水稻中一個油菜素內(nèi)酯不敏感突變體的圖位克隆

祝步拓， 張 芊， 路鐵剛

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京100081

油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids，BRs)是植物體內(nèi)廣泛存在的一類甾醇類激素，在植物根莖伸長、維管束分化、光形態(tài)建成、種子發(fā)芽、生殖發(fā)育和向性建成等生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，此外油菜素內(nèi)酯還能提高植物的抗逆性和抗病性［1，2］。對于油菜素內(nèi)酯作用及信號轉(zhuǎn)導的研究已成為植物科學研究的熱點。

基于擬南芥突變體的研究，BRs信號轉(zhuǎn)導途徑網(wǎng)絡調(diào)控機制已基本清晰。通過對BRs不敏感突變體bri1(brassinosteriod-insensitive 1)的研究，克隆到了BRs的受體基因BRI1［3］。此突變體表現(xiàn)為矮小、葉片卷曲、葉色深綠、育性下降且不能被外源施加BRs所恢復。此后通過對BRI互作蛋白的研究進一步發(fā)現(xiàn)了 BAK1［4，5］。研究表明，BRs在細胞表面與受體BRI1結(jié)合，誘導BRI1和激酶抑制蛋白BKI1解離，同時介導BRI1與另一個跨膜受體激酶BAK1結(jié)合，BRI1和BAK1蛋白相互磷酸化，介導BR信號的轉(zhuǎn)導。BIN2和BSU1是BRs信號轉(zhuǎn)導過程中的重要組分，當BRs和BRI1蛋白結(jié)合時激活BSU1同時使BIN2失活，從而導致下游蛋白BZR1和BES1去磷酸化而激活，BZR1和BES1在核內(nèi)積累，直接調(diào)控BRs調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達;當BRs和BRI1解離時，BIN2被激活，進而 BIN2磷酸化 BZR1和 BES1，從而導致BZR1和BES1的失活［6］。

水稻是全世界最主要的糧食作物之一，油菜素內(nèi)酯可直接影響水稻的株型，進而影響水稻的生物量和產(chǎn)量［7］。隨著水稻基因組學的迅速發(fā)展和一系列水稻BRs相關(guān)突變體的發(fā)現(xiàn)，越來越多的水稻BRs合成和信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵元件被克隆和印證。水稻BR合成突變體(d2，dl1，brd1和brd2)，表現(xiàn)為矮小、去黃化、卷葉和葉直立等表型［8～11］。這些突變體的表型均是由于BRs的合成途徑被阻斷導致內(nèi)源BRs不足造成，可被外源施加BRs所恢復。在水稻中第一個被克隆的BRs信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因是OsBRI1。OsBRI1是水稻中可能的BRs受體，與擬南芥BRI1無論在結(jié)構(gòu)還是序列上都有著高度的相似性。他的突變體d61表現(xiàn)為矮化、葉片直立、對BRs的敏感性下降［12］。通過對水稻基因組序列的比對搜索，分離到了OsBRI1的兩個同源基因OsBRL1和OsBRL3。它們在水稻根中大量表達，并部分參與BRs的信號傳遞，與 OsBRI1存在著一定的功能冗余性［13］。通過反向遺傳學的方法相繼克隆到OsBZR1和OsBAK1，并 進 行 了 功 能 研 究［14，15］。OsGSK1 是BIN2在水稻中的同源基因，并在水稻逆境響應中發(fā)揮重要作用［16］。目前研究表明，BRs合成和信號轉(zhuǎn)導關(guān)鍵元件在單、雙子葉中的作用非常保守但也存在不同之處，并且還有很多BRs相關(guān)調(diào)控組分仍不清楚。本實驗室在水稻突變體庫中篩選得到了一個葉夾角減小突變體，其葉型直立、植株高度略矮并且對外源BRs表現(xiàn)不敏感。通過圖位克隆將其定位在了水稻第5號染色的2 004 032 bp至2 704 032 bp區(qū)間范圍內(nèi)，物理距離為700 kb。此區(qū)間尚無BRs相關(guān)基因報道。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

本實驗中水稻野生型材料為粳稻品種日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonica cv.Nipponbare)和秈稻品種Dular。水稻BRs不敏感突變體來源于本實驗室構(gòu)建的 T-DNA插入突變體庫［17］，遺傳背景為粳稻品種日本晴，經(jīng)自交獲得表型穩(wěn)定純合突變體el植株。

1.2 表型觀察

將日本晴和Dular兩種親本與el突變體種植于田間，各種植10行，每行10株。成熟后分別對植株葉夾角進行測量統(tǒng)計。

1.3 遺傳分析及基因定位群體的構(gòu)建

2011年5月在河北廊坊試驗基地種植各親本材料并套袋自交，同時配置Dular/el和日本晴/el雜交種。收取各系自交親本和F1代(Dular/el;日本晴/el)雜交種子。2012年春在海南三亞種植各親本和F1代雜交種子，收取親本和F2代種子。調(diào)查統(tǒng)計各個親本、F1代和F2代群體的植株形態(tài)。對F2代群體進行遺傳分離規(guī)律分析，確定突變體表型的顯隱性關(guān)系以及是否為單基因控制。

1.4 基因組DNA提取

采用改進的CTAB法［18］提取植株葉片DNA。對F2代植株，按5株/組，選取2組野生型表型單株，每組剪取等量葉片混合，構(gòu)建野生表型基因池。

1.5 Indel分子標記分析

通過比較粳稻亞種日本晴和秈稻亞種9311的全基因組序列，利用本實驗室曹建等開發(fā)的多態(tài)性引物對Dular/el F2代隱性表型混池進行初定位［19］，再用與該混池連鎖的初定位標記對隱性F2代全部單株進行連鎖分析，確定引物與F2代野生型表型群體的連鎖關(guān)系。本研究所用的多態(tài)性InDel標記見表1。

PCR 擴增體系(10 μL)為:ddH2O 6.1 μL，10 × PCR Buffer 1 μL，MgCl2(25mmol/L)0.6 μL，dNTP Mix(1mmol)0.2 μL，引物(2 pmoL，正向 + 反向)1 μL，Takara rTaq(5 U/μL)0.1 μL，DNA 模板(20 ng/μL)1 μL。PCR 擴增程序為:94℃預變性5min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，5個循環(huán);第二步，94℃變性30 s，58℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，33 個循環(huán);最后72℃下延伸7min。反應產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳電壓200 V，時間2 h 10min。電泳完成后用銀染顯色，在膠片觀察燈下觀察結(jié)果并照相。將電泳圖譜進行數(shù)值轉(zhuǎn)換:與隱性親本帶型一致的記為1型帶，與顯性親本帶型一致的記為2型帶，同時具有雙親本帶型的記為3型帶。

表1 本研究所用的多態(tài)性InDel標記Table 1 Polymorphic InDel markers used in this study.

1.6 遺傳作圖與基因定位分析

利用Mapmaker軟件［20］對轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)進行分析，并進行遺傳作圖，對突變基因進行定位分析。

1.7 BR敏感性實驗

1.7.1 葉夾角敏感性實驗 野生型和突變體水稻種子去皮后用75%乙醇滅菌1min，50%次氯酸鈉滅菌20min，更換次氯酸鈉一次繼續(xù)滅菌20min，之后在超凈臺中用滅菌超純水洗4次，浸泡30min，再次清洗4次，黑暗處萌發(fā)48 h。挑取萌發(fā)一致的種子接至1/2 MS培養(yǎng)基中，繼續(xù)黑暗培養(yǎng)8 d。于黑暗處剪取第二葉夾角上下各1cm的位置，分別用 0 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L和10 000 nmol/L 24-eBL(BRs類似物)避光處理48 h，隨后進行照相。用ImagineJ測量并統(tǒng)計野生型和突變體的葉夾角。

1.7.2 根敏感性實驗 野生型和突變體水稻種子同1.7.1滅菌處理、萌發(fā)后挑取萌發(fā)一致的種子接至含有 0 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L、10 000 nmol/L 24-eBL 的 1/2 MS培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)5 d后進行照相、測量。用ImagineJ對野生型和突變體根的長度進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 el的表型鑒定

突變體el較野生日本晴植株葉夾角明顯減小(見圖1A，彩圖見封三圖版)。對成熟時期植株進行田間測定，日本晴植株葉夾角為13.1±0.2°，而 el突變體為2.3 ±0.1°(見圖1B)。

圖1 成熟期野生型與el的葉夾角Fig.1 Leaf angle comparation between wild type and el mutant at mature stage.

2.2 el突變體的遺傳分析

將el突變體與日本晴進行雜交，獲得F1代雜交種子。種植F1代植株全部為葉夾角減小表型。由此表明，葉夾角減小的突變性狀受顯性基因控制，el為顯性突變體。經(jīng)F1代自交獲得的F2代分離群體中，野生型表型96株，突變體表型304株;野生型與突變體的比例符合1∶3的孟德爾遺傳理論分離比例(卡方檢驗P＞0.05，無顯著性差異)(見表2)。由此表明，葉夾角減小的突變表型由顯性單基因控制。

將el突變體與Dular雜交獲得F1代，而后F1代自交獲得F2代分離群體，對突變位點進行圖位克隆。

表2 F2代分離群體的統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of the phenotype of F2 segregating population.

2.3 el突變體突變位點的初步定位

用600對Indel引物對親本Dular和日本晴進行多態(tài)性分析，得到151對可以用于Dular和日本晴多態(tài)性分析的引物［19］。由于此突變表型為顯性突變，選擇野生型表型植株進行圖位克隆，野生型表型的帶型與Dular帶型一致。如圖2A所示，用上述151對引物對el/Dular F2代群體的2個野生型表型混池(5株/混池)進行分析，發(fā)現(xiàn)2個DNA混池與5-2分子標記完全連鎖。取20株野生型單株進一步驗證了5-2位點的連鎖。在5-2上下游合成InDel引物，最終用300棵野生型表型單株將突變位點定位在5號染色體InDel3和InDel4之間700 kb范圍內(nèi)，在Indel3處交換單株為4個，在Indel4處交換單株為6個，與Indel3-1標記共分離(見圖2B、2C)。

圖2 el突變位點粗定位Fig.2 Linkage analysis the mutant locus of el.

2.4 el突變體對BRs不敏感

在水稻中外加BRs通常會直接影響葉片的葉夾角。對el純合突變體進行葉夾角敏感性實驗，結(jié)果如圖3所示(彩圖見封三圖版)。在0～10 000 nmol/L不同濃度的24-eBL處理下，野生型的葉夾角分別為 85.2°、155°、157.5°、161.8°和 171.8°;而突變體植株的葉夾角分別為 7.4°、8.4°、11.31°、12.9°和 14.2°。不同濃度的處理下，突變體葉夾角均明顯小于野生型，且基本不張開，即對外源BRs沒有響應。由此表明el為BRs不敏感突變體。

圖3 不同濃度外源BRs對el第二葉夾角的影響Fig.3 Lamina joint assay of the el mutant in the presence of BRs in different concentrations.

進一步實驗檢測了植株根生長對外源BR的敏感性，結(jié)果如圖4所示(彩圖見封三圖版)。24-eBL可以抑制水稻根的生長，尤其在100 nmol/L以上濃度。突變體根的生長也受到抑制，然而在100 nmol/L以上濃度，24-eBL對突變體根長的抑制程度明顯低于野生型。由此可以進一步明確el為BRs不敏感突變體。

圖4 el突變體與野生型根部對外源BR的敏感度Fig.4 Root length assay of the el mutant in the presence of BRs in different concentrations.

3 討論

BRs是一類重要的植物激素，在植物的生長發(fā)育以及對外界環(huán)境條件的響應中發(fā)揮重要作用。BRs的信號轉(zhuǎn)導機制在雙子葉植物擬南芥中已經(jīng)取得重大進展，但在單子葉植物中研究尚不全面。此外，BRs對于提高水稻抗逆性和產(chǎn)量有著密切的關(guān)系。因此關(guān)于水稻BRs信號轉(zhuǎn)導的研究，有利于進一步明確BRs如何調(diào)控水稻的生長發(fā)育，為創(chuàng)制水稻理想株型提供理論依據(jù)。

BRs不敏感突變體是BRs相關(guān)研究的重要材料。目前利用BR不敏感突變體已克隆多個BRs信號轉(zhuǎn)導通路關(guān)鍵基因。水稻對BR最明顯的反應就是葉夾角的變化，外源施加微量的BRs就會引起葉夾角增大;而BRs缺失或不敏感都會導致葉片直立?；谶@一生理特性，以直立葉夾角為指標篩選水稻突變體，已找到一些水稻BRs合成和信號轉(zhuǎn)導的突變體如 d2、brd1、brd2、d11和d61。本研究從本實驗室創(chuàng)制的水稻突變體庫中發(fā)現(xiàn)了一個葉片直立突變體，經(jīng)遺傳學分析表明此表型為顯性單基因控制。且此純合突變體均表現(xiàn)對外源BRs不敏感:突變體的葉夾角在不同濃度BRs和不同時間處理下均明顯小于野生型;此外不同濃度BRs對el的根長抑制程度顯著低于野生型(見圖3，4)。由此表明此突變體的BRs信號轉(zhuǎn)導通路被抑制，使得水稻無法對BRs信號進行響應。由此可以推斷，其葉片直立的表型可能是由于突變體對內(nèi)源BRs不敏感所致。圖位克隆將其突變位點定位在第5號2 004 032 bp至2 713 034 bp區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間尚無BRs相關(guān)基因功能報道。本研究所獲得的el為BRs不敏感顯性突變體。此研究為克隆水稻BRs信號轉(zhuǎn)導通路關(guān)鍵基因奠定基礎。

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