印楝素作用分子靶標的研究

徐 霖,冉雪琴,王嘉福

(1.貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院, 貴州 貴陽 550005； 2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 貴州 貴陽 550025； 3.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程省重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

印楝素殺蟲活性具有廣譜、高效、低毒、易降解、無殘留、無抗藥性等優(yōu)點，且對脊椎動物無危害,是目前最具開發(fā)潛力的植物源農(nóng)藥.但其作用機理復(fù)雜，作用機制還未清楚，分子機制研究尚處于起步階段.有研究提示，細胞骨架肌動蛋白是印楝素作用的假想靶標蛋白[1]，主要是因為印楝素作用于昆蟲有2個最重要的特點：一是昆蟲細胞較哺乳動物細胞對印楝素敏感[2]，提示印楝素作用的靶蛋白是一種普遍存在但構(gòu)象不同或者在2種細胞中差異表達的蛋白，有研究發(fā)現(xiàn),雖然結(jié)合的氨基酸序列相似但結(jié)合后結(jié)構(gòu)完全不同，因此雖然序列幾乎沒有不同，但印楝素被藏在了哺乳動物細胞的β-肌動蛋白口袋里而不能起作用.二是印楝素作用范圍廣，作用方式多變，提示印楝素作用蛋白廣泛存在，細胞骨架肌動蛋白存在于一切真核細胞胞質(zhì)空間中,由蛋白質(zhì)纖維組成的高度動態(tài)的三維結(jié)構(gòu)的網(wǎng)架，而且在細胞內(nèi)廣泛分布于細胞質(zhì)及細胞核.細胞骨架肌動蛋白是否是印楝素作用的靶標分子還需要大量的驗證性試驗.本研究運用基因芯片技術(shù)結(jié)合Western蛋白檢測技術(shù)，進一步研究印楝素作用的分子靶標，為印楝素農(nóng)藥的開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1材料

印楝素A標準品(純度 95%，100 μg·mL-1),Sigma公司產(chǎn)品；果蠅S2細胞(購于武漢大學(xué)細胞典藏中心).

1.2試劑

胎牛血清(杭州四季青)；Schneider昆蟲細胞培養(yǎng)基粉劑(武漢創(chuàng)新生物)；MTT試劑盒(南京凱基)；二甲基亞砜(Amresco公司)；蛋白裂解液(ShineGene)； PVDF膜(Millipore公司)；一抗Mouse Anti-βactin (GenScript )；預(yù)染蛋白marker (Fermentas)；HRP二抗(GenScript)；內(nèi)參一抗Goat Anti-GAPDH (GenScript)；其他普通化學(xué)試劑(上?；瘜W(xué)試劑廠分析級試劑).

1.3主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱 (上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；倒置顯微鏡 (南京江南光電股份有限公司)； 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；連續(xù)波長分光光度計 (美國Bio-Rad)；96孔板、酶標板、玻璃勻漿器(寧波新芝DY89-1)；高速離心機(湖南湘儀H1650-W)；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(上海天能)；電泳儀(北京君意JY300C)；多用脫色搖床(蘇州捷美SYC-2101).

1.4細胞培養(yǎng)

果蠅S2細胞于25～28 ℃條件下培養(yǎng)(無需CO2)；過濾除菌細胞培養(yǎng)液原液在使用前添加10%滅活胎牛血清，3 d傳代1次.

1.5細胞增殖檢測[3]

取果蠅S2細胞，細胞計數(shù)器計數(shù)，保證細胞質(zhì)量濃度為 4×104個·孔-1,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔180 μL.邊緣孔設(shè)立為不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔, 并設(shè)立陰性對照組(有細胞但不加藥物)，置入細胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng) 24 h待細胞進入對數(shù)生長期，加入不同質(zhì)量濃度印楝素使終質(zhì)量濃度分別為0.01，0.1，0.5，1.0，2.0 mg·L-1培養(yǎng)，每個處理設(shè)3個重復(fù)，分別于24，48，72，96 h，每孔加入 MTT ( 5g·L-1)溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后中止培養(yǎng) ,離心去上清,加入 150 μL二甲基亞砜溶液 ,室溫下振蕩器振蕩 10 min,自動酶標儀比色 (波長 490 nm).測定吸光值 (A)，并計算細胞存活率和細胞抑制率.

1.6基因芯片檢測

經(jīng)印楝素處理細胞及總RNA交由Affymetrix公司進行基因芯片檢測，分別選擇Affymetrix公司的Gene-Chip Drosophila?Genome 2.0 Array，包含18 500 條果蠅(Drosophila melanogaster)的基因.

1.7western蛋白檢測

按常規(guī)方法完成SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)膜操作，封閉液封閉.一抗溫育1.5 h，TBST清洗3次，每次5 min，HRP二抗溫育1.5 h，TBST清洗4次，每次5 min.經(jīng)發(fā)光、顯影、定影，拍照.

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1印楝素處理果蠅的細胞形態(tài)變化

在光學(xué)顯微鏡下，果蠅S2細胞在培養(yǎng)瓶中呈半粘附狀態(tài)，細胞均勻分布，細胞透明，邊緣清晰，梭形細胞多.當(dāng)用印楝素處理細胞24 h后，細胞與瓶壁之間的粘附松散，分布開始不均勻，梭形細胞少見，個別細胞體積肥大，細胞之間的聯(lián)系松散，一些細胞邊緣不清楚并開始皺縮，細胞透明度降低;當(dāng)印楝素處理32 h后，空白組細胞梭形細胞繼續(xù)增多，但藥物處理組細胞幾乎無梭形細胞，中期細胞明顯增多.表明印楝素作用后，細胞分裂活動較弱，大部分細胞停留在分裂中期之前(圖1) .

2.2印楝素處理果蠅細胞增殖檢測

參考相關(guān)文獻報道[3]，并結(jié)合本研究小組試驗[4]，選用0.5 mg·L-1質(zhì)量濃度印楝素對處于對數(shù)生長期的果蠅S2細胞進行處理，并每24 h檢測毒理作用，各時間段細胞存活率及抑制率統(tǒng)計如表1所示.

圖1 印楝素(0.5 mg·L-1)處理前后果蠅S2細胞圖

表1存活率、抑制率統(tǒng)計

Table1Thestatisticofinhibitoryandsurvivalrate

組別Group時間/hTime吸光度A值A(chǔ)bsorbancevalue存活率/%Survival抑制率/%Inhibitionrate對照組Controlgoup00．3277±0．14571000試驗組Experimentalgroup240．2093±0．00166436480．1517±0．00734654720．1885±0．01205743960．1261±0．00233862

2.3果蠅基因芯片檢測

0.5 mg·L-1印楝素處理24 h并收集細胞進行基因芯片檢測，檢測到細胞骨架肌動蛋白以及細胞骨架肌動蛋白相關(guān)蛋白因子Act57B，Act42A，Arp14D，Arp53D，Actr13E，Act5C，Act87E均表達下調(diào)；而調(diào)控蛋白因子TSR，CNC均表達上調(diào)(表2).

表2 差異表達的細胞骨架肌動蛋白、相關(guān)蛋白及調(diào)控蛋白因子

2.4Western蛋白檢測

0.5 mg·mL-1印楝素處理24，32 h并收集細胞，以GAPDH為內(nèi)參，對Actin蛋白進行Western檢測.檢測到藥物處理24 h后，印楝素處理組的β-actin表達量為對照組的93.42%；藥物處理32 h后，處理組的β-actin為對照組的91.46%.藥物處理后，Actin蛋白表達有較顯著下調(diào)(如表3,圖2).

表3 藥物處理24 h及32 h actin蛋白檢測結(jié)果

圖2 SDS-PAGE膠電泳圖譜

3 結(jié)論及討論

有報道認為，印楝素A調(diào)節(jié)昆蟲生長發(fā)育可能是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)蛋白/肽的釋放而引起蛻皮的暫時延遲或抑制蛻皮作用[5]，但放射標記試驗表明,印楝素不能突破血腦屏障,但可積累分布在腦神經(jīng)分泌系統(tǒng)纖維的周緣,對其合成或釋放腦神經(jīng)分泌顆粒具抑制作用.有報道認為，印楝素A在體外能抑制β-微管蛋白的聚合[6]，但ANURADHA等[1]通過其他試驗證實該結(jié)論存在局限性,并且印楝素作用于細胞肌動蛋白β-actin的效果要比作用于微管蛋白要明顯.進一步還發(fā)現(xiàn)CycE，Cdc25等細胞周期蛋白和調(diào)控因子的過度表達可以修復(fù)印楝素誘導(dǎo)的表型異常和減少印楝素A所致的果蠅死亡.這說明印楝素A主要作用于細胞骨架肌動蛋白，引起果蠅發(fā)育異常和細胞凋亡等細胞缺陷.PRAVIN KUMAR等[7]也報道印楝素能夠直接作用于細胞肌動蛋白,使肌動蛋白發(fā)生解聚,并且作用位點與細胞松弛素很接近.

細胞骨架肌動蛋白在許多細胞生命活動中扮演著非常重要的角色，包括在細胞遷移、決定細胞形狀以及物質(zhì)運輸?shù)?除了以上功能，肌動蛋白還參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控：(1)參與核RNA運輸、加工[8～9]；(2)參與染色質(zhì)集縮構(gòu)建染色體的過程[10]; (3)細胞核肌動蛋白與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)整[11]; (4)在基因轉(zhuǎn)錄活動中亦有作用[12～13].通過基因芯片技術(shù)檢測到Actin蛋白及其相關(guān)蛋白因子均表達下調(diào)，如actin 57B, actin 42A, actin5C, actin87E, actin-related13E,actin-related protein14E, actin-related protein 53D等，它們下調(diào)倍數(shù)不高，但無一例外表達下調(diào)；另外，也檢測到beta-Spec(beta-Spectrin)，shot(kakapo)，fwd(four wheel drive)分別上調(diào)1.54478，1.81449，1.6119，它們負調(diào)控微管的聚合或解聚，調(diào)節(jié)細胞骨架微管組裝；cnc(cap and collar) 主要功能是細胞骨架微管的極性建立及保持，上調(diào)2.12108.肌動蛋白的這些特征及檢測到的肌動蛋白及肌動蛋白相關(guān)蛋白的因子均表達下調(diào)進一步從分子學(xué)角度論證了肌動蛋白極有可能是印楝素的靶標蛋白.

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