雞肌球蛋白質(zhì)的提取方法優(yōu)化研究

張秋會(huì), 趙改名, 李苗云, 田 瑋, 岳喜慶, 柳艷霞, 高曉平, 魏 鑫

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，高蛋白、低脂肪、低膽固醇的雞肉制品越來(lái)越受到消費(fèi)者的喜歡，但目前雞肉制品的種類單一、深加工產(chǎn)品較少，而雞肉蛋白質(zhì)的功能特性研究是雞肉制品開發(fā)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[1,2].肌肉蛋白質(zhì)不僅賦予產(chǎn)品特有的風(fēng)味、口感和營(yíng)養(yǎng)，還決定了制品的品質(zhì).肌球蛋白質(zhì)約占肌肉蛋白質(zhì)的1/3[3]，在肉制品加工中起重要作用，它的凝膠特性[4～6]不僅決定了肉制品的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)[7]，而且也對(duì)產(chǎn)品的保水性[8]、乳化性[9]等有很大作用.而多數(shù)相關(guān)研究集中在鹽溶蛋白質(zhì)凝膠的品質(zhì)特性上，缺乏單一肌球蛋白質(zhì)功能特性研究，關(guān)于提取方法的研究報(bào)道更少.肌球蛋白質(zhì)的提取方法最早是由NAUSS等[10]提出的，其基本原理是利用肌球蛋白質(zhì)的不溶于水，而溶解于中性鹽溶液，在飽和(NH4)2SO4溶液中可鹽析沉淀，可與肌動(dòng)蛋白質(zhì)結(jié)合形成肌動(dòng)球蛋白等物理化學(xué)特性[3]構(gòu)建的，后續(xù)的相關(guān)研究[11～15]多參考他的方法進(jìn)行的，只是在緩沖溶液種類、離心速度、硫酸銨分級(jí)沉淀的飽和度以及抑制蛋白質(zhì)水解和肌動(dòng)球蛋白生成上有所不同.但在肌球蛋白提取過(guò)程中，離心速度、硫酸銨分級(jí)沉淀的飽和濃度以及肌動(dòng)球蛋白沉淀上仍然存在不足.林麗軍[16]、韓敏儀等[17]對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，使肌球蛋白質(zhì)的提取方法更加具有可操作性.本試驗(yàn)主要是在前人研究的基礎(chǔ)上，借助于SDS-PAGE，針對(duì)肌球蛋白質(zhì)提取過(guò)程中肌動(dòng)球蛋白的沉淀次數(shù)和硫酸銨分級(jí)沉淀的飽和度條件進(jìn)行優(yōu)化研究，為肌球蛋白凝膠品質(zhì)特性研究奠定一定的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

6～8周的三黃雞；購(gòu)于河南省鄭州市某批發(fā)市場(chǎng).

1.2化學(xué)材料

電泳試劑為進(jìn)口分裝產(chǎn)品；SDS-PAGE蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為TAPARA公司的Premixed Protein Marker(broad)，貨號(hào)DPP530A.其他所使用的化學(xué)試劑均為分析純，市售.

1.3試驗(yàn)儀器

MJ-250PP01B絞肉機(jī)，廣東省美的生活電器制造有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；WH-866漩渦渦流攪拌器，江蘇省太倉(cāng)市華美生化儀器廠制造；PXSJ-216 pH計(jì)，上海精科儀器有限公司；ALLLEGRA-64A高速冷凍離心機(jī)，BECKMAN COULTER；DYY-5穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠；DYCZ-24 DN型電泳槽；EC3 Imaging System，Ultra-Violet Products Ltd..

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1 雞肌球蛋白的提取 健康的三黃雞(6～8周)，采用刺殺放血法放血，取下雞胸脯肉(燙毛僵直之前)，除去可視結(jié)締組織和脂肪，稱重，切碎，用絞肉機(jī)絞約2～3 min，形成肉糜.

肌球蛋白質(zhì)的提取參照NAUSS等[10]及林麗軍[16]的方法進(jìn)行.肌球蛋白溶液于0～4 ℃貯存(至多1周)，備用.

1.4.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用雙縮脲法[18]，標(biāo)準(zhǔn)蛋白采用牛血清白蛋白進(jìn)行.

1.4.3 肌球蛋白SDS-PAGE電泳 采用LAEMMLI[19]的不連續(xù)SDS-PAGE系統(tǒng)和郭堯君[20]、王家政等[21]的進(jìn)行，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17 %，聚合膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %，電泳初始電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓至120 V.

電泳結(jié)束后，小心取下分離膠，室溫染色過(guò)夜，再在室溫下脫色，每隔3～4 h換1次脫色液，至背景無(wú)色，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析.

1.4.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用單因素試驗(yàn)，分別測(cè)定了肌動(dòng)球蛋白的去除次數(shù)以及硫酸銨分級(jí)沉淀中硫酸銨的飽和度對(duì)肌球蛋白質(zhì)純度的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1.

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS19.0的ANOVA進(jìn)行方差分析，差異顯著性P<0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照上述肌球蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1.標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.2342x，R2=0.9997.提取的肌球蛋白質(zhì)量濃度為20～40 g·L-1，提取率在1%左右.

2.2肌球蛋白質(zhì)SDS-PAGE

圖2是肌球蛋白SDS-PAGE圖譜.從圖中可以看出，上述的蛋白質(zhì)電泳方法對(duì)蛋白質(zhì)的分離效果良好.肌球蛋白在電泳過(guò)程中變性分解為多條亞基，參照標(biāo)準(zhǔn)marker的相對(duì)分子質(zhì)量，計(jì)算所得7條亞基相對(duì)分子質(zhì)量分別為174.5，43.94，36.7，31.85，25.0，18.5，16.1 kD.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

肌球蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為470～510 kD，由2條分子量205 kD的重鏈和4條輕鏈(16，18，22，30 kD)組成[22,23]，也有學(xué)者認(rèn)為肌球蛋白質(zhì)由1條重鏈和3條輕鏈組成[11,17,24].綜合他人研究結(jié)果分析認(rèn)為，肌球蛋白的兩條重鏈沒有完全分開，而且存在一定的計(jì)算誤差，分子質(zhì)量為174.5 kD,43.94 kD和36.7 kD的亞基條帶是雜條帶，可能是沒有完全沉淀去除的肌動(dòng)球蛋白中的肌動(dòng)蛋白質(zhì)亞基和肌鈣蛋白[3]，因此可以針對(duì)雜蛋白進(jìn)行提取條件的優(yōu)化研究；其他4條帶(31.85，25.0，18.5，16.1 kD)為肌球蛋白質(zhì)的輕鏈.按照2條重鏈和4條輕鏈分子質(zhì)量計(jì)算，肌球蛋白亞基占亞基總量的86.44 %，因此，有待于對(duì)肌球蛋白的提取方法進(jìn)行優(yōu)化研究，以期提高肌球蛋白質(zhì)的純度.

S為樣品蛋白，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

2.3肌動(dòng)球蛋白沉淀次數(shù)對(duì)肌球蛋白質(zhì)純度的影響

肌動(dòng)球蛋白是肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白結(jié)合形成的不溶于水的復(fù)合體，具有ATP酶活性，Mg2+能激活[3].因此，利用這些特性，通過(guò)在提取過(guò)程中添加Mg2+和焦磷酸鈉來(lái)激活和分離肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，最終來(lái)提高肌球蛋白的純度.通過(guò)增加肌動(dòng)球蛋白沉淀次數(shù)來(lái)提高肌球蛋白質(zhì)純度的優(yōu)化研究尚未見相關(guān)報(bào)道.肌動(dòng)球蛋白沉淀次數(shù)對(duì)肌球蛋白純度的影響見表2.

由表2可知，隨著純化次數(shù)的增加提高，肌球蛋白純度顯著提高.因此，隨著肌動(dòng)球蛋白的沉淀次數(shù)增加可以顯著提高肌球蛋白質(zhì)的純度，但隨著沉淀次數(shù)的增多，肌球蛋白質(zhì)的提取率會(huì)有所下降，蛋白質(zhì)溶液的濃度也會(huì)降低，可能會(huì)影響肌球蛋白的得率，從而影響后期肌球蛋白凝膠制備時(shí)原材料量的制備效果.為了確保肌球蛋白凝膠特性研究的可靠性，研究肌球蛋白蛋白質(zhì)的提取率和純度是關(guān)鍵，因此，選擇合適的沉淀次數(shù)尤為重要，綜合考慮得率和純度，建議選擇沉淀次數(shù)為3次.

表2 肌動(dòng)球蛋白沉淀次數(shù)對(duì)肌球蛋白純度的影響

2.4硫酸銨飽和濃度對(duì)肌球蛋白質(zhì)純度的影響

鹽析在試驗(yàn)室中常常被用來(lái)純化分離蛋白質(zhì).不同的蛋白質(zhì)溶解度不同，可以通過(guò)加入無(wú)機(jī)鹽來(lái)控制蛋白質(zhì)的溶解度，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀[25,26].隨著無(wú)機(jī)鹽加入量的增加，不同蛋白質(zhì)在析出順序上有先后差異，因此可以通過(guò)控制無(wú)機(jī)鹽加入量，以分級(jí)鹽析的方式，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離純化.硫酸銨具有溶解度大，隨溫度變化小，對(duì)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是鹽析最常用的無(wú)機(jī)鹽[27].在肌球蛋白質(zhì)提取過(guò)程中，調(diào)整硫酸銨飽和度即可分離目的蛋白質(zhì).

硫酸銨初始飽和度對(duì)肌球蛋白純度的影響結(jié)果見表3.從結(jié)果中可以看出，隨著硫酸銨初始飽和度的增加，肌球蛋白的純度呈現(xiàn)先升高，再下降的整體變化趨勢(shì)；在硫酸銨初始飽和度為33%～37%時(shí)，肌球蛋白的純度顯著高于其他各水平，其中35%時(shí)，肌球蛋白的純度最高.

表3 硫酸銨初始飽和度對(duì)肌球蛋白純度的影響

硫酸銨終飽和度對(duì)肌球蛋白純度的影響結(jié)果見表4.從結(jié)果中可以看出，隨著硫酸銨終飽和度的增加，肌球蛋白的純度呈現(xiàn)先升高，再下降的整體變化趨勢(shì)；硫酸銨終飽和度為42%～48%時(shí)，肌球蛋白的純度隨著終飽和度的增加而升高，但各水平之間差異不顯著，其中48%時(shí)，肌球蛋白的純度最高；在50%～54%時(shí)，肌球蛋白純度隨著終飽和度的增加而降低，但各水平之間差異均不顯著.

表4 硫酸銨終飽和度對(duì)肌球蛋提取純度的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)所建立的電泳試驗(yàn)條件可以用于肌球蛋白的純度分析.肌動(dòng)球蛋白的沉淀次數(shù)增多可以顯著提高肌球蛋白的純度，但沉淀次數(shù)增多就降低了提取率，較低的蛋白質(zhì)濃度不利于凝膠的制備.因此，采用肌動(dòng)球蛋白的沉淀次數(shù)為3 次比較具有實(shí)際意義.硫酸銨分級(jí)沉淀中初始飽和濃度為35 %，終飽和濃度為48 %時(shí)，肌球蛋白質(zhì)純度較高，這些肌球蛋白質(zhì)的提取方法中涉及的因子和條件的優(yōu)化為肌球蛋白質(zhì)凝膠的品質(zhì)特性研究奠定了基礎(chǔ).

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