòu)域和一個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，Ⅱ類和Ⅲ類均只包含一個WRKY結(jié)構(gòu)域，只是Ⅱ類的鋅指結(jié)構(gòu)和Ⅰ類相同，而Ⅲ類的鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC。根據(jù)氨基酸序列的差異，Ⅱ類WRKY也可分為5個亞類，分別為ⅡA、ⅡB、ⅡC、ⅡD 和ⅡE［4］，其作用的DNA序列順勢因子為W-box，即(T)(T)TGAC(C/T)序 列［7，12］。WRKY 蛋 白 結(jié) 合 于W-box調(diào)控其下游基因的表達，從而行使其抗逆功能。

雖然目前在棉花中已經(jīng)有不同的WRKY基因的克隆和功能研究報道，然而相對于擬南芥，棉花中WRKY基因的研究還遠遠不夠。本研究克隆了一個新的WRKY基因GhWRKY25，并對其組織特異表達、激素誘導(dǎo)和干旱鹽堿等逆境誘導(dǎo)表達進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為陸地棉品種中棉所35，種植于山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所溫室，28℃，16 h光照/8 h黑暗，常規(guī)管理。在棉花生育期中分別摘取棉花幼苗的根、莖、葉和棉花盛花期的蕾、花和鈴樣品，投入液氮中速凍保存在－80℃冰箱中待用。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑、Superscript RIII First Strand Synthesis System試劑盒購自美國Invitrogen公司;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Trans-T1 Phage Resistant)、BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA酶 I、pGEM-T Easy vector System 購自 Promega公司;SYBR Premix ExTaq、DNA聚合酶及限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司;T4 DNA Ligase購自Fermentas公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自GENEray公司;PCR純化試劑盒購自上海生工生物公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純?？寺y序由三博遠志生物技術(shù)有限公司提供。ABI-7000定量PCR儀為Applied Biosystem公司產(chǎn)品。

1.3 棉花組織總RNA的提取和cDNA的合成

稱取棉花樣品100 mg，利用Trizol試劑提取總RNA。在總RNA中加入DNA酶I處理去除殘留DNA。然后參照SuperScript R III First-Strand Synthesis System試劑盒方法，獲得cDNA用于基因克隆和定量PCR分析(qPCR)。

1.4 GhWRKY25基因的克隆

利用本實驗室建立的抗逆棉花葉片差減cDNA文庫獲得的WRKY基因EST(Expressed sequence tags)，用該EST序列獲得雷蒙德氏棉花的GrWRKY25序列。根據(jù)查找的全長序列設(shè)計編碼區(qū)上下游引物，引物序列為F:5'-atggcagagaaaaggacaag-3'和 R:5'-ttacactcttatctgctcctc-3'，以 棉 花cDNA為模板擴增全長。其產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下將目的片段切膠回收，連接到PGEM-T easy vector載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，進行藍白斑篩選，挑取白斑，菌落PCR檢測后，將陽性克隆測序。

1.5 GhWRKY25序列分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

在NCBI中選取不同植物的WRKY25的氨基酸序列，利用ClustalW2對比氨基酸序列，并進行結(jié)構(gòu)域的分析。在數(shù)據(jù)庫中選取不同類型的WRKY蛋白，利用 MEGA4.0程序來構(gòu)建有關(guān)WRKY蛋白的進化樹。

1.6 qPCR檢測棉花中GhWRKY25表達的組織特異性

提取棉花的根、莖、葉、蕾、花和幼鈴等器官的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進行定量PCR，檢測GhWRKY25基因在不同部位的表達。GhWRKY25基因擴增的引物為WRKY-F:5'-gggaaccctcatccaaggag-3'和WRKY-R:5'-cgtcgtggttatgcttcc-3'。以 ubiquitin基因(登錄號:AY189972)為內(nèi)參基因，引物為Ubi-F:5'-AAGACCTACACCAAGCCCAAG-3'和Ubi-R:5'-ACACTCCGCATTAGGACACTC-3'。qPCR 反應(yīng)體系為 25 μL，以定量稀釋后的cDNA 0.5 μL為模板。擴增條件為:95℃，1min;95℃，5 s;59℃，30 s;72℃，30 s;78℃，82℃，85℃各讀板一次，設(shè)置40個循環(huán)，繪制熔解曲線。設(shè)3次重復(fù)。運用Opticon Monitor 2軟件計算樣品的Ct值，并采用2－△△Ct計算方法求得樣品的相對表達量。

1.7 qPCR檢測不同處理條件下GhWRKY25的表達水平

中棉所35種子在溫室中種植，選取長勢一致的子葉期幼苗用來做不同處理。處理后的樣品提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，定量 PCR檢測GhWRKY25基因的表達水平變化。qPCR反應(yīng)條件及參考基因同1.6。

1.7.1 鹽處理 用300mmol/L NaCl澆灌棉花苗，模擬鹽脅迫條件。用清水處理的棉苗作為對照，每個處理3次重復(fù)。在處理后0 h、2 h、4 h、8 h和12 h時間點取植株葉片放入液氮中速凍，保存在－80℃冰箱中待用。

1.7.2 干旱處理 連續(xù)12 d停止?jié)菜?，直至葉片出現(xiàn)萎蔫。正常澆水的植株作為對照。在處理后0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d 和 12 d 時間點取早晨萎蔫回復(fù)的葉片和正常澆水的植株葉片，放入液氮中速凍，保存在－80℃冰箱中待用。

1.7.3 激素處理 對棉花苗進行不同激素的處理，處理的方法按照文獻報道進行［13］。噴灑激素的濃度分別為JA 100mmol/L、SA 2mmol/L、ABA 50 μmol/L、GA 1 μmol/L。處理后不同時間點取植株葉片放入液氮中速凍，保存在－80℃冰箱中待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhWRKY25基因的克隆和編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)分析

利用扣除差減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)方法對干旱處理的棉花表達進行分析，獲得一個與干旱相應(yīng)相關(guān)的EST庫，對所獲得的序列進行分析，篩選出一個與擬南芥WRKY25同源的WRKY基因EST，利用這個EST序列在雷蒙德氏棉花的基因組序列庫里獲得了該基因的全長，為1 551 bp。利用這個基因序列設(shè)計特異引物在陸地棉cDNA中進行擴增分離得到了基因序列一致的 WRKY序列，定名為GhWRKY25。進行氨基酸序列同源比對后可看出，GhWRKY25與苜蓿和擬南芥WRKY3的同源性較高，同源性分別達到96%和73%(見圖1)。同時我們發(fā)現(xiàn)GhWRKY25包含有兩個典型的WRKY結(jié)構(gòu)域和 C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，屬于Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。

2.2 GhWRKY25的系統(tǒng)進化樹分析

選取了不同植物且包括不同類的WRKY蛋白與 GhWRKY25進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，見圖2。可以看出，GhWRKY25和其他植物的WRKY3蛋白具有較高的親緣關(guān)系，屬于Ⅰ類WRKY，與可可(Theobroma cacao)WRKY3具有高度的親緣關(guān)系。該進化樹也表明了WRKY在植物中不斷進化和變異的情況，說明WRKY在植物中執(zhí)行著重要的生理和生化功能。

2.3 GhWRKY25的組織特異性分析

在轉(zhuǎn)錄水平分析GhWRKY25基因在棉花的根、莖、葉、蕾、花和幼鈴等器官的表達，結(jié)果表明GhWRKY25基因在這些器官中均有表達(見圖3)，說明該基因是一個組成型表達基因，同時發(fā)現(xiàn)其在花中的表達量較高，在蕾的表達量較低，暗示該基因行使功能可能存在組織特異性。

2.4 不同激素處理下GhWRKY25表達分析

植物激素與植物的抗逆過程密切相關(guān)，在逆境脅迫條件下，植物激素含量發(fā)生變化，從而影響一系列生理生化反應(yīng)以及有關(guān)基因的表達。為了研究GhWRKY25基因?qū)Σ煌に氐捻憫?yīng)，同時分析它在不同激素途徑中可能的分子機理，我們利用SA、JA、ABA和GA3對棉花進行處理，在轉(zhuǎn)錄水平分析其表達量，結(jié)果表明GhWRKY25在SA、JA、ABA和GA3處理下均在一段時間內(nèi)表現(xiàn)為上調(diào)表達。SA處理后GhWRKY25基因表達的上調(diào)幅度不如其他三個激素信號分子，JA、ABA和GA3處理后其表達均表現(xiàn)為先劇烈上升然后開始回落(見圖4)。而這三種激素處理使GhWRKY25基因的表達達到峰值的時間依次滯后約2 h。說明該基因能夠?qū)@些激素產(chǎn)生應(yīng)答，但是應(yīng)答模式不完全一致。

圖1 GhWRKY25與MtWRKY3、AtWRKY3氨基酸序列的同源性比對Fig.1 Alignment of the amino acid sequences of GhWRKY25 with MtWRKY3 and AtWRKY3.

圖2 GhWRKY25和其他植物WRKY的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of GhWRKY25 and other plant WRKY proteins.

2.5 干旱和鹽處理下GhWRKY25的表達分析

圖3 GhWRKY25在不同組織器官的表達Fig.3 Expression patterns of GhWRKY25 in different tissues.

盆栽棉花被停止?jié)菜?2 d后出現(xiàn)了萎蔫現(xiàn)象，分析在此期間每隔2 d GhWRKY25基因表達水平的變化，結(jié)果表明GhWRKY25基因被顯著地誘導(dǎo)(見圖5)，其表達量是對照的 4倍。用300mmol/L NaCl處理棉花，在不同時間點取樣進行qPCR分析，結(jié)果表明鹽處理的棉花葉片中Gh-WRKY25基因表達顯著提高，尤其在處理后8 h，轉(zhuǎn)錄水平最高，是水處理的3.6倍(見圖5)。上述結(jié)果提示GhWRKY25基因與干旱和鹽逆境顯著相關(guān)，表明該基因可能在逆境適應(yīng)上具有重要的功能。

3 討論

圖4 不同激素信號分子的處理下GhWRKY25的表達Fig.4 Expression patterns of GhWRKY25 after treatments by various hormone signaling molecules.

圖5 干旱和鹽處理下GhWRKY25的表達Fig.5 Expression patterns of GhWRKY25 under drought and salt stresses.

GhWRKY25基因是棉花眾多WRKY基因中一員，在棉花中該基因家族包含數(shù)十種甚至上百種這類轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子行使著多種功能，其中包括對外界不良環(huán)境的適應(yīng)等。這些基因在植物的生長發(fā)育和生理生化中起著重要的作用。

GhWRKY25在棉花各組織器官中均有表達，但在花和蕾中表達水平差異較明顯，蕾中表達量最低，而花中表達量上升至最高。提示其抗逆性調(diào)節(jié)與調(diào)節(jié)植物開花時間有關(guān)。與已知的一些棉花WRKY基因在各組織表達水平無明顯差異有所不同。GhWRKY25很可能作為一個與發(fā)育有關(guān)的關(guān)鍵因子，為深入研究棉花在逆境中的發(fā)育成熟機制提供可能。

從其他種類植物克隆得到的可響應(yīng)逆境的WRKY基因，過表達時一般能夠提高植物的抗逆性［4，14，15］，與之相似的是，GhWRKY25 對干旱和鹽逆境的響應(yīng)也為上調(diào)表達，該基因可能在這些逆境下，參與調(diào)控逆境適應(yīng)性相關(guān)基因的表達，從而產(chǎn)生抗逆性。在棉花中已經(jīng)分離出幾個能夠?qū)Ω珊岛望}脅迫產(chǎn)生抗性的WRKY，如GhWRKY3［16］、GhWRKY40［17］、GhWRKY39 等［18］。我們所分離的GhWRKY25作為一個新的WRKY基因，可能成為棉花抗逆分子育種的候選基因。

已知SA等多種激素在逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。GhWRKY25基因?qū)Χ喾N激素 SA、JA、ABA和GA具有應(yīng)答反應(yīng)，暗示著這個基因?qū)γ藁ǖ目鼓婀δ芸赡苁峭ㄟ^這些激素信號分子及其信號通路進行的。在擬南芥、水稻等植物［19～21］的研究中，有一些類似的報道也表明WRKY是通過參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而調(diào)控下游抗逆基因的表達。

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