印楝素干粉的制備及生物活性測定

李一鳴， 陳孝甜， 王勇慶， 程東美， 張志祥

(1 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 忡愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510225)

印楝素干粉的制備及生物活性測定

李一鳴1， 陳孝甜1， 王勇慶1， 程東美2， 張志祥1

(1 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 忡愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510225)

【目的】測定印楝素干粉及印楝素A、印楝素B的生物活性，建立印楝素干粉中印楝素含量的檢測方法?！痉椒ā坎捎靡宜嵋阴ソ岱ㄖ苽溆￠馗煞郏琀PLC法檢測印楝素含量，葉碟法測定生物活性。【結(jié)果】處理 24 h后，印楝素干粉對斜紋夜蛾Spodopteralitura2 齡幼蟲和大菜粉蝶Pierisbrassicae3齡幼蟲的AFC50值分別為0.28和70.71 μg·mL-1，拒食活性明顯高于印楝素A和印楝素B?！窘Y(jié)論】該干粉制備方法不僅簡單有效，且生物活性良好，具有推廣應(yīng)用價值。

印楝素干粉； 斜紋夜蛾； 大菜粉蝶； 乙酸乙酯浸提法； 葉碟法； HPLC； 生物活性

印楝Azadirachtaindica為楝科楝屬喬木[1]，原產(chǎn)國主要是印度和緬甸，大多分布在熱帶以及亞熱帶地區(qū)[2]。1983年，印楝首次被引入我國，該項目由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)趙善歡教授發(fā)起，后在海南省、四川省和云南省大面積引種并獲得成功[3]。印楝素是從印楝中提取出來的一種四環(huán)三萜類固醇化合物[4-5]，對昆蟲具有胃毒、觸殺、拒食、驅(qū)避、抑制呼吸[6-7]、調(diào)節(jié)生長和節(jié)育等作用[8]。雄性和雌性大鼠試驗表明印楝素對脊椎動物是安全的，以每天500、1 000和1 500 mg·kg-1的劑量口服施用持續(xù)90 d，沒有產(chǎn)生生理毒性、死亡，組織質(zhì)量、病理學(xué)、血清和血液參數(shù)沒有變化[9]。研究表明印楝素對大部分農(nóng)業(yè)害蟲的天敵也不會產(chǎn)生較大的影響[10]。此外，印楝素在環(huán)境中能迅速而徹底地降解、抗性風(fēng)險低[11]，被認(rèn)為是完美的植物源殺蟲劑[12-13]。印楝中已發(fā)現(xiàn)了100多種化合物，至少有 70 種化合物具有生物活性。印楝素可分為印楝素A、B、C、D、E、F、G、I共8種，其中印楝素A含量最高，其也是通常意義上的印楝素[14]。印楝植株中印楝素A和印楝素B的含量在所有印楝素類化合物中占比最高。這些活性物質(zhì)對菜青蟲Pierisrapae、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella等多種農(nóng)業(yè)害蟲都有很好的殺蟲活性[15-17]。

斜紋夜蛾Spodopteralitura屬鱗翅目夜蛾科，全國各地均有分布[18]，寄主廣泛，可危害蔬菜、糧食、經(jīng)濟(jì)作物等近100科、300多種植物，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[19]。大菜粉蝶Pierisbrassicae屬鱗翅目粉蝶科，是十字花科蔬菜上的主要害蟲之一，以幼蟲聚集為害葉片[20]。目前，防治斜紋夜蛾、大菜粉蝶多用化學(xué)藥劑，植物源農(nóng)藥防治較為少見。本研究采用乙酸乙酯浸取法提取印楝素種子中的印楝素制備印楝素干粉，并將其與印楝素A及印楝素B的活性進(jìn)行比較，以期為防治斜紋夜蛾、大菜粉蝶提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

印楝種子由四川綠金生物科技有限公司提供，印楝素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.37%；印楝素A標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%)：美國Sigma公司生產(chǎn)；印楝素B(質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理研究室從印楝種子中分離純化并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

從廣東省廣州市郊的芋頭Cococasiaesculenta、芥藍(lán)Brassicaalboglabra或花椰菜Brassicaoleraceavar.botrytis上采集斜紋夜蛾卵塊，低齡蟲以芋頭葉飼養(yǎng)，高齡蟲以木薯葉飼養(yǎng)。于云南省昆明市郊采集大菜粉蝶卵，卵孵化后，幼蟲在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理研究室內(nèi)用芥藍(lán)和甘藍(lán)Brassicaoleracea葉飼養(yǎng)。

美國惠普1100高效液相色譜儀，具可調(diào)波長的紫外檢測器，3D化學(xué)工作站；HHS·11-Ni型恒溫水浴鍋：北京靖衛(wèi)科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；4001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司生產(chǎn)；LI-3000葉面積測定儀：美國Lincoin公司制造；1702-MP8型電子天平：德國Startorius Gmbh Gottingen公司生產(chǎn)；循環(huán)水真空泵SHB-Ⅲ；布氏漏斗等。

乙酸乙酯、石油醚Ⅰ(30～60 ℃)、石油醚Ⅱ(60～90 ℃)均為分析純(天津富宇精細(xì)化工有限公司)，乙腈為色譜純(美國MREDA)，超純水，電阻≥18.2 ΜΩ等。

1.2 方法

1.2.1 印楝素干粉提取 在烘箱中于40 ℃條件下烘烤印楝種子3 h后，將其在室溫條件下磨碎，加入石油醚Ⅰ進(jìn)行脫脂處理，用大濾紙濾除部分石油醚，再用布氏漏斗濾除濾渣中殘余的石油醚。將晾干的濾渣常溫減壓干燥后粉碎，制得印楝種子粉。在60 ℃水浴條件下，用乙酯乙酯浸提印楝種子粉，重復(fù)3次，每次5 h，濾除殘渣，合并濾出液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60 ℃條件下減壓蒸除乙酸乙酯得到乙酸乙酯抽提物。在抽提物中加入少量乙酸乙酯，振蕩搖勻后，于室溫條件下滴加到石油醚中，邊加邊振蕩，將沉淀過濾，用石油醚洗滌3次，減壓干燥制得印楝素干粉。

1.2.2 印楝素含量測定 稱取印楝素標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，甲醇溶解并定容。再次使用甲醇稀釋配成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對峰面積繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動相為不同比例的乙腈和水進(jìn)行梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，流動相比例及處理時間為：V(乙腈)∶V(水)=40∶60，0～3 min，V(乙腈)∶V(水)=30∶70，3～9 min，V(乙腈)∶V(水)=100∶0，9～13 min，V(乙腈)∶V(水)=40∶60，13～20 min。柱溫：30 ℃；檢測波長：215 nm；進(jìn)樣量：10 μL。準(zhǔn)確稱取1.0 g制備好的印楝素干粉于15 mL離心管中，加入10 mL甲醇,渦旋2 min，離心，過0.22 μm濾膜，待HPLC測定，外標(biāo)法計算含量。

1.2.3 拒食活性測定 選取厚薄均勻的甘藍(lán)葉片，用打孔器打出葉碟(d=19 mm)，葉碟在供試藥液中浸3 s后取出,自然晾干后，將葉碟置于墊有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿3片葉，接入1頭蟲,每個處理10個重復(fù)。24 h后調(diào)查并按公式計算拒食率。

1.2.4 體質(zhì)量測定 將印楝素干粉、印楝素A和印楝素B，用V(丙酮)∶V(水)=1∶1的溶液配至供試濃度。將剛采集的甘藍(lán)葉片洗凈晾干。將供試葉片在藥液中浸泡3 s后取出，晾干后放入墊有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在每個培養(yǎng)皿中放入1頭幼蟲，每個處理10個重復(fù)，處理質(zhì)量濃度為0.5 μg·mL-1。幼蟲放入培養(yǎng)皿前在電子天平上稱質(zhì)量。每隔1 d換上新的濾紙及新鮮的未處理供試葉片，每天在電子天平上稱供試?yán)ハx的體質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 印楝素HPLC檢測結(jié)果

乙酸乙酯浸提印楝種子粉，乙酸乙酯減壓蒸除后，用石油醚從濃縮液中制備印楝素干粉。圖1a中印楝素A標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為9.463 min。印楝素干粉色譜圖如圖1b所示。

圖1 印楝素HPLC圖譜Fig.1 HPLC graph of azadirachtin

2.2 印楝素干粉中印楝素含量測定

乙酸乙酯浸提法制備得到印楝素干粉，干粉中印楝素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以印楝素A計)和提取率分別為7.920%和81.047%。濾出沉淀后，在室內(nèi)敞開體系中讓溶劑自然揮發(fā)，沉淀不黏結(jié)；減壓干燥后，呈外觀良好的淺黃色粉狀物。試驗結(jié)果表明該方法能有效提取印楝素。

2.3 拒食活性測定結(jié)果

分別以斜紋夜蛾2齡幼蟲、大菜粉蝶3齡幼蟲為對象，測定印楝素A、印楝素B和印楝素干粉的非選擇性拒食活性，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，印楝素干粉、印楝素A和印楝素B均對斜紋夜蛾2齡幼蟲具有較好的拒食活性，處理24 h后，AFC50分別為0.28、1.04和2.93 μg·mL-1；AFC5095%置信限分別為0.24～0.33、0.71～1.51和2.07～4.16 μg·mL-1。處理24 h后，印楝素干粉、印楝素A和印楝素B對大菜粉蝶3齡幼蟲的AFC50分別為70.71、182.34和225.44 μg·mL-1；AFC5095%置信限分別為57.61～86.78、118.54～280.47和135.09～376.20 μg·mL-1。結(jié)果表明，印楝素干粉對斜紋夜蛾和大菜粉蝶的拒食活性明顯高于印楝素A和印楝素B。印楝素干粉、印楝素A和印楝素B對大菜粉蝶3齡幼蟲具有一定的拒食活性。

2.4 印楝素對斜紋夜蛾幼蟲體質(zhì)量的影響

以斜紋夜蛾4齡幼蟲為對象，采用浸藥葉片處理，測定印楝素干粉、印楝素A和印楝素B對斜紋夜蛾4齡幼蟲體質(zhì)量的影響，結(jié)果見表2。從表2中可以看出，印楝素干粉、印楝素A和印楝素B對斜紋夜蛾幼蟲的體質(zhì)量具有非常顯著的抑制作用。在試驗濃度下處理2～5 d，印楝素干粉和印楝素B對斜紋夜蛾幼蟲的體質(zhì)量影響明顯高于印楝素A，差異顯著。在相同濃度下處理1～5 d，印楝素干粉對斜紋夜蛾幼蟲生長發(fā)育的影響明顯高于印楝素B，且在藥后1、3、4 d時差異顯著。

表1 印楝素A、印楝素B及印楝素干粉對斜紋夜蛾和大菜粉蝶拒食活性測定結(jié)果1)

Tab.1 The antifeedant activities of azadirachtin A, azadirachtin B and azadirachtin-rich dry powder againstSpodopteralituraandPierisbrassicae

處理斜紋夜蛾2齡幼蟲大菜粉蝶3齡幼蟲毒力回歸方程2)AFC50(95%置信限)/(μg·mL-1)相關(guān)系數(shù)(r)毒力回歸方程2)AFC50(95%置信限)/(μg·mL-1)相關(guān)系數(shù)(r)印楝素Ay=4.9601+2.5597x1.04(0.71～1.51)0.9899y=0.0408+2.1935x182.34(118.54～280.47)0.9769印楝素By=3.8222+2.5197x2.93(2.07～4.16)0.9763y=1.0708+1.6699x225.44(135.09～376.20)0.9458印楝素干粉y=5.8974+1.6301x0.28(0.24～0.33)0.9885y=2.3874+1.4126x70.71(57.61～86.78)0.9984

1)印楝素干粉中有效成分的含量以印楝素A計，干粉中印楝素A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.920%， 處理時間為24 h； 2)y為死亡率，x為樣品質(zhì)量濃度對數(shù)值。

表2 施用印楝素干粉、印楝素A和印楝素B對斜紋夜蛾幼蟲體質(zhì)量的影響1)

Tab.2 The effects of azadirachtin-rich dry powder, azadirachtin A and azadirachtin B on larvae weight of Spodoptera lituram/g

1)干粉中有效成分含量以印楝素A計，干粉中印楝素A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.920%，處理時間為72 h；同列數(shù)據(jù)后凡具有一個相同字母者，表示在5%水平上差異不顯著(DMRT)。

3 結(jié)論

w為0.3%的印楝素乳油是目前市面唯一基于印楝素干粉的制劑，然而乳油制劑中成分比重大的有機(jī)溶劑，如苯、甲苯、二甲苯、甲醇等，不僅對環(huán)境有害，還會對人類健康造成嚴(yán)重威脅[21]。需要制備含量及活性更高的印楝素干粉，使制備新的印楝素制劑，如微乳液和懸浮濃縮物等成為可能。本文使用乙酸乙酯浸提法制備了印楝素干粉。該提取方法不僅簡單有效，制備得到的印楝素干粉對斜紋夜蛾及大菜粉蝶的活性更是優(yōu)于印楝素A及印楝素B。印楝素干粉是植物直接提取物，其化學(xué)成分比印楝素A及印楝素B更為復(fù)雜，不僅包含其他多種的印楝同系物，還可能具有其他活性物質(zhì)，因而生物活性更高。

本研究建立了印楝素干粉的HPLC檢測方法，能快速高效地測定印楝素干粉中印楝素A的含量，分離效果好，對檢測印楝素A及印楝素干粉具有一定的參考意義。

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【責(zé)任編輯 霍 歡】

Preparation and bioactivity determination of azadirachtin-rich dry powder

LI Yiming1， CHEN Xiaotian1， WANG Yongqing1， CHENG Dongmei2， ZHANG Zhixiang1

(1 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology/College of Agriculture, South China Agricultural University, Ministry of Education, Guangzhou 510642, China； 2 College of Agriculture, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)

【Objective】 To study the biological activity of azadirachtin-rich dry powder, azadirachtin A and azadirachtin B, and establish a method for determinating azadirachtin content of dry powder.【Method】 Azadirachtin-rich dry powder was prepared by ethyl acetate extraction method, the azadirachtin content of dry powder was determined by HPLC and the biological activity was measured by leaf disc test. 【Result】AFC50of zadirachtin-rich dry powder was 0.28 μg·mL-1against 2nd instar larvae ofSpodopteralituraand 70.71 μg·mL-1against the 3rd instar larvae ofPierisbrassicae24 h after treatment. The antifeedant activity of azadirachtin-rich dry powder was clearly higher than that of azadirachtin A and azadirachtin B. 【Conclusion】 This preparation method of the dry powder is simple, effective, and has good biological activity. It is recommended for popularization and application.

azadirachtin-rich dry powder;Spodopteralitura;Pierisbrassicae; ethyl acetate extraction method; leaf disc test; HPLC； bioacitivity

2017- 03- 14 優(yōu)先出版時間：2017- 06-21

李一鳴(1991—)，女，碩士研究生，E-mail: xysgliyiming@163.com; 通信作者：張志祥(1974—),男，教授，博士，E-mail: zdsys@scau.edu.cn

廣東省自然科學(xué)基金(2016A030313387)

S482

A

1001- 411X(2017)04- 0048- 004

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1924.016.html

李一鳴， 陳孝甜， 王勇慶， 等.印楝素干粉的制備及生物活性測定[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017,38(4):48- 51.