RAPD及SRAP兩種分子標(biāo)記技術(shù)對苦瓜雜交種純度的鑒定分析

張少平， 張玉燦，2*， 張偉光， 賴正鋒， 鄭云云， 陳玉水

1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院閩臺園藝研究中心，福建漳州363005;

2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州350003;

3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，福州350003

苦瓜(Momordica charantia L.)是盛夏時期長江以南地區(qū)的重要蔬菜，其清爽解暑、營養(yǎng)豐富、且含有多種人體必需的微量元素，是典型的藥食同源瓜類蔬菜［1］。近年來，苦瓜在我國的商品化種植面積逐年擴(kuò)大，已成為一種較有發(fā)展前景的經(jīng)濟(jì)作物。福建省是苦瓜的主產(chǎn)區(qū)之一，年播種面積約1.5萬hm2。苦瓜雜種優(yōu)勢明顯，所以目前苦瓜商品化種植所需種子一般都為F1代雜交種。近年來，我國很多地方都加大了苦瓜新品種的引進(jìn)及選育，苦瓜新品種推陳出新的速度較快。因此，對育成品種進(jìn)行快速鑒定及保護(hù)具有十分重要的現(xiàn)實意義，以往形態(tài)特征鑒別苦瓜種質(zhì)和鑒定雜交種純度具有很大的局限性，而分子標(biāo)記技術(shù)具有直觀、方便、快速及成本低等特點，已被越來越普遍地應(yīng)用于許多植物品種的鑒別及指紋圖譜的構(gòu)建［2～6］。苦瓜品種的分子鑒別也有一些報道［7～10］。本研究以苦瓜雜交種如玉11號及其親本為材料，采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)及相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence—related amplified polymorphism，SRAP)兩種分子標(biāo)記技術(shù)，通過前期引物篩選及反復(fù)驗證，建立了如玉11號苦瓜F1代雜交種純度分子鑒定的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苦瓜雜交種為如玉11號(審定編號:閩認(rèn)菜2010002)，母本BAL-22-31是由日本“群星”苦瓜經(jīng)過多代自交純化而成的自交系，父本9208B是由福建漳平“西園”苦瓜經(jīng)多代純化而成的自交系，上述材料均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所提供。Taq酶、dNTPs、瓊脂糖以及合成RAPD引物及SRAP引物等均購自生工(上海)生物技術(shù)有限公司;其他常規(guī)試劑均購自漳州市翠林化玻儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1 2.1 不同苦瓜基因組DNA的提取 以上述三種苦瓜幼苗嫩葉作為試驗材料，采用改良的CTAB法［11］提取其總DNA，用紫外分光光度計在260 nm和280 nm下測定其OD值，檢測DNA的濃度及質(zhì)量，并稀釋至30 ng/μL左右，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RAPD及SRAP多態(tài)性引物設(shè)計與篩選根據(jù)目前在苦瓜上已報道的46個有效RAPD引物設(shè)計合成 RAPD 引物［12～16］(見表1);根據(jù)SPAP引物設(shè)計原理合成22條引物，隨機(jī)組合成121對SRAP引物(見表2)。使用上述3種苦瓜的混合DNA對121對引物進(jìn)行預(yù)篩選，篩選背景和擴(kuò)增條帶都比較清晰的SRAP引物。使用全部121對SRAP引物和46個RAPD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析差異條帶，篩選出現(xiàn)差異條帶的引物。對篩選到的出現(xiàn)特異條帶的RAPD及SRAP引物，再次進(jìn)行重復(fù)驗證(重復(fù)提取3次DNA，以其為模板進(jìn)行5次RAPD-PCR和SRAPPCR重復(fù)實驗)，以獲得穩(wěn)定重復(fù)差異條帶的RAPD及SRAP引物。

表1 本研究中應(yīng)用的46個RAPD引物Table 1 46 RAPD primers used in this study.

表2 本研究應(yīng)用的121對SRAP引物序列Table 2 121 SRAP primers used in this study.

1.2.3 RAPD及 SRAP擴(kuò)增 RAPD及 SRAP擴(kuò)增反應(yīng)均在PCR儀上完成。RAPD-PCR反應(yīng)體系(20 μL)為:Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTPs(2.5mmol/L)1.6 μL，DNA模板 0.5 μL，擴(kuò)增引物(10 μmmol/L)4 μL，加ddH2O至20 μL。RAPD擴(kuò)增程序為:95℃ 3min;94℃ 1min，36℃ 1min，72℃ 2min，45 個循環(huán);72℃ 5min。于4℃保存或直接電泳檢測。SRAPPCR 反應(yīng)體系(20 μL)為:Taq DNA 酶(5 U/μL)0.2 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTPs(2.5mmol/L)1.6 μL，DNA 模板 0.5 μL，10 μmmol/L 的上下游引物各 4 μL，加 ddH2O 至 20 μL。SRAP 擴(kuò)增程序為:95℃ 3min;94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 1min，5 個循環(huán);94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，35個循環(huán);72℃ 10min。于4℃保存或直接電泳檢測。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析 所得RAPD-PCR及SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物每管加入約3 μL 6 ×PCR loading buffer，其中 RAPD-PCR 產(chǎn)物用1.5%、SRAP-PCR產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，電壓為8 V/cm，電泳1.5 h后EB染色，紫外燈下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種苦瓜基因組DNA提取結(jié)果分析

本試驗采用改良的CTAB法提取如玉11號及其親本苦瓜新鮮嫩葉片總DNA，通過測定其OD值及檢測DNA濃度和質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)該3種苦瓜DNA提取的含量均較高，且總DNA中多酚類化合物及多糖等污染物均去除的較為干凈，DNA完整性也較好(見圖1)，適于下一步RAPD及SRAP多態(tài)性分析。

圖1 三種苦瓜總DNA提取電泳圖Fig.1 Electrophoresis of genome DNA of 3 bitter gourds.

2.2 RAPD多態(tài)性引物篩選

采用已報道的46個RAPD引物對苦瓜F1代雜交種及其親本基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)試驗結(jié)果顯示，46對RAPD引物均未獲得如玉11號苦瓜雜交種及其親本共顯性條帶，也未獲得父本特異標(biāo)記引物，僅1個引物R5產(chǎn)生了母本特異標(biāo)記條帶(見圖2)。利用R5引物可以區(qū)分如玉11苦瓜雜交種與其母本種子。

圖2 引物R5擴(kuò)增圖譜Fig.2 RAPD-PCR results using primer R5.

2.3 SRAP多態(tài)性引物篩選

采用121對SRAP引物進(jìn)行如玉11苦瓜及其親本混合DNA預(yù)篩選擴(kuò)增，其中20對引物擴(kuò)增結(jié)果背景清晰、條帶數(shù)量少且清楚，編號分別為:Me1-Em1、Me1-Em4、Me1-Em9、Me2-Em4、Me2-Em5、Me2-Em8、Me3-Em2、Me3-Em8、Me4-Em9、Me4-Em10、Me5-Em4、Me5-Em5、Me5-Em9、Me6-Em1、Me6-Em2、Me6-Em10、Me7-Em1、Me7-Em8、Me7-Em9和Me8-Em10，利用這20對引物進(jìn)行3種苦瓜差異片段擴(kuò)增試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這20對SRAP引物在3種不同苦瓜中擴(kuò)增出完全相同的條帶。因此重新利用其余的101對引物再次進(jìn)行SRAP擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1對引物(編號Me1-Em6)產(chǎn)生了母本特異標(biāo)記(見圖3)。

圖3 引物Me1－Em6擴(kuò)增圖譜Fig.3 SRAP-PCR results using primer Me1-Em6.

2.4 如玉11號苦瓜雜交種子純度的檢測

挑選190粒如玉11號F1代種子及10粒其母本種子，標(biāo)記后同時播種于穴盤育苗，待幼苗長至2片真葉時，每株分別采取半片葉按1.2.1方法提取DNA，分別用RAPD技術(shù)(引物R5)及SRAP技術(shù)(引物Me1-Em6)進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RAPD-PCR(見圖4)及 SRAP-PCR(見圖5)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后條帶結(jié)果與前期篩選的結(jié)果完全吻合，且重復(fù)性好。其中7號和11號種子出現(xiàn)母本特異條帶，鑒定為假雜交種，兩種技術(shù)的檢測結(jié)果一致。說明應(yīng)用上述引物，RAPD和SRAP技術(shù)都可用于識別由苦瓜母本植株自花授粉而產(chǎn)生的假雜交種。

圖4 RAPD-PCR檢測種子純度Fig.4 Seed purity identification by RAPD-PCR.

圖5 SRAP-PCR檢測種子純度Fig.5 Seed purity identification by SRAP-PCR.

3 討論

雜交種子純度的分子鑒定一般采用一對雙親互補型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或者采用偏父及偏母型引物組合的交叉驗證法［3，11］。然而本試驗同時采用RAPD和SRAP兩種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行如玉11號苦瓜及其親本PCR擴(kuò)增時，均只擴(kuò)增出由一組引物產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記。理論上，該母本特異標(biāo)記不能直接運用于苦瓜如玉11號種子純度的鑒定，然而在苦瓜雜交育種的實際生產(chǎn)運用中，在辨別該雜交種是否由其父母本雜交而來時，最容易發(fā)生混雜的假雜交種子是來自于母本植株的自花授粉，而本試驗RAPD及SRAP結(jié)果均獲得一個母本特異型標(biāo)記引物，這對苦瓜如玉11號種子純度的分子鑒定具有非?，F(xiàn)實的意義。

RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一般采用瓊脂糖凝膠介質(zhì)進(jìn)行分離，而SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可采用瓊脂糖凝膠及聚丙烯酰胺凝膠兩種不同介質(zhì)進(jìn)行分離。一般來說，聚丙烯酰胺凝膠電泳操作過程更為繁瑣，且其顯示出的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條帶繁多且復(fù)雜，這將給種子純度鑒定帶來很多不便。而瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物操作簡單、特異性條帶清晰、實際操作過程中易于辨別，因此本試驗采用了瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，RAPD-PCR試驗結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳背景條帶較SRAPPCR試驗結(jié)果更清楚，說明這與DNA模板質(zhì)量無關(guān)，可能是因為Me1-Em6引物特異性不是很強(qiáng)，但該引物檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性均很好，因此不影響如玉11號苦瓜種子純度的SRAP分子檢測。

本研究根據(jù)近年來在苦瓜上報道有效的RAPD引物共計46個，以及根據(jù)SRAP引物設(shè)計原理，隨機(jī)設(shè)計121對引物，進(jìn)行如玉11號苦瓜及其父母本差異基因篩選。從大量的試驗操作過程看，RAPD分子標(biāo)記只需1個引物，因此操作起來較SRAP分子標(biāo)記相對簡單，但在引物設(shè)計方面，因SRAP引物是兩兩配對而來，所以只需設(shè)計較少的引物就可以形成較多引物對進(jìn)行篩選試驗，同時，RAPD分子標(biāo)記開發(fā)較SRAP分子標(biāo)記更早，其應(yīng)用于苦瓜遺傳多用性分析及種子純度鑒定等較SRAP更多，因此在苦瓜上開發(fā)的較多的RAPD分子標(biāo)記引物，理論上可借鑒并用于如玉11號等苦瓜種子的純度鑒定，然而本試驗表明，其他苦瓜上已開發(fā)的RAPD標(biāo)記引物對如玉11號苦瓜種子純度鑒定參考價值不高，此兩種分子標(biāo)記結(jié)果也都只獲得一個母本特異標(biāo)記引物，說明如玉11號苦瓜F1代雜交種與其親本(尤其是父本)基因組DNA序列相似程度極高，這與張少平等［7］對新翠苦瓜種子純度的RAPD分子檢測結(jié)果相吻合，也符合劉愛群等［17］對分子標(biāo)記鑒定葫蘆科瓜類作物種子純度的研究進(jìn)展所做的總結(jié)。因此，此結(jié)果進(jìn)一步表明，要完全通過分子手段鑒定出如玉11號苦瓜F1代雜交種純度及對其新品種保護(hù)，除了需要選擇合適的分子標(biāo)記外，還需要設(shè)計足夠多的引物，只有這樣才有可能獲得有效且最佳的雙親互補型引物來建立苦瓜雜交種種子的分子水平質(zhì)量控制系統(tǒng)。

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